Abstract
inflammatorisk tarmsykdom (IBD) er en lidelse av kronisk betennelse med økt mottakelighet for tykktarmskreft. Årsakene til IBD er uklart, men antas å skyldes en feilregulert adaptive og medfødte immunrespons mot mikrobiell produkter i en genetisk mottakelige vert. Toll-like receptor (TLR) signale indusert av tarm commensal bakterier spiller en avgjørende rolle i å opprettholde intestinal homeostase, medfødt immunitet og forbedring av intestinal epitelceller (IEC) integritet. Imidlertid har rollen TLR2 i utviklingen av tykktarmskreft ikke undersøkt. Vi utnyttet AOM-DSS modell for kolitt-assosiert kolorektal kreft (CAC) i villtype (WT) og TLR2
– /- mus. Kolon høstet fra WT og TLR2
– /- mus ble benyttet for histopatologi, immunhistokjemi, immunfluorescens og cytokin analyse. Mus mangelfull i TLR2 utviklet seg betydelig flere og større kolorektal tumorer enn sine WT kontroller. Vi gir bevis for at kolonepitelet av TLR2
– /- mus har endret immunresponser og feilregulert spredning under konstante forhold og under kolitt, noe som fører til betennelsesvekstsignaler og predisposisjon for akselerert neoplastisk vekst. På de tidligste tidspunktene vurderes, TLR2
– /- kolon viste en betydelig økning i avvikende krypten foci (ACF), noe som resulterer i svulster som utviklet tidligere og ble større. I tillegg er den intestinale mikromiljøet viste vesentlig høyere nivåer av IL-6 og IL-17A samtidig med øket fosfo-STAT3 innenfor ACF. Disse observasjonene tyder på at i kolitt, spiller TLR2 en beskyttende rolle mot utvikling av CAC
Citation. Lowe EL, Crother TR, Rabizadeh S, Hu B, Wang H, Chen S, et al. (2010) Toll-like receptor 2 Signa Beskytter Mus fra tumor utvikling i en musemodell for kolitt-indusert kreft. PLoS ONE 5 (9): e13027. doi: 10,1371 /journal.pone.0013027
Redaktør: Kathleen A. Kelly, University of California Los Angeles, USA
mottatt: 28 juni 2010; Godkjent: 30 august 2010; Publisert: 27.09.2010
Copyright: © 2010 Lowe et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (AI-058128 supplement til MA) og Donna og Jesse Garber legat (til KSM og MA). I tillegg K.S.M. støttes av Crohns og Foundation of America kolitt. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kronisk betennelse og kreft er sammenvevd, spesielt i tarmen, som det fremgår av inflammatorisk tarmsykdom (IBD). IBD antas å skyldes et sammenbrudd i epiteliale barriere, etterfulgt av upassende responser til mikrobiell produkter som fører til kronisk betennelse i en genetisk mottakelige vert [1]. IBD er forbundet med en økt risiko for kolorektal kreft, og det er nå vanlig å tro at den kroniske inflammasjon hos disse pasientene fører til neoplastisk transformasjon av tarmepitelet [2]. Riktig intestinal immunitet er avhengig av en balanse mellom immunsuppresjon og hensiktsmessig tidsbestemte proinflammatoriske responser med beskyttende inflammatoriske responser. Proinflammatoriske cytokiner og kjemokiner som er produsert i løpet av kronisk intestinal inflammasjon som svar på kommensale bakterier skape et mikromiljø som forbedrer celleproliferasjon, celleoverlevelse, og angiogenese, og dermed fremme tumorigenesis [3].
