Abstract
Bakgrunn
N
-butylidenephthalide (BP) viser antitumor effekt på en rekke kreftcellelinjer. Målet med denne studien var å innhente ytterligere innsikt i involvert i BP indusert celledød i menneskelige prostata kreft celler mekanismer.
Metoder /hovedfunnene
To menneskelige prostata kreft cellelinjer, PC- 3 og LNCaP, ble behandlet med BP, og deretter evaluert for deres levedyktighet og cellesyklus profiler. BP forårsaket cellesyklus arrest og celledød i begge cellelinjer. Den G0 /G1 fase arrest ble korrelert med øke nivåene av CDK-hemmere (p16, p21 og P27) og reduksjon av sjekkpunkt proteiner. For å bestemme mekanismene for BP-indusert vekst arrestasjon og celledød i prostatakreft cellelinjer utførte vi en microarray studie for å identifisere endringer i genuttrykk indusert av BP i LNCaP cellene. Flere BP-induserte gener, inkludert GADD153 /CHOP, en endoplasmatiske retikulum belastning (ER stress) -regulated genet, ble identifisert. BP-indusert ER stress ble dokumentert av økt uttrykk av de molekylære GRP78 /BIP IRE1-a og GADD153 /CHOP i begge cellelinjer. Blokkering av IRE1-α eller GADD153 /CHOP uttrykk av siRNA betydelig redusert BP-indusert celledød i LNCaP celler. Videre blokkering av JNK1 /2 signalisering av JNK siRNA resulterte i redusert uttrykk av IRE1-α og GADD153 /CHOP gener, impliserer at BP-indusert ER stress kan utløses via JNK1 /2 signalisering i prostatakreftceller. BP også undertrykkes LNCaP xenograft tumorvekst hos NOD-SCID-mus. Det forårsaket 68% reduksjon i tumorvolum etter 18 dagers behandling.
Konklusjoner
Våre resultater tyder på at BP kan føre til G0 /G1 faserest i prostatakreftceller og dets cytotoksisitet mediert av ER stresset induksjon. Således kan BP tjene som et anticancermiddel ved å indusere ER stress i prostata cancer
relasjon:. Chiu S-C, Chen S-P, Huang S-Y, Wang M-J, Lin S-Z, Harn H-J, et al. (2012) Induksjon av apoptose Koblet til endoplasmatisk retikulum stress i Human prostata kreft celler med
n
-butylidenephthalide. PLoS ONE 7 (3): e33742. doi: 10,1371 /journal.pone.0033742
Redaktør: Ashraf B. Abdel-Naim, Avdeling for farmasi, Ain Shams universitet, Egypt
mottatt: 22 november 2011; Akseptert: 16 februar 2012; Publisert: 28 mars 2012
Copyright: © 2012 Chiu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Science Council, Taiwan (NSC-93-2320-B-303-004, NSC-94-2320-B-303-005, NSC-96-2113-M-303-001), og Buddhist Tzu-Chi General Hospital, Hualien, Taiwan (TCSP-01-02, TCRD-I9801-03). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den vanligste kreftformen hos amerikanske menn og den nest største årsaken til dødsfall fra kreft [1]. Behandlingstilbud for pasientene omfatter kirurgi, strålebehandling, hormonbehandling, kjemoterapi, og kombinasjoner av noen av disse behandlingene. En av de mest vanlige kjemoterapimiddel som anvendes for behandling av prostata cancer er taxaner, såsom den første generasjon medikament paklitaxel (Taxol, et varemerke for Bristol-Myers Squibb) [2], [3]. Økte konsentrasjoner av cytotoksiske medikamenter og høyere doser av bestråling mislykkes i å forbedre responsen på behandlingen, og det fører til apoptose motstand i prostatakreftceller. Derfor er nylig utviklet anticancermidler som er ikke-toksisk og meget effektive i indusering av apoptose i tumorceller fortrinnsvis er verdifulle.
Nylig har ikke-tradisjonelle behandlinger ved hjelp urter og kosttilskudd vært ansett som alternative legemidler for kreftbehandling.
