Abstract
Heavy-ion bestråling induserer en høyere frekvens av DNA-dobbelttrådbrudd (DSB sin) som må repareres . Kritisk forkorting av telomerer kan utløse DNA skade reaksjoner som DSB sin. Telomerer er svært følsomme for oksidativt stress som ioniserende stråling. DNA-avhengig protein kinase katalytisk subenhet (DNA-PKCS) er den sentrale komponent i det ikke-homologe ende sammenføyning (NHEJ) reparere kompleks og deltar i telomere vedlikehold. Derfor er det forventet å øke den celledrepende virkning av tung-ion bestråling via DNA-PKCS inhibering. For å teste denne hypotese, ble celledelt radiosensitiviteten målt ved den klonale genetisk analyse. DNA-skader reparasjon ble relativt kvantifisert ved lang PCR. Apoptose ble kvantifisert ved flow-cytometrisk analyse av annexin V /PI dobbeltfarging, og begynnende alderdom ble analysert ved galaktosidaseaktivitet. Telomer-lengden ble semi-kvantifisert ved real-time PCR. P53 og P21 ble bestemt ved Western blotting. Våre data viser at MCF-7 og HeLa-celler med DNA-PKCS hemming var mer utsatt for karbon-ion bestråling enn de uten DNA-PKCS inhibering. Selv om NHEJ ble hemmet av DNA-PKCS spesifikk inhibitor, NU7026, ble det meste DNA-skade indusert av karbon-ion bestråling reparert i løpet av 24 timer etter bestråling i begge cellelinjer. Men potensiell dødelig skade reparasjon (PLDR) kunne ikke gjenopprette celleinaktivering i DNA-PKCS hemmet celler. MCF-7-celler viste omfattende alderdom og akselerert telomerlengde reduksjon, mens HeLa-celler gjennomgikk apoptose signifikant etter bestråling med NU7026 inkubasjon. I tillegg har begge cellelinjer med kortere telomere var mer utsatt for karbon-ion stråling. Vår nåværende data antydet at DNA-PKCS hemming kan forbedre mobilnettet følsomhet for karbon-ion stråling via forstyrre sin funksjonelle rolle i telomer-end beskyttelse. Kombinasjonen av DNA-PKCS hemming og karbon-ion bestråling kan være en effektiv metode for tung-ion terapi
relasjon:. Zhou X, X Zhang, Xie Y, Tanaka K, Wang B, Zhang H (2013 ) DNA-PKCS Hemming sensitizes kreftceller til å Carbon-Ion Bestråling via telomere Capping avbrudd. PLoS ONE åtte (8): e72641. doi: 10,1371 /journal.pone.0072641
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 14. april 2013, Godkjent: 11 juli 2013; Publisert: 27 august 2013
Copyright: © 2013 Zhou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Basic Research Program of China (2010CB834202), Natural Science Foundation National of China (10835011), og vitenskaps teknologi forskningsprosjekter i Gansu-provinsen (0702NKDA045, 0806RJYA020) og HIMAC prosjektet 11J364 som er støttet av National institutt for Radiologisk Sciences. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Telomerer er spesialisert DNA-proteinstrukturer som cap endene av kromosomene. Rundt 90% av kreftceller inneholder korte telomerer, men utviser høy telomerase aktivitet. Som kreftceller dele oftere, har de i gjennomsnitt kortere telomerer enn normale celler. Derfor uten skikkelig telomerase funksjon for å opprettholde telomerlengde, telomerer i kreftceller kan forkorte i et raskere tempo enn normale celler. Kritisk korte telomerer kan føre til kromosomavvik [1] og indusere DNA-skade respons (DDR) [2]. Således kan telomerlengde være en viktig faktor for kreftcelleinaktivering.