intestinale epitelceller (IEC) handle som første forsvarslinje ved å skape en barriere mot mikrober. Den medfødte immun reseptorer som tilhører familien av Toll-lignende reseptorer (TLR) ytterligere bidra til IEC å skille venn fra fiende blant komplisert miljø av mikrober. Det er en økende mengde bevis som støtter en viktig rolle for TLR signalisering i opprettholdelsen av intestinal homeostase [4], [5], [6], [7], [8], [9]. Mus ablasjon av TLR2, TLR4, TLR9, eller deres felles adapter molekyl MyD88, var mer akutt utsatt for kolitt indusert av den kjemiske colitogen dekstran natriumsulfat (DSS), delvis på grunn av svekket beskyttelses svar og redusert produksjon prostaglandin [7], [ ,,,0],8], [9], [10], [11]. Antibiotikabehandling forverret DSS-indusert kolitt hos MyD88
– /- mus og forhindret epithelial reparasjon, noe som indikerer generell TLR signalisering er nødvendig for riktig IEC fornyelse. Faktisk behandling med TLR2 [8] og TLR9 [12] ligander under DSS administrasjon bedres krypten skade og sped healing. TLR2-kommensal signale bevarer transepitelial motstand, fremmer slimcelleslimstoff sekresjon, og opprettholder homeostase i IEC [8], [13], [14], [15]. Til slutt, på grunn av dens tendenser til skew mot TH2-responser [16], [17], [18], [19] og forbedre regulatoriske T-celle overlevelse [20], [21], [22], TLR2 signalisering kan spille en viktig rolle i å opprettholde et undertrykkende miljø i tykktarmen.
Ulike studier har innblandet TLR signalering i tarm tumorigenesis. I flere tarm neoplasi (Min) mus, tap av MyD88 signale redusert kreft tall og størrelser som tyder på at MyD88 signale bidrar til tumorvekst og progresjon [23]. I en annen modell, ble svulst forekomst, mangfold og størrelse redusert etter azoxymethane (AOM) og DSS behandling når TLR4 ble ablated i mus via reduksjon av TLR4 uttrykk og signalering i IEC [24], [25]. I tillegg er den kolitt og kolitt-assosiert kolorektale tumorer (CAC) spontant generert på IL10
– /- mus kan bedres dersom mus holdes i bakterie-frie betingelser [26] eller samtidig ablasjon av TLR4 [27]. Samlet utgjør disse studier støtter at CAC utvikling avhenger av tarm TLR anerkjennelse av commensal bakterier. Til tross for de åpenbare roller TLR2 i IEC homeostase og forbedring av toleranse i lamina propria mikro [28], [29], ingen studier har belyst rollen som TLR2 kan spille i omformingen av intestinale epitelceller som fører til tarmsvulster.
Her viser vi at TLR2-mangelfull mus utvikler flere og større colonic svulster enn WT kontroll mus etter AOM-DSS behandling. Forbedret colonic svulst utvikling er dokumentert tidlig av betydelig økt antall avvikende krypten foci (ACF) og økt IL-6, IL-17A, TNFa og phosphoSTAT3 uttrykk i tarmmikromiljøet av TLR2
– /- mus sammenlignet med WT mus. Våre resultater viser at TLR2 er en viktig beskyttende faktor i intestinal epitel homeostase og gir viktig innsikt i et tidligere ukjent rolle TLR2 signalering i CAC.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle forsøkene ble utført i henhold til retningslinjene og godkjente protokoller (IACUC # 2838) av Cedars-Sinai Medical Center Institutional Animal Care og bruk komité og ble plassert under bestemte patogen frie forhold.
Dyr
Helicobacter-negative villtype C57BL /6J og TLR2
– /-. (på C57BL /6J bakgrunn) mus ble oppnådd fra Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)
Induksjon av tumorer (figur 1A)
kolitt-assosiert kolorektal kreft (CAC) ble indusert som tidligere beskrevet [30]. Kort sagt ble 6-8 uker gamle mus injisert intraperitonealt (IP) med 12,5 mg /kg azoxymethane (AOM; Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO). Etter 5 dager, mus mottok 2,5% dekstransulfat natrium (DSS, MP Biomedicals, Solon, OH, molekylvekt 35,000-50,000 kDa) vann i 5 dager etterfulgt av 16 dager med vanlig drikkevann. Mus ble utsatt for to DSS sykluser, etterfulgt av en tredje syklus med 2% DSS vann tilført i 4 dager, etterfulgt av vanlig vann i 10 dager. På dag 61 post-injeksjon AOM-mus ble injisert IP med 100 mg /kg 5-brom-2-deoksyuridin (BrdU; Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO) og avlivet 2,5 timer senere. Å observere de tidligste transformative trinnene i CAC, ble musene avlivet 4 dager etter avslutningen av den første DSS syklus (14 dager etter AOM). Det kliniske forløpet av sykdommen ble overvåket ved måling av kroppsvekt, observasjon av rektal blødning, diaré, og blodig avføring under DSS behandling.