Angelica sinensis plakater (også kalt Danggui i kinesisk) er en av de mest brukte tradisjonelle urter i Kina. Det er anbefalt som en tonic, hemopoetic, spasmolytic, og smertestillende legemiddel i klinisk praksis [4]. I vår forrige undersøkelse,
n
-butylidenephthalide (BP), en forbindelse isolert fra
Angelica sinensis
kloroform ekstrakt, viser vekst hemmende aktivitet på ulike humane kreftcellelinjer, inkludert hjernen, lungene og leveren kreftceller. BP forårsaket vekst og apoptose i disse tumorceller
in vitro Hotell og
in vivo product: [5] – [7]. Disse funnene tyder på at BP er en lovende ny anticancer forbindelse med et potensial for klinisk anvendelse. Imidlertid har effekten av BP på prostata kreftceller ikke er blitt adressert.
Protein folding i det endoplasmatiske retikulum (ER) er svekket under forskjellige fysiske og patologiske tilstander, betegnet ER stress. En spesifikk signalveien, den ufoldede protein respons (UPR), er blitt demonstrert i cellen for å overvinne ER stress [8]. Induksjon av glukoseregulerte protein GRP78 /BiP har blitt anerkjent som en markør for ER stress og utbruddet av UPR. UPR-signaler gjennom tre forskjellige stress-sensorer plassert på akuttmottaket membran: protein kinase RNA-lignende ER kinase (perk), inositol-krever protein-1 α (IRE1-α) og aktivering av transkripsjonsfaktor-6 (ATF6) [9]. Blant dem, IRE1-mediert aktivering av juni N-terminal kinase (JNK) bidrar til celledød ved fosforylering og inaktivering av den anti-apoptotiske regulator BCL-2 [10]. Transkripsjonsfaktor CCAAT /enhancer-bindende protein (C /EBP) -homologous protein (CHOP, også kjent som DDIT3 /GADD153) drives ved konvergens av den ekstra fordel, IRE1-α og ATF6 trasé [11], [12]. Overekspresjon av CHOP spiller en viktig rolle i apoptose [13] gjennom dephosphorylates apoptosiske BH3-bare protein Bad og nedregulerer BCL-2 uttrykk [14]
Denne studien søkt. 1) for å bestemme anti -proliferative effekten av BP
in vitro Hotell og
in vivo
, 2) for å analysere effektene av BP på cellecyklusprogresjonen og apoptose, 3) for å undersøke ER stress som en potensiell molekylære mål av BP, og 4) for å etablere hvorvidt MAPK /eR stress signalering er involvert i BP-mediert apoptose i prostata kreft. Effektene av BP i prostatakreft ble undersøkt
in vitro
i LNCaP og PC-tre cellelinjer. LNCaP-NOD-SCID mus xenograft eksperiment ble brukt til å vurdere anticancer effekten av BP
in vivo
.
Resultater
BP hemmet spredning og indusert morfologi endringer i menneskelig prostatakreft celler
BP har en sterk anti-proliferativ effekt på GBM celler og forårsaket G0 /G1 fase og apoptose i en tids- og konsentrasjonsavhengig måte. For å bestemme cytotoksisiteten virkningen av BP på prostata kreftceller, ble tre humane prostatacancercellelinjer behandlet med økende konsentrasjon av BP i 24 og 48 timer, og ble evaluert ved MTT-assay. Som vist på fig. 1A og B, BP betydelig redusert levedyktighet av DU-145, PC-3 og LNCaP-celler i en dose- og tidsavhengig måte. Behandling av LNCaP og PC-3-celler med 75 ug /ml BP i 48 timer resulterte i 24,48% og 45,88% celleoverlevelse, henholdsvis (fig. 1B). Basert på disse dataene, brukte vi 70 ug /ml BP for senere studier. For ytterligere å undersøke cytotoksisitet effekten av BP på prostatakreftceller, ble LNCaP (androgen-avhengige) og PC-3 (androgen-uavhengig) celler valgt for videre undersøkelser. BP-behandlet LNCaP og PC-3 celler viste åpenbare celle krymping og avrunding opp, og har typisk for celler som gjennomgår apoptose (Fig. 1D og F).