Telomerer spiller viktige roller i cellulære responser til DNA-skadende midler, slik som ioniserende stråling (IR) [3]. Flere linjer av bevis har antydet at telomer vedlikehold er knyttet til radiosensitiviteten. For eksempel, både den radiosensitive AT celler og ABS-celler viste en rekke telomere-assosierte defekter og deres Radiosensitivity-relaterte proteinet er til stede i telomerer [4] – [7]. Dobbel tråd pauser på telomerer må være riktig behandlet av telomerase ved hjelp av telomere bindende proteiner. Hvis ikke, kan de pausene på telomerer initiere kromosom nedbrytning og /eller rearrangements, DDR og til slutt føre til celledød [8].
Høy LET stråling kan forårsake større og mer komplekse DNA skade enn lav LET stråling. Lav LET stråling produserer enkelttrådsbrudd (SSBs), mens høy LET stråling produserer primært DSB sin og gruppert skader, som representerer en farlig form for skade. Hvis ikke repareres, DSB sin forårsake genetiske endringer og /eller celledød. De differensielle responser av celler etter eksponering til bestråling ved forskjellige LET-verdier kan tilsvare det faktum at naturen til DNA-skade er tydelig. Det finnes rapporter som viser at telomer-struktur er spesielt utsatt for oksidativt stress [9]. Derfor kan høy LET stråling føre til mer alvorlige skader på telomerer enn lav LET stråling. Som de fleste kreftceller båtplass kortere telomerer enn normale celler, kan de telomerer i kreftcellene være mer sannsynlig å avta til en kritisk lengde med telomerase hemming. Derfor kan vi postulerte at det celledrepende virkning av tung-ion bestråling kan bli styrket ved forstyrrelser på grunn av telomere forlengelse i kreftceller.
I denne studien viste vi at den radiosensitiviteten av MCF-7 og HeLa-celler var betydelig forbedret ved NU7026, en DNA-PKCS spesifikk hemmer, følgende karbon-ion-bestråling. Videre undersøkelser viste at med en begrenset effekt på DNA-reparasjon kapasitet, MCF-7 celler behandlet med NU7026 viste akselerert telomer-tap etter karbon-ion bestråling. Som DNA-PKCS er ikke bare viktig komponent i NHEJ reparasjon kompleks, men er også engasjert i telomer-funksjon, postulerte vi at NU7026 kunne forbedre Radiosensitivity ved å forstyrre telomerase tilgang til telomere etter karbon-ion bestråling.
Materialer og metoder
Cell Kultur og Bestråling Behandling
den menneskelige brystkreft celle lineMCF-7 og livmorhals kreft cellelinje HeLa ble kjøpt fra American Type Culture Collection. Celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (Gibco, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum. Cellene ble dyrket i 5% CO
2 i fuktet luft ved 37 ° C.
X-ray ble generert med en X-ray maskin (Pantak-320S, Shimadzu, Japan) operert ved 200 kVp og 20 mA ved anvendelse av en 0,5-mm Aluminium + 0,5 mm kobber filter. En eksponeringshastighet meter (AE-1321 M, Applied Engineering Inc., Japan) ble brukt for dosimetri. Dose prisene var 1,1 Gy /min. Celler i eksponentiell vekst ble bestrålt ved værelsestemperatur, med ikke-bestrålte kultur celler (kontroll) som ble håndtert i parallell med de bestrålte prøvene.
Carbon-ion bestrålinger ble utført ved romtemperatur ved Heavy Ion Medical Accelerator Senter (HIMAC) av National Institute of Radiologisk Sciences (Chiba, Japan), med 290 MeV /n karbon-ion; LET verdi for karbon-ion var 40 keV /mikrometer. Dose prisene var en Gy /min. Noen bestråling Prosedyren ble også utført i Heavy Ion Research Facility i Lanzhou HIRFL, Institutt for moderne fysikk, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou, Kina med 300 MeV /n karbon-ion og en LET verdi av 49 KeV /mikrometer.