(A) Skjematisk oversikt over CAC modell. Etter innledende AOM injeksjon (12,5 mg /kg), ble DSS gitt i drikkevannet (eske områder) etterfulgt av vanlig drikkevann. Mus ble ofret på dag 14 eller 61 innlegg AOM injeksjon (Dag 61: n = 19 WT, n = 21 TLR2
– /- mus). (B) Prosent vektendring under AOM-DSS behandling. (C) Mouse dødelighet under AOM-DSS behandlinger. (D) Antall kolorektal tumorer per musen indusert av AOM-DSS behandling på dag 61. (E) Antall tumorer per musen ligger i proksimale eller distale kolon i WT eller TLR2
– /- mus. (F) Størrelse fordeling av kolorektal tumorer dannet i WT eller TLR2
– /- mus. (G) Tumor byrde i AOM-DSS behandlet WT eller TLR2
– /- mus. Alle tester ble utført ved anvendelse av 95% konfidensintervaller. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. * = P 0,05, ** = p 0,01, *** = p. 0,001
Histologisk analyse for kolitt og dysplasi
Hele kolon ble spylt med PBS og blits -frozen i swiss roll orientering. 7-um seksjonene ble oppsamlet gjennom hele dybden av tykktarmen ved hjelp av en cryostat og farget for hematoksylin og eosin (H E: Sigma-Aldrich). Histopatologiske forandringer i kolitt og betennelse ble scoret av en patolog (HW) blindet for genotypene ved hjelp av følgende poengsystemer. Data er presentert i resultatdelen som «generell betennelse stillingen», som representerer summen av verdiene som er gitt for «inflammasjon», «omfanget og alvorligheten av leukocytt-infiltrering» og «prosent involvering av kolon». Definisjonen og scoring for disse subcriterias er som følger:
Betennelse ble definert og scoret som
: (0) Ingen normale lymfoide aggregater; (1) Økt lymfoide aggregater; (2) kryptitt (nøytrofiler i løpet av krypten epitel); (3) Crypt abscess (nøytrofile akkumulere innen krypten lumen, noen ganger med krypten ruptur); (4) Sår (tap av slimhinne komponenter og tilstedeværelse av granulasjonsvev).
Omfang av leukocyttinfiltrasjon ble scoret som
: (0) Ingen; (1) infiltrering begrenset på mukosa; (2) infiltrering som strekker seg til submukosa; (3) transmuralt forlengelse av inflitration.
Alvorlighetsgrad av leukocyttinfiltrasjon ble scoret basert på antall infiltrerende celler som
: (1) Mild; (2) Moderat; (3) Alvorlig.
Prosent Involvering av tykktarmen ble scoret som
: (0,25) hvis 1-25% av tykktarmen var involvert; (0,50) hvis 26-50% av tykktarmen var involvert; (0,75) hvis 51-75% av tykktarmen var involvert; (1,00) hvis 76-100% av tykktarmen var involvert. Separat, har vi også et innlegg av «
utstrekning nekrose
« i tykktarmen som følger: (1) = 25%, (2) = 50%, (3) = 75%, (4) = 100% . Svulster ble identifisert og scoret også for alvorlighetsgrad (adenom eller karsinom
in situ
). Tumorbelastning i mus ble bestemt av summen av de områdene av alle svulster per mus
BrdU og TUNEL Farging
Alle svulster observert av H . E ble bekreftet etter BrdU flekker ved hjelp BrdU
In-situ
Detection Kit (BD Pharmingen, San Diego, California) i henhold til fabrikantens foreslåtte protokoll. Apoptose ble påvist ved hjelp av
In Situ
celledød Detection Fluorescein Kit (Roche, Indianapolis, IN), kontra med DAPI (Invitrogen, Carlsbad, California) og kvantifisert ved fluorescens intensitet per fokus feltet med ImagePro Plus (Media Cybernetics , Silver Spring, MD). Nære og fjerne regioner i tykktarmen ble undersøkt ved hjelp av mer enn tre fokusfelt per region i minst fire lysbilder per dyr.