DU-145 (sort), PC-3 (grå) , LnCap (hvite) cellene behandlet med økende konsentrasjon av BP (25 til 100 ug /ml) i 24 (A) og 48 t (B) og analysert med MTT-analyse. LnCap og PC-3-celler ble behandlet med 0,2% DMSO (C og E, henholdsvis) eller 70 ug /ml BP (D og F, henholdsvis) i 24 timer, ble vist.
BP indusert cellesyklus arrest i G0 /G1 fase og forandret uttrykket nivåer av G0 /G1 regulatoriske proteiner
for å belyse dens virknings, undersøkte vi effekten av BP på cellesyklusprogresjon. Strømningscytometri-analyse viste at BP behandlingen resulterte i akkumulering av celler i G0 /G1 fase i en tidsavhengig måte (fig. 2A og B). Kvantifisering av prolifererende ubehandlede celler viste at 67,95% av cellene var i G0 /G1 fase, 24,96% av cellene i S-fasen, og 7,73% av cellene var i G2 /M-fasen av cellesyklusen 12 timer etter utplating i LNCaP celler; 62,71% av cellene var i G0 /G1 fase, 17,78% av cellene i S-fasen, og 19,50% av cellene var i G2 /M-fasen av cellesyklusen 12 h etter plating på PC-3-celler. Behandling av cellene med 70 pg /ml BP i 12 timer økte prosentandelen av celler i G0 /G1 fase til 81,94%, og reduserte prosentandelen av cellene i S- og G2 /M-fasene til 10,6 og 8%, henholdsvis, i LNCaP celler. I PC-3-celler behandlet med 70 ug /ml BP i 12 timer, prosentandelen av celler i G0 /G1 fase økes til 69,94%, og cellene i S- og G2 /M-fasene ble redusert til 18,11 og 11,97%, henhold .
BP indusert cellesyklus G0 /G1 arrest i (A) LNCaP og (B) PC-3 celler. Celler ble sådd ut ved 8 x 10
5 (LNCaP) og 6 x 10
5 (PC-3) pr 6 cm plate in triplo og behandlet med 70 ug /ml for BP 12-24 timer. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.D. fra tre forskjellige eksperimenter. *,
P
0,05; **
P
0,01. Western blot-analyse av cyclin D1, CDK2, p16, p21, p27 og fosfo-Rb (Ser807 /811) ble utført i LNCaP-celler (C) og PC-3-celler (D). β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. Western blot-analyse av fosfo-Akt (Ser473), ble Akt, fosfo-GSK-3β (Ser9) og GSK-3β utført i LNCaP-celler (E) og PC-3-celler (F). β-actin ble brukt som en intern kontroll.
For å bestemme de molekylære mekanismene bak G0 /G1 cellesyklus arrest i prostatakreftceller indusert av BP, undersøkte vi uttrykket av visse G0 /G1 regulatorisk proteiner i LNCaP og PC-3-celler behandlet med 70 ug /ml BP. Vi først undersøkt nivået av cyclin D1, hoved cyclin kontrollere G0 /G1 sjekkpunkt. BP behandling førte til hurtig reduksjon av cyclin D1 proteinnivå (fig. 2C og D). Oppregulering av G0 /G1 cellesyklusregulerende proteiner, slik som p16, p21, p27, og nedregulering av CDK2 ble også observert på en tidsavhengig måte (fig. 2C og D) .Vi også observert en rask reduksjon av Rb-fosforylering nivå (Fig . 2C og D) indikerer kompromittert aktivering av CDK4 /6.