klonogene analysen
Celler i eksponentiell vekst ble sådd i petriskåler for kolonidannelse. 1000-10000 celler ble sådd ut i løpet av en time etter bestråling basert på det bestrålingsdose mottatt. For undersøkelse av potensielt dødelig skade recovery (PLDR), ble cellene dyrket i medium for en hvileperiode på 24 timer etter bestråling og deretter sådd. Celler ble ytterligere inkubert inntil koloniene dannet var store nok til å bli talt opp, samtidig som den er separerbare. Koloniene ble så fiksert med metanol og farget med 0,6% Giemsa-løsning. Koloniene ble tellet manuelt. Bare kolonier som inneholder mer enn 50 celler ble scoret.
apoptose analysen
Kvantifisering av apoptotiske celler ble oppnådd ved bruk av Annexin V-FITC deteksjon kit (beyotime, CN) i henhold til produsentens protokoll. Data ble evaluert med FlowJo 7.2.1 programvare. Følgende kontroller ble brukt til å sette opp kompensasjon og kvadranter:. Ufargede celler og celler farget med FITC-annexin V eller med PI alene
Senescence analysen
MCF-7 celler ble vasket to ganger med PBS og fiksert med 2% formaldehyd, 0,2% glutaraldehyd i 5 min. Cellene ble deretter vasket på ny med PBS og farget med en oppløsning av 1 mg /ml 5-brom-4-klor-3-inolyl-ß-galaktosidase i dimetylformamid (20 mg /ml stam), 5 mM kaliumferrocyanid, 150 mM NaCl, 40 mM sitronsyre /natriumfosfat, pH 6,0, og 2 mM MgCl
2. Etter inkubering over natten ved 37 ° C ble cellene vasket to ganger med PBS og deretter fotografert.
QPCR for telomerlengde Måling
FTC-3000 qPCR system (FUNGLYN, CA) ble anvendt for analyse. Total genomisk DNA fra 50 ng ble anvendt for telomerlengde analyse, i en 20 pl reaksjon inneholdende 1X SYBR Premiks Ex Taq II (Takara, Japan) og 200 nmol /l hver primer. Den sekvensinformasjon om primerne som ble oppført i tabell 1. Triplikat reaksjoner ble utført for hver markør ved hjelp av følgende termiske sykluser profil tilpasset fra Cawthon [10]: 15 min ved 95 ° C i trinn 1.; 2 sykluser på 15 s ved 94 ° C, 15 s ved 49 ° C på trinn 2; og 32 sykluser av 15 s ved 94 ° C, 15 s ved 58 ° C, 15 s ved 72 ° C med signal på stadiet 3. 72 ° C leser gitt Ct-verdier for amplifikasjon av den telomere og c-myc mal. Relativ kvantifisering tilnærming (△△ Ct) ble anvendt i henhold til fremgangsmåten som tidligere er beskrevet [11]. Hver test ble utført i tre eksemplarer.
DNA Damage Repair analysen
Long PCR for mtDNA skade Evalueringen ble utført ved hjelp av GeneAmp XL PCR kit (Perkin-Elmer, Boston, MA) . Kvantitativ lange PCR ble utført i en Eppendorf Mastercycler PCR-system (Eppendorf, Hamburg, Tyskland). Den syklustest PCR ble utført før å sikre PCR i den eksponensielle fase. Den sekvensinformasjon av primerne er angitt i tabell 1. PCR ble initiert med en 75 ° C varm-start tilsetning av polymerasen og tillates å gjennomgå den følgende profil: en innledende denaturering i 1 min ved 94 ° C etterfulgt av 25 sykluser for store fragmenter eller 20 sykluser for små fragmenter av 94 ° C denaturering i 15 sekunder og 68 ° C forlengelse i 15 min. En endelig forlengelse ved 72 ° C ble utført i 10 min ved gjennomføring av profilen. En porsjon av hvert PCR-produkt ble oppløst på en 1% agarosegel og vertikal elektroforese i TBE i 4 timer. Gelene ble deretter digitalt fotografert og kvantifisert med FluorChem FC2 (Alpha Innotech aksjeselskap). Den DNA-skade ble kvantifisert ved å sammenligne den relative nivå av amplifikasjon av de store fragmenter av DNA (10,4 kb-HPRT-genet) normalisering denne til amplifikasjon av mindre (54-bp c-myc) fragmenter.