immunfluorescens
Frysesnitt ble fiksert i 10% formalin. Presentasjoner farget for nukleære antigener ble ytterligere fiksert i 100% metanol. Anti-fosfo-Stat3 og anti-P-catenin (begge fra Cell Signaling Technology, Danvers, MA) antistoffer ble inkubert i 48 timer ved 4 ° C, etterfulgt av inkubering med geite-anti-kanin-568 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Biotinylert anti-nitrotyrosine (Cayman, Ann Arbor, MI) ble inkubert over natten ved 4 ° C, etterfulgt av inkubering med streptavidin-594 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Alle lysbildene ble kontra med DAPI (Invitrogen, Carlsbad, California). Positive celler ble talt i mer enn fem satsingsfelt i minst fire lysbilder per dyr og atom fosfor-Stat3 intensitet ble målt ved hjelp av ImagePro Plus.
Isolering og behandling av lamina propria mononukleære celler (LPMC) og mesenteriske lymfeknute celler (MLN)
For å få LP-celler, hele kolon ble grundig spylt med iskald PBS. Ett-mm stykker av kolon ble inkubert i HBSS supplementert med 1 mM DTT, 3 mM EDTA, 20 mM HEPES med risting ved 37 ° C i 20 min. Colon stykker ble vasket med HBSS fulgt av inkubering i dissosiasjon buffer (0,075 U /ml Blendzyme 3, 1,5 U /ml Dispase II, 0,5 mg /ml DNase I [alle Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland], 20 mM HEPES, 1,3 mM kalsium klorid) med risting ved 37 ° C i 50 min. Det fordøyde kolon ble vortex-blandet forsiktig og ytterligere dissosiert med økende spor nåler, føres gjennom en 40 um celle sil og vasket med PBS. Etter sentrifugering cellepelleten ble resuspendert i en 45% Percoll-løsning og lagt over en 72% Percoll-løsning. Celler lokalisert ved grenseflaten ble oppsamlet i et rent rør og vasket flere ganger. MLN ble knust mellom glass og vasket med PBS. Cellesuspensjonen ble passert gjennom en 40 um celle sil og vasket med RPMI. Isolerte lymfocytter ble resuspendert i 10% FBS-høy glukose RPMI supplert med L-glutamin (Cellgro; Mediatech Inc., Herndon, VA) og 1% antibiotisk /antimykotisk (Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO), og stimulert med 1 ug /ml anti-CD3 (eBioscience, San Diego, CA) og 1 ug /ml anti-CD28 (eBioscience) i 72 timer eller med en ug /ml LPS (InvivoGen, San Diego, CA) i 6 timer. Supernatanter ble samlet inn og lagret ved -80 ° C.
Utarbeidelse av Colon homogenates
Kolon ble spylt grundig med iskald PBS. Kolon ble deretter flash-frosset i flytende nitrogen. Vasket og sterilisert zirkoniumoksid kuler (0.5 mm diameter, Neste Advance, Cambridge, MA) ble tilsatt i et volum lik den til vevet. Colon vev ble deretter kort mekanisk homogenisert ved hjelp av Bullet Blender (Neste Advance, Cambridge, MA) ved 4 ° C. En isotonisk lyseringsbuffer (1 mM EDTA, 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,9, 250 mM NaCl, 20 mM P-glycerofosfat, 1 mM aktivert ortovanadat, 1% NP-40, 1 mM DTT) ble deretter tilsatt til vevet og perler i et volum som tilsvarer antall vevet. Dette ble homogeniseres etterfulgt av rotasjon ved 4 ° C i 20 min. Homogenis vev ble sentrifugert i 20 min ved 4 ° C og 16 100
g Hotell og supernatanter ble lagret ved -80 ° C.