det er blitt fastslått at cyklin D1 fosforylering blir mediert av Akt-GSK-3β pathway. Aktivert Akt fosforylerer og hemmer GSK-3β funksjon, som fører til de-fosforylering og stabilisering av cyklin D1. Derfor undersøkte vi om Akt-GSK-3β-cyclin D1 veien var involvert i BP-indusert nedbrytning av cyclin D1 i prostatakreftceller. Western blot analyse viste at BP hurtig og markert undertrykket Akt fosforylering, så tidlig som 10 minutter (Fig. 2E og F). I samsvar med hemming av Akt aktivitet, redusert fosforylering av Ser9 i GSK-3β, et mål av Akt kinase, ble også bemerket (Fig. 2E og F), noe som tyder på at BP fremmer cyclin D1 fosforylering via undertrykkelse av Akt og aktivering av GSK- 3β. Disse dataene tyder på at BP undertrykker Akt-GSK-3β sti i prostatakreftceller og forårsaker G0 /G1 vekst arrest ved å påvirke uttrykket av G0 /G1 regulatoriske proteiner.
BP indusert apoptose i LNCaP og PC-3 celler
for å vurdere rollen til apoptose i BP-indusert celledød, ble western blotting og TUNEL farging utført. Aktivering av kaspaser er viktige mekanismer for induksjon av apoptose. Caspase -8 og -3 ble nøkkelen protease assosiert med død reseptor mediert-apoptose og deres engasjement i BP-indusert apoptose ble undersøkt i både LNCaP og PC-3 celler. BP-indusert caspase -8 og -3 splittelser økt doseavhengig både LNCaP og PC-3 celler (Fig. 3A og B). Den pro-apoptotiske Bcl-2 familiemedlemmer, Bax, økte også etter BP behandling som har viktig bindeledd mellom IRE1 og ER-stress-indusert apoptose. TUNEL-farging etter 48 timer etter 70 ug /ml BP behandlingen avslørte også økt antall av apoptotiske celler i både LNCaP og PC-3-celler (fig. 3D og F, respektivt).
Western blot-analyse av aktiv caspase 8 , aktiv caspase 3 og bax ble utført i LNCaP-celler (A) og PC-3-celler (B). β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. LNCaP-celler og PC-3-celler ble inkubert i fravær (C og E, henholdsvis) eller nærvær (D og F, respektivt) av 70 ug /ml BP i 48 timer og deretter utsatt for TUNEL assay.
genekspresjonsanalyser av cDNA microarray i BP-behandlede LNCaP celler
for å få innsikt i mekanismen av BP-indusert veksthemming og celledød, brukte vi oligodeoksynukleotid-baserte microarray for å identifisere BP-mediert genuttrykk . LNCaP-celler ble behandlet med 70 ug /ml BP til 3 og 24 timer, og RNA ble ekstrahert og brukt i mikromatriseanalyse. Gener inkludert GADD153 /CHOP ble identifisert til å være oppregulert i en tidsavhengig måte (tabell 1). Vi validert oppregulering av GADD153 /CHOP gener ved western blot. BP fremkalte en økt ekspresjon av GADD153 /CHOP protein i både LNCaP og PC-3-celler (fig. 4A og B). Oppregulering av GADD153 /CHOP er definert som ER stress-respons, som i sin tur utløser signaler for å indusere apoptose. Vi undersøkte derfor rollen som ER stress i BP-indusert celledød i prostatakreftceller.
Western blot-analyse av BiP, calnexin, PDI, ATF6, fosfo-eIF2α (Ser51), IRE1-α, GADD153 /CHOP, fosfor-ASK1 (Thr845), ASK1 og Fas ble utført i LNCaP celler (A) og PC-3 celler (B). β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. Western blot-analyse av BiP, IRE1-α, GADD153 /CHOP og Ero1-metyleter av la ble utført i LNCaP-celler (C) og PC-3-celler (D). β-actin ble brukt som en intern kontroll.