Etablering av celler med Kortere telomere
celler ble inkubert med 2 uM MST312 (Sigma, USA) i 50-70 dager i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (Gibco, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum. Celler ble dyrket i 5% CO
2 i fuktet luft ved 37 ° C. Mediet med 2 mikrometer MST312 ble erstattet hver 3 til 4 dager. Telomerlengde ble bestemt ved QPCR som beskrevet ovenfor. MST312 ble fjernet fra mellom 24 timer før stråling prosedyre.
Cvtotoksisitetsmålinq
Cytotoksisitet av MST312 ble bestemt av sanntids overvåking av heftende celler ved RT-CES System (ACEA biovitenskap, USA ). 10000-celler ble sådd ut i hver 360 ul godt med 200 ul medium før måling. Mediet ble erstattet hver 3. dag. Spredning av MCF-7 og Jakten celler ble registrert hver 2 timer i 144 timer.
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført på hjelp av data fra minst tre uavhengige forsøk. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD. Students t-testprogrammet i Microsoft Excel ble benyttet for å detektere statistisk signifikans.
p
. 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
NU7026 Behandling Forbedret Cellular Inaktive via apoptose og /eller Senescence i kreftceller etter Carbon-ion Bestråling
Radiosensitivity av celler ble undersøkt av klonogene analysen. Som illustrert i figur 1, den radiosensitiviteten av NU7026-behandlede celler var større enn kontroll i begge cellelinjer. Den cellulære inaktive effekten av karbon-ion bestråling var større enn den for røntgenstråler. For ytterligere å undersøke celle skjebne etter bestråling og /eller NU7026 behandling, ble cellulær apoptose og begynnende alderdom bestemmes av annexin /PI dobbeltfarging og P-galaktosidase histokjemisk farging, respektivt. Apoptose i MCF-7 og HeLa-celler ble ikke signifikant forhøyet når de ble behandlet med karbon-ion bestråling eller NU7026 alene, men ble markert øket ved kombinasjonen av karbon-ion bestråling og NU7026 behandling (Tabell 2). MCF-7-celler behandlet med NU7026 etter karbon-ion bestråling viste omfattende cellulære senescens 30 dager etter bestråling; karbon-ion-bestråling alene også indusert senescens, men til en mye mindre grad (figur 2). HeLa-celler gjennomgikk betydelig befolkningstapet via apoptose 48 timer etter bestråling, og kan ikke opprettholde spredning etterpå.
Celler ble inkubert med 10 mm NU7026 i 3 timer før bestråling.
Forbedret Radiosensitivity var Uavhengig av DNA Damage Repair Kapasitet
DNA-PKCS er nødvendig for NHEJ vei av DNA reparasjon, noe som rejoins DSB sin. Siden DNA-reparasjon kapasitet er nært knyttet til Radiosensitivity, NU7026, en bestemt DNA-PKCS inhibitor, kan muligens forbedre Radiosensitivity ved å forstyrre reparasjon av DSB sin mediert av NHEJ. Det ble imidlertid ikke signifikant tap av DNA-reparasjon kapasitet detektert i begge celler behandlet med 10 uM NU7026 etter en Gy karbon-ion bestråling. I tillegg gjorde PLDR ikke gjenopprette celleinaktivering av celler DNA-PKCS-inhiberte som målt ved overlevelse fraksjon, noe som indikerer at DNA-PKCS kan påvirke Radiosensitivity via en alternativ vei uavhengig av dens rolle i DNA-skade reparasjon (figur 3).
A. Overlevelsen fraksjon av bestrålte celler etter 24 timers utvinning; B. kinetikk DNA skade reparasjon etter en Gy karbon-ion bestråling med /uten NU7026 behandling, målt ved relative lang PCR forsterkning.