ELISA
supernatanter, kolon homogenates eller serum var analysert for tilstedeværelse av TNFa, IL-4, IFNg, IL-17A IL-23p19 (alle eBioscience, San Diego, CA), IL-10, IL-6, TGFß, MIP-2 (alle R 0,05, ** = p 0,01, *** = p. 0,001
Resultater
TLR2-mangel fører til økt utbygging av kolitt-assosiert tykktarmskreft
Tidligere studier har vist at TLR signalisering og den felles adaptermolekylet MyD88 er kritisk involvert i intestinal epitelcelle-homeostase og utvikling av tarmsvulster [9], [10], [23], [24], men rollen TLR2 har ikke blitt grundig undersøkt. For å undersøke rollen til TLR2 under kolitt-assosiert tumorigenesis vi brukte en veletablert modell for CAC [4], [24], [30], [31], [32]. WT og TLR2
– /- mus mottok en enkelt injeksjon av AOM etterfulgt av administrering av tre sykluser med DSS (figur 1A). TLR2
– /- mus hadde økt sykelighet som gjenspeiles av økt vekttap i løpet av behandlingen (figur 1B) og mer rektal blødning under DSS behandling sammenlignet med WT mus (data ikke vist). Vi har også funnet økt dødelighet i TLR2 – /- mus sammenlignet med villtype mus (4,6% for WT og 25% for TLR2
– /- mus, henholdsvis p 0,05), med flest dødsfall inntreffer kort tid etter den første løpet av DSS (fig 1C). Deretter undersøkte vi effekten av TLR2-mangel på kolitt-assosiert tumor utvikling. TLR2
– /- mus hadde en stor tumormengde enn WT mus. Histolopathological undersøkelse viste en signifikant økning i antallet tumorer i TLR2
– /- sammenlignet med WT-mus (figur 1D). Den gjennomsnittlige svulst antall per mus ble nesten doblet i TLR2-manglende mus sammenlignet med WT mus (6,1 vs. 3,5, p 0,05). Fordi tarm TLR2 er sterkere uttrykt i proksimale colon [33], hypotese vi at mus som mangler TLR2 ville utvikle mer CAC proksimalt. Faktisk, er forskjellen i tumorutvikling i TLR2
– /- sammenlignet med WT-mus var mest fremtredende i den proksimale kolon (figur 1E). I tillegg til økningen i tumor multiplisitet, TLR2-mangel har også ført til betydelig høyere antall større tumorer (mer enn 1 mm
2) (s 0,05) (figur 1F) og tumormengde (nesten dobbelt) i TLR2
– /- mus sammenlignet med WT mus (p 0,05) (figur 1G). Disse resultatene indikerer at TLR2-mangel ikke bare forbedrer tumorvekst, men også øker tumorprogresjon.