BP indusert ER stress i LNCaP og PC-3 celler
For å avgrense induksjon av ER stress av BP i prostata kreftceller, undersøkte vi induksjon av UPR relaterte gener etter BP behandling i LNCaP og PC-3-celler (fig. 4A og B, henholdsvis). Ekspresjon av BiP økte etter BP-behandling, men ingen forskjeller ble funnet i calnexin og PDI uttrykk (fig. 4A og B). Oppregulering av ER stress transduser IRE1-α ble observert, men ikke ATF6 og p-eif-2α. BP indusert IRE1-α uttrykk var tydelig fra 3 h (1.16 folder) og økt til 48 timer (2,47 folder) i LNCaP celler. Nivåene av Fas øket etter BP behandling i både LNCaP og PC-3-celler og var i samsvar med mikromatrise funn i LNCaP-celler. I tillegg er uttrykk for BiP, IRE1-α og GADD153 økte doseavhengig både i LNCaP og PC-3-celler (fig. 4C og D). Den GADD153 transkripsjonen målet, ER oksidase en som α (ERO1-la-) også økte på en doseavhengig måte etter BP behandling (fig. 4C og D).
BP-indusert kjernefysisk translokasjon av GADD153 /CHOP i LNCaP og PC-3 celler
for å studere involvering av GADD153 /CHOP i BP behandling, må vi først undersøkt om BP fremmet translokasjon av GADD153 /CHOP protein til kjernen. GADD153 /CHOP nukleær translokasjon representerer bæring av spenning signal inn i kjernen, og dermed en funksjonell aktivering. Ved 12 timer etter 70 ug /ml BP behandling, GADD153 /CHOP var tilsynelatende mer rikelig i kjernen av BP-behandlet LNCaP og PC-3 celler enn i det av kontroller (fig. 5A og B).
(A) LNCaP-celler og (B) PC-3-celler ble behandlet med 0,2% DMSO (kontroll) eller 70 ug /ml BP i 12 timer, fiksert og farget med anti-GADD153 /CHOP. FITC-merket sekundært antistoff ble anvendt (grønn fluorescens) Kjerner ble farvet med DAPI (blå fluorescens). Bilder ble tatt til fange av en confocal lasermikroskop.
Rollen ER stress i BP-mediert anti-spredning
Vi brukte ytterligere en siRNA tilnærming for å avgjøre hvilken rolle GADD153 i anticancer potensialet for BP i prostatakreft. LNCaP-celler ble transfektert med sirnas for GADD153 og IRE1-α, respektivt, med eller uten etterbehandling av 70 ug /ml BP i 48 timer. Western blot-analyse viste at transfeksjon av Si-GADD153 /CHOP resulterte i undertrykkelse av GADD153 /CHOP ekspresjon indusert av BP i LNCaP-celler, sammenlignet med celler transfektert med kontroll egge siRNA (Fig. 6A). Celledød indusert av BP behandling ble reddet av 21,18% i celler transfektert med GADD153 /CHOP siRNA i forhold til egge siRNA-transfekterte celler (Fig. 6B). Siden GADD153 /CHOP genpromoteren inneholder bindingsseter for alle de viktigste indusere av UPR, og bare IRE1-α ble indusert etter BP behandling (fig. 4), karakterisert vi videre rollen til IRE1-α i BP-indusert cellevekst arrestere og celledød. Vi forstummet IRE1-α uttrykk ved å si-IRE1-α transfeksjon før 70 ug /ml BP behandling. Som vist på fig. 6C, IRE1-a siRNA vesentlig blokkert IRE1-α protein ekspresjon indusert av BP behandling på en doseavhengig måte. I tillegg ble GADD153 /CHOP også undertrykkes av IRE1-α siRNA transfeksjon. MTT-analysen viste at 11,67 og 20,8% av celledød ble inhibert med 20 og 50 nM IRE1-a siRNA transfeksjon etter eksponering av celler til 70 ug /ml BP, henholdsvis (fig. 6D). Tatt sammen, disse resultatene indikerte at BP-indusert celledød kan være involvert, i det minste delvis, gjennom induksjon av ER stress og oppregulering av IRE1-α og GADD153 /CHOP proteinene uttrykket.