DNA-PKCS Hemming Resulterte i Accelerated telomerlengde Reduksjon etter Carbon -ion Bestråling
telomerlengde er en kritisk faktor i utbruddet av mobilnettet senescence. For å undersøke hvorvidt senescens indusert ved stråling skyldes telomerlengde reduksjonen ble real-time PCR benyttes for å bestemme den relative kvantifisering av telomerlengde. Som vist i figur 4, MCF-7-celler dyrket med NU7026 viste ingen signifikant telomere tap; Men telomerlengde i karbon-ion bestrålte celler gradvis redusert i løpet av 30 dager. Spesielt telomerlengde i celler behandlet med kombinasjonen av NU7026 og karbon-ion bestråling redusert mer alvorlig. Dette akselererte telomere tapet kan utgjøre den økte senescens sett i celler 30 dager etter bestråling.
MCF-7-celler ble inkubert med 10 uM NU7026. *: P 0,01 versus kontroll;
#: p. 0,01 versus en Gy karbon-ion bestråling
Korte Telomerer forårsaket Celluar Inaktive etter Carbon-ion Bestråling
For å finne ut om telomerer forkortes var årsaken til celleinaktive etter karbon-ion bestråling, MCF-7 og HeLa celler med kortere telomerer ble etablert via kontinuerlig inkubasjon med telomerase inhibitor MST312. En cytotoksisk analyse viste at 2 uM MST312 ikke førte til vesentlig veksthemming sammenlignet med kontrollen (figur 5A-B). Betydelig forkorting av telomerlengde ble påvist i MCF-7-celler etter 50 dager, og i HeLa-celler etter 30 dager kontinuerlig inkubasjon med MST312 (figur 5C). (Figur 5B). P-galaktosidase histokjemisk farging viste at mens mindre senescens ble påvist i MCF-7-celler etter 50 dager ko-inkubering med MST312 (figur 5C), en Gy karbon-ion bestråling indusert omfattende senescens i disse cellene (figur 5D). Karbon-ion stråleindusert høyt nivå av apoptose i HeLa-celler med kortere telomer (tabell 2).
Sanntidsovervåkning av veksten og proliferasjonen av MCF-7 og HeLa-celler i nærvær av MST312 ved hjelp av RT- -CES plattform. B. Relativ telomerlengde i MCF-7 og HeLa-celler etter langvarig MST312 inkubasjon. C. Senescence av MCF-7 celler 50 dager etter MST312 inkubasjon; D. Senescence av MCF-7 celler med kortere telomerer 5 dager etter en Gy karbon-ion bestråling.
Diskusjoner
En av de viktigste forskjellene mellom høy-LET og lav-LET stråling er at høy-LET stråling produserer mer tett fordelt og klynger av DSB sin enn lav-LET stråling. Det har vært antydet at det vil være spesielt vanskelig for det cellulære DNA reparasjonssystem for å reparere klynge DNA-skade [12], [13]. Det er to hoved DSB reparasjonsmekanismer i pattedyrceller: NHEJ og homolog rekombinasjon (HR). Det antas at NHEJ er den dominerende DSB reparasjon reaksjonsveien i pattedyrceller [14] – [17]. Imidlertid var korte DNA-fragmenter som induseres av tung-ion bestråling rapportert å inhibere NHEJ prosessen [18]. Videre tung-ion-bestråling indusert komplekse DSB sin som er tenkt å bli reparert av HR [19]. Dermed blir ekstra hemmende effekt av NHEJ kunne ha pålagt en begrenset effekt på reparasjon av karbon-ion bestråling-indusert DNA-skader i vårt eksperiment. Inhiberingen av DNA-PKCS bremset kinetikken av DNA-reparasjon i vårt studium og kan ha vært på grunn av langsommere DNA-reparasjonskinetikken til HR, sammenlignet med den NHEJ prosessen. Som DNA-skader ble til slutt reparert innen 24 timer etter bestråling, kan den forbedrede Radiosensitivity ha blitt forårsaket av andre faktorer, som for eksempel kritisk telomerer forkortes. Drissi et.at. rapportert at korte telomerer indusere kromatinstruktur endringer som begrenser tilgangen av aktivert ATM til nedstrøms mål på kromatin, noe som kan forklare den økte strålingen følsomhet sett med telomerer forkortes [20]. Irrelevans av NHEJ reparasjon Radiosensitivity var også tydelig i våre PLDR data, som viste at selv om mesteparten av DNA-skaden ble reparert etter 24 timer inkubasjon, kan DNA-PKCS hemming likevel føre til lavere celleoverlevelse.