TLR2-mangel kolon har mer avansert dysplasi og ß-catenin uttrykk i forhold til WT kolon
ß-catenin signalisering spiller en viktig rolle i human tarm karsinogenese [34] og mutasjoner er blitt rapportert i AOM-induserte muse-tumorer i kolon [30], [31], [35]. Faktisk sterkt positiv cytoplasmisk eller kjerne P-catenin farging ble observert i vev transformert i WT og TLR2
– /- mus (figur 2B). WT kolorektale adenomer (figur 2A, B, venstre 2 paneler) vises klassiske rørformede strukturer med forvrengte kjertler og moderat organisasjon. Men TLR2
– /- colorectal svulster (figur 2A, B, høyre to paneler) vises mer forvrengte kjertler med regionene økt uorden og cribriform strukturer som indikerer en høyere klasse dysplasi (dvs. kreft
in situ)
. Faktisk histologisk analyse viste nesten dobbelt forekomsten av avansert kreft
in situ plakater (0,3 vs 0,6 bety carcinoma in situ per mus) i TLR2
– /- mus sammenlignet med WT, som trend mot betydningen (p 0,055) (figur S1)
Histopatologi av kolon på dag 61 av AOM-DSS behandling.. (A) Hematoxylin og eosin (H 0,001) (figur 3A). Kolon fra TLR2
– /- mus inneholdt moderat til alvorlig betennelse som utvidet transmurally mens betennelse i WT kolon utvidet til lignende dybder, men vises bare mild til moderat infiltrasjon av leukocytter (figur 3D). Den økte betennelsen finnes på dette tidspunkt (dag 14) i TLR2 – /- mus også korrelert med mer alvorlig vekttap og øket dødelighet i løpet av den første løpet av DSS i vår langtidsstudie (fig 1B-C). WT mus ytterligere led mer omfattende sårdannelse og nekrose enn TLR2
– /- mus (grad av nekrose i colon 2,5 vs 1,3, p 0,01) (figur 3B, D). I stedet TLR2
– /- mus viste tegn til regenerering med mucin uttømming, forstørret og hyperchromatic kjerner, og øket kjerne til cytoplasma-forhold, alt som indikerer avvikende krypten foci (ACF), som er kjent for å være pre-neoplastisk [36 ] (Figur 3D, høyre panel). Videre observerte vi lignende spredning, men redusert apoptose i TLR2
– /- ACF sammenlignet med WT ACF (figur 3E, F), som kan bidra til overlevelse av transformerte celler. Faktisk, kvantitativ analyse av ACF viste en signifikant økning i ACF i TLR2
– /- mus sammenlignet med WT mus i proksimal (p 0,001). Samt distal kolon (p 0,01) (figur 3C)
Scoring av betennelse, nekrose og ACF på dag 14 av AOM-DSS behandling (n = 5 WT og n = 5 TLR2
– /-). (A) Betennelses score av kolon. (B) Omfang av colonic nekrose. (C) Antall ACF per mus plassert i proksimale eller distale kolon. (D) H E flekker av seriesnitt av kolon. Original forstørrelse 40x (øvre panel) eller 100x (nedre panel). (E) Immunohistokjemiske flekker for BrdU. Original forstørrelse 100x. (F) Immunofluorescent TUNEL-farging. Original forstørrelse 100x. Alle tester ble utført ved anvendelse av 95% konfidensintervaller. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. * = P 0,05, ** = p 0,01, *** = p. 0,001
TLR2-mangel har økt celleproliferasjon og redusert apoptose under tidlig CAC utvikling
tidligere studier har vist at gjenkjennelse av kommensale bakterier via TLR’ene er nødvendig for intestinal epithelial homeostase, som er kontrollert av balansen av proliferasjon og apoptose i kryptene [10]. For å kunne sammenligne intestinal homeostase mellom TLR2
– /- mus og WT mus, undersøkte vi epitelcelleproliferasjon av BrdU-inkorporering og apoptose ved TUNEL-farging av DNA-fragmentering i kryptene i kolon. Interessant, før AOM-DSS vi observert betydelig redusert antall av BrdU
+ celler (figur 4A) med betydelig økt antall TUNEL
+ celler (figur 4B) pr krypt i den proksimale og distale kolon av TLR2
– /- mus sammenlignet med WT mus. I kontrast, etter en runde med DSS behandling (dag 14), TLR2
– /- colonic krypter vises økt BrdU
+ celler (p 0,001) (figur 4A, C) og redusert tunel
+ celler (p 0,001) (figur 4B, D) sammenlignet med WT mus, noe som indikerer dysregulerte epitel homeostase i TLR2
– /- kolon under betennelsestilstander. Videre, selv om BrdU
+ celler ble hovedsakelig lokalisert til stamcelle sonen av WT krypter, prolifererende celler ble funnet utvidet inn i de midtre områdene av TLR2
– /- krypter, hvori epitelceller normalt er differensiert og ikke-formerende (figur 4C). Derfor, som mucosal integritet ble svekket i kolon mangelfulle av TLR2, ble evnen til IEC å følge egnede overlevelse og død signaler svekket, noe som resulterer i stedet i dysregulert celleoverlevelse. For å bekrefte at tidlig intestinal tumorigenesis i TLR2
– /- mus er avhengig av DSS-indusert betennelser vi undersøkt WT og TLR2
– /- mus 14 dager etter en enkelt injeksjon av AOM (ingen DSS behandling) som kontroller. Vi har ikke observere noen merkbar ACF eller økt betennelse i WT eller TLR2-manglende kolon i disse kontrollforsøk (figur S2) antyder viktigheten av inflammasjon for utviklingen av svulster i sammenheng med TLR2-mangel.