( A) LNCaP-celler ble transfektert med krafse siRNA (
#), 20, eller 40 nM GADD153 siRNA, henholdsvis i 48 timer ved hjelp av RNAifect transfeksjon reagens. Etter 24 timers behandling med 70 ug /ml BP, ble utført western blot-analyse for GADD153. (B) BP-induserte anti-proliferativ aktivitet ble målt med MTT-analyse i LNCaP-celler transfektert med krafse siRNA (
#) eller 20 nM GADD153 siRNA i 48 timer og deretter behandlet med 70 ug /ml BP i 24 timer. Data er uttrykt som middel ± S.D. fra tre uavhengige eksperimenter. ***,
P
0,001. (C) LNCaP-celler ble transfektert med krafse siRNA (
#), 20, eller 50 nM IRE1-a siRNA, henholdsvis i 48 timer ved hjelp av RNAifect transfeksjon reagens. Etter 24 timers behandling med 70 ug /ml BP, ble utført Western blot-analyse for IRE1-α og GADD153, respektivt. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. (D) BP-induserte anti-proliferativ aktivitet ble målt med MTT-analyse i LNCaP-celler transfektert med krafse siRNA (
#), 20, eller 50 nM IRE1-a siRNA, henholdsvis i 48 timer og deretter behandlet med 70 ug /ml BP i 24 timer. Data er uttrykt som middel ± S.D. fra tre uavhengige eksperimenter. ***,
P
. 0,001 versus kjøretøy
Rollen MAPK på BP-indusert ER stress og celledød
Aktivering av MAPKs har vært implisert i reguleringen av ER-spenning indusert celledød. Vi undersøkte effekten av BP på MAPK-aktivering. Eksponering av LNCaP og PC-3-celler og 70 ug /ml BP resulterte i fosforylering av JNK og ERK 1/2 1/2, men ikke p38 MAPK (Fig. 7A og B). ERK-fosforylering etter 1/2 BP behandling forekom på 10 min og nedregulering skjedde ved 30 min. Tvert imot, fosforylering av JNK 1/2 opprettholdt ved 10 til 180 min. For ytterligere å karakterisere rollen JNK 1/2 i BP behandling, forstummet vi JNK 1/2 uttrykk av spesifikke siRNA transfeksjon. Som vist på fig. 7C, JNK 1/2 uttrykk og fosforylering etter BP behandling reduseres ved si-JNK transfeksjon. I tillegg BP-indusert ekspresjon av IRE1-α og GADD153 også reduseres ved si-JNK transfeksjon. BP-indusert celledød ble reddet av Si-JNK transfeksjon, sammenlignet med egge siRNA transfeksjon (siRNA1: 26,14%, siRNA2:. 20,95%, figur 7D). Disse funnene antyder at JNK-aktivering er involvert i BP-indusert celledød og deltar i IRE1-α og GADD153 aktivering.
(A) LNCaP-celler og (B) PC-3-celler ble behandlet med 70 ug /ml BP i de angitte tidsrom. Fosfo-ERK1 /2, total ERK1 /2, fosfo-JNK1 /2, total JNK1 /2, fosfo-p38, og total p38 ble påvist ved western blotting henholdsvis. (C) LNCaP-celler ble transfektert med krafse (
#) eller 20 nM JNK1 /2 siRNA i 48 timer ved hjelp av RNAifect transfeksjon reagens. Etter behandling med 70 ug /ml BP i 24 timer ble utført Western blot-analyse for fosfo-JNK1 /2, total JNK1 /2, IRE1-α og GADD153. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. (D) BP-induserte anti-proliferativ aktivitet ble målt med MTT-analyse i LNCaP-celler transfektert med krafse (
#) eller JNK1 /2 siRNA i 48 timer og deretter behandlet med 70 ug /ml BP i 24 timer. Data ble uttrykt som middel ± S.D. fra tre uavhengige eksperimenter. ***,
P
. 0,001 versus kjøretøy
BP hemmer veksten av kreftceller i LNCaP-NOD-SCID xenograft
For å vurdere antitumor aktivitet BP
in vivo
, ble human prostatakreft xenograft etablert ved subkutan injeksjon av 5 × 10
5 LNCaP celler i rygg subcutaneous vev av NOD-SCID mus. Som vist på fig. 8A, den relative tumorvolum hos mus behandlet med 500 mg /kg FP var betydelig 68% lavere enn de bæremiddelbehandlede kontrollmus på dag 18. Tumorvekt var signifikant redusert 56% i BP-behandlede gruppe sammenlignet med kontrollgruppen på dag 18 (fig. 8B). Tumorene i kontrolldyrene ble gradert som Gleason 5B siden ingen kjertelvevet ble funnet (Fig. 8C). I BP-behandlede dyr, ble uregelmessige smeltet kjertler observert og ble iscenesatt Gleason 4A (Fig. 8D). Således grader av tumor differensiering av BP-behandlede gruppen var bedre enn kontrollgruppen. Dessuten, oppregulering av GADD153 /CHOP i BP-behandling tumoren ble observert ved immunhistokjemi farging (fig. 8E og F) og western blot analyse (Fig. 8G), respektivt. Caspase-3 aktivering ble også observert i BP-behandling tumor (fig. 8G). Det var ingen signifikante forskjeller i kroppsvekt i både kontroll og BP-behandlede grupper. Resultatene indikerte at BP-indusert prostata kreft celledød ble korrelert med ER stress
in vivo
.