Sabatino et.al antydet at telomerer forkorte etter bestråling kan representere en viktig formidler mellom stråling, ROS dannelse og vaskulære skader [21]. Den markerte økningen i Radiosensitivity følgende DNA-PKCS inhibering kunne ha vært forårsaket av den annen rolle DNA-PKCS, som virker som en telomer-bindende protein [22]. DNA-PKCS opphevelse kan føre til en raskere hastighet av telomer-degradering på grunn av sin interaksjon med telomerase i telomere vedlikehold [23]. Studier har vist at DNA-PKCS var også involvert i telomer-end beskyttelse. Karakteristikken av telomer-dysfunksjon med DNA-PKCS inhibering er blitt grundig undersøkt av Bailey SM et.al. [24], [25]. Disse forfatterne viste at uncapped telomerer med DNA-PKCS er feilaktig oppdaget og behandlet som DSB sin, og dermed delta i ioniserende stråling-indusert telomer-DSBs fusjonsbegivenheter.
Som en kritisk komponent i telomer-end-capping [26], DNA-PKCS hemming kan forstyrre riktig tilgang av telomerase til telomerer, til slutt resulterer i telomerer forkortes. Siden de fleste kreftceller havn kortere telomerer enn normale celler, deres telomerer er mer sannsynlig å bli redusert til en kritisk lengde hvis telomerase er dysfunksjonell. I denne studien, akselerert telomerer forkortes ble oppdaget i DNA-PKCS-hemmet celler etter karbon-ion bestråling i MCF-7 celler, ledsaget av omfattende mobilnettet senescence. Vi kan ikke oppdage telomerer forkortes i HeLa celler etter karbon-ion med DNA-PKCS hemming, på grunn av deres manglende evne til kontinuerlig spredning. Den betydelige apoptose i HeLa celle kan være mediert av DNA-skade respons. Men DNA damge analysen viste at DNA-skade ble effektivt reparert innen 24 timer etter bestråling. Siden DNA-PKCS ikke bare deltatt i DNA dobbel fritt reparasjon, men også fungere som et avgjørende element for telomere slutten tildekking, er det derfor mulig at DNA skade respons ble indusert av dysfunksjonell telomere. Med etableringen av HeLa og MCF-7 celler næret kortere telomerer, vi bekreftet at telomer dysfunksjon kan bidra til celleinaktivering av kreftceller etter karbon-ion bestråling. Disse resultatene gir bevis for at DNA-PKCS hemming kan resultere i bestrålingssensibilisering grunn av sin kritiske rolle i telomer-end capping.
I konklusjonen, fant vi at NU7026 betydelig sensibilisert MCF-7 og Jakten celler til karbon-ion bestråling. Denne økte Radiosensitivity ble neppe forårsaket av ufullstendig DNA-skade reparasjon, men etter telomere dysfunksjon. Våre funn gir holdepunkter for at målretting telomer-end-capping protein kan være en effektiv måte å behandle brystkreft.
Takk
Forfatterne ønsker å takke External Cooperation Program for Chinese Academy of Sciences, Japan Society for Promotion of Science og National for Cooperative Research Program. Forfatterne takker også Ms H. Arai og Ms M. Nakajima for deres tekniske assistanse gjennom hele studien.