Assessment av proliferasjon av BrdU-farging og apoptose ved TUNEL-farging ved proksimale og distale kolon fra mus som enten ble behandlet i 14 dager med AOM-DSS diett (dag 14) eller ubehandlede mus (dag 0) (n = 5), BrdU
+ (A) og TUNEL
+ (B) celler ble tellet i intakte og godt orientert krypter. BrdU
+ celler ble kvantifisert fra minst 20 krypter per region fra 4 forskjellige lysbilder per dyr. (C) Dag 14 representative immunhistokjemiske flekker for BrdU i colonic seksjoner. Original forstørrelse 100x. (D) Dag 14 representative Immunofluorescent flekker for tunel flekker i colonic seksjoner. Original forstørrelse 100x. Alle tester ble utført ved anvendelse av 95% konfidensintervaller. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. . * = P 0,05, ** = p 0,01, *** = p 0,001
TLR2
– /- mus har økt IL-6 og STAT3 aktivering tidlig i tarm tumorigenesis
i tillegg til økt celleproliferasjon og inflammasjon, vi har funnet betydelig økt serumnivå av IL-6 i TLR2
– /- mus ved tidlige stadier av tumordannelse etter første AOM-DSS behandling (dag 14) sammen til WT mus (p 0,05) (figur 5A). Viktigere, fremmer IL-6 tumorprogresjon i inflammasjonsassosierte tumormodeller gjennom aktivering av STAT3 [37], [38]. Vi observerte ikke noen signifikante forskjeller i serumkonsentrasjonen av andre proinflammatoriske cytokiner eller chemokiner (IL-12p40, IL-1beta, MCP-1, KC, og MIP-2) mellom WT og TLR2
– /- mus ved dag 14 av AOM-DSS behandling (data ikke vist). Vi har oppdaget også økt IL-6 produksjon i hele kolon homogenates fra TLR2
– /- mus på dag 14 av AOM-DSS behandling i forhold til WT mus (p 0,01) (figur 5B). Lamina propria mononukleære celler (LPMC) isolert fra TLR2
– /- mus behandlet med LPS også produsert mer IL-6 enn WT LPMC (p 0,05) (figur 5C). I overensstemmelse med økningen i IL-6-produksjon i TLR2
– /- mus ved tidlige stadier av tumorgenese, observerte vi betydelig økt atom akkumulering av fosforylert (aktivert) STAT3 (pSTAT3) i TLR2
– /- epitel sammenlignet WT kolon (figur 5E). Kvantifisering av intensiteten av atom pSTAT3 i ACF avdekket en 8 ganger økning i pSTAT3 uttrykk i TLR2
– /- ACF forhold til WT ACF på dag 14 (p 0,05) (figur 5F). I tillegg, mens kjerne pSTAT3 uttrykk innenfor TLR2
– /- ACF ble begrenset til intakte krypten epitelceller (figur 5E, panel høyre), kjerne pSTAT3 i WT ACF dukket det meste i lamina propria eller abscessed krypter (figur 5E, venstre panel) . Kvantitativ analyse av pSTAT3 ved baseline viste ingen forskjeller i TLR2
– /- vs. WT mus (figur 5F)
Paneler A-C. IL-6 produksjon i WT og TLR2
– /- mus på dag 14 av AOM-DSS behandling ble målt ved hjelp av ELISA. (A) Serum-nivåer av IL-6 (n = 8 WT, n = 9 TLR2
– /-). (B) IL-6-konsentrasjon i kolon homogenater ble normalisert til proteinkonsentrasjon i vev (n = 3 WT, n = 5 TLR2