(A) NOD-SCID mus ble injisert med ca 5 × 10
5 LNCaP celler i den dorsale subkutane vev. Når tumoren nådde 100-250 mm
3, LNCaP tumorbærende mus ble administrert s.c. med bærerkontroll (▪) eller 500 mg /kg FP (•) på dager 0-4 i 5 dager. De relative tumorvolumer av kontroll og BP-behandlede grupper ble vist som middel ± S.D. av tumorvolumet ved hvert tidspunkt. (B) Svulster av kontroll og terapeutiske grupper ble fjernet og veid på dag 18. Gjennomsnittlig tumorvekt fra BP-behandlede gruppen var 56% mindre enn kontrollgruppen. Data ble uttrykt som middel ± S.D. av tumorvekt av kontrollgruppen og BP-behandlede grupper. **
P
0,01. (C, D) Tumor vevssnitt med HE-farging av kontroll (C) og behandlingsgrupper (D) .GADD153 uttrykk ble immunhistokjemisk identifisert i kontrollen (E) og den BP-behandlede gruppe (F). De GADD153-positive celler ble farget brun. Uttrykk for GADD153 og aktiv form caspase-3 i LNCaP xenograft svulstvev ble oppregulert etter BP administrasjon i forhold til å kontrollere gruppen av western blotting-analyse (G).
Diskusjoner
noen lovende naturlig forekommende kosttilskudd terapeutiske forbindelser inkluderer resveratrol, curcumin, genistein, diallyl sulfide og andre stoffer som har til felles evne til å indusere apoptose av kreftceller har blitt utnyttet [15]. I våre tidligere studier, viste vi at BP handle sterkt mot glioblastom multi (GBM) hjernesvulster og leverkreft (HCC) svulster
in vitro Hotell og
in vivo product: [5], [6] [16]. Imidlertid har effekten av BP på menneskelig prostata kreft celler ikke fastslått. Resultatene fra denne studien viste at BP er cytotoksisk for de tre ulike prostatakreftcellelinjer. Fordi begge androgen-avhengige og-Uavhengig prostatakreftceller viste lik følsomhet for BP behandling, ble involvering av androgen vei ignorert i denne studien.