– /-). (C) IL-6-sekresjon fra isolerte colonic lamina propria-celler ble behandlet med LPS (1 pg /ml) i 6 timer (n = 3-5). (D) Immunofluorescent flekker av fosfor-Stat3 i colonic vev av WT og TLR2
– /- mus ved baseline. Original forstørrelse 100x. (E) Immunofluorescent farging av fosfo-Stat3 in colonic vev av WT og TLR2
– /- mus behandlet i 14 dager med AOM-DSS diett. Topplate opprinnelige forstørrelse 40x, bunnpanelet opprinnelige forstørrelse 400x. (F) Kvantifisering av fosfo-Stat3 intensitet målt i ACF fra mer enn fem fokus felt i minst fire lysbilder pr dyr (n = 5 WT og n = 5 TLR2
– /-). Alle tester ble utført ved anvendelse av 95% konfidensintervaller. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. . * = P 0,05, ** = p 0,01, *** = p 0,001
TLR2
– /- mus har økt T
H17 immunrespons under CAC utvikling
Nyere studier har markert T
H17 celler i patogenesen av IBD [39] og tykktarm tumorigenesis [40]. Vi undersøkte uttrykk for T
H1, T
H2 og T
H17 cytokiner i kolon av WT og TLR2
– /- mus under tidlig utvikling av CAC. Mens vi observert redusert produksjon av IFNg fra kolon homogenates avledet fra TLR2
– /- mus sammenlignet med WT mus på dag 14 (Figur 6A), observerte vi betydelig høyere TNFa produksjon i TLR2-manglende kolon forhold til WT kolon (p 0,05) (fig 6H), til en Th1 cytokin er kjent å spille en avgjørende rolle i utviklingen CAC [32]. Vi observerte ikke noen statistisk signifikante forskjeller i IL-10 (figur 6B) eller IL-4 (figur 6C) nivåer i colonic homogenater i disse dyrene. I motsetning til dette ble det observert en mer enn to gangers økning i IL-17A på TLR2
– /- kolon homogenater sammenlignet med WT (p 0,05) (figur 6D). Isolerte LPMCs fra TLR2
– /- mus også produsert mer enn syv ganger mer IL-17A i forhold til WT celler når restimulert med anti-CD3e og anti-CD28 (p 0,001) (figur 6E). Vi har også observert betydelig økt produksjon av TGF-b i TLR2-manglende kolon forhold til WT kolon (p 0,05) (Figur 6F). Økt produksjon av TGF-b ‥ IL-6, og pStat3 i TLR2
– /- mus sammenlignet med WT støtter ytterligere involvering av T
H17 celler. IL-23p19 er et cytokin som er implisert i opprettholdelsen av T
H17-celler [41]. Vi observerte at TLR2
– /- kolon homogenates har betydelig lavere IL-23p19 nivåer ved baseline sammenlignet med WT kolon (p 0,001) (figur 6G). Men etter dag 14 av AOM-DSS behandling, økt IL-23p19 produksjon betydelig i TLR2
– /- kolon mens synkende i WT kolon (p 0,001) (figur 6G), ytterligere støtte samspillet mellom TLR2 og T
H17 celler i denne modellen. I tillegg, sammenlignet med WT kolon på dag 14 av AOM-DSS behandling, TLR2
– /- kolon vises betydelig mer colonic TNFa-produksjon (figur 6 H), kjent for å spille en avgjørende rolle i utviklingen CAC [32].