Tapet av cellesyklus regulering er kjennetegnet av kreft. For å utforske mekanismene stod for effekten av BP på prostatakreftceller, ble cellesykluser overvåket. BP-indusert cellesyklus-stans ble bevist ved oppregulering av p16, p21 og p27, og nedregulering av CDK2 og cyclin D1. De P16, P21 og P27 proteiner er CDK-hemmere som negativt regulerer CDK eller cyclin /CDK komplekse [17]. Den p16 protein, medlem av INK4 familien, binder seg til CDK4 /6 for å blokkere kinase aktiviteten på mid-G1 fase [18]. The p21 (cip1) og p27 (kip1) proteiner bindes til cyklin /CDK-komplekset, hvilket resulterer i inhibering av G1 til S-fasen overgang til ved oppheving av Rb-fosforylering av cyklin /CDK-komplekset [19]. Således bør reduksjonen av fosforylert Rb være på grunn av en BP-utløst ekspresjon av CDK-inhibitorer, som i sin tur reduserer aktiviteten av cyclin /CDK-komplekset. Hyppig aktivering av Akt signalveien har blitt rapportert i mange menneske kreft [20], [21], og GSK-3β har blitt identifisert som en av de Akt sin molekylære mål. Akt inaktiverer GSK-3β kinase aktivitet gjennom stedsspesifikk fosforylering på Ser9 [22]. Undertrykkelse av Akt som fører til de-fosforylering og aktivering av GSK-3β årsak fosforylering av cyclin D1 ved Thr286 og den etterfølgende proteasomal degradering [23]. Cyclin D1 har vist seg å være overuttrykt i mange kreftformer, inkludert bryst, hode og nakke, spiserør og prostata [24]. I denne studien fant vi at BP er i stand til å hemme Akt aktivering ved å redusere Ser473 fosforylering, og gjenoppretter GSK-3β kinase aktivitet ved å redusere Ser9 fosforylering i prostatakreftceller. Disse dataene tyder på at BP undertrykker prostatakreftceller spredning via cellesyklus arrest ved å regulere cyclin /CDK /CKI cellesyklus regulatorisk protein og målretting Akt-GSK-3β-cyclin D1 signale aksen.
For å undersøke den underliggende molekylære mekanismer av BP-indusert prostata kreft celler død, undersøkte vi de BP-induserte endringer i genuttrykk i menneskelige prostata kreft celler ved hjelp av en oligodeoksynukleotid-baserte mikromatrise screening analysen. Flere gener som viser større enn to ganger økning i uttrykk på 24 timer av BP behandling ble identifisert (tabell 1). GADD153 /CHOP viste dramatisk 11.89 folder økning på uttrykk etter BP behandling. GADD153 /CHOP er et gen av interesse som det er involvert i ER stress-mediert apoptotiske reaksjonsvei. Aktivering av UPR spiller en beskyttende rolle til cellene under ER stress [26]. Imidlertid kan langvarig aktivering av UPR ved overdreven ER stress omdanne dens rolle til cytotoksiske ved aktivering av flere apoptotiske baner i pattedyrceller [27]. De ER stress svingerproteiner ATF6, IRE1-a og ekstra fordel utgjør kjernen spenning regulator av UPR, og transduce signaler fra ER til cytoplasma og cellekjernen etter ER stress [28] – [30]. I vår studie, BP indusert bare IRE1-α aktivisering, men ikke ATF6 eller p-eIF2α i prostatakreftceller. Økende og opprettholde uttrykk for IRE1-α og dens nedstrøms mål GADD153 /CHOP etter BP behandling ble observert i tids- og doseavhengig måte. En av de mekanismer som er implisert i GADD153 /CHOP-mediert apoptose er oksidativt stress [31]. Oksidasjon av ER lumen er indusert av GADD153 /CHOP nedstrøms target ERO1-la-. ERO1-metyleter av la har vært spekulert på å hyperoxidize ER lumen, og bevirker cytotoksiske reaktive oksygenarter (ROS) produksjon som fører til celledød. En annen mekanisme var forbundet med rollen som Bax i GADD153 /CHOP indusert apoptose. I ER-stress-indusert kardiomyocytt aopotosis, Bax øke med ER stress i en GADD153 /CHOP-avhengig måte [32]. Bax og Bak også modulere UPR av en direkte interaksjon med IRE1-α, og er viktig bindeledd mellom IRE1-α mediert ER-stress-indusert apoptose. Våre resultater viste at transfeksjon av sirnas for IRE1-α eller GADD153 /CHOP trykkes BP-indusert celledød. Samlet utgjør disse funnene tyder på at BP kan modulere ER stress-mediert apoptose av menneskelige prostata kreft celler gjennom aktivering av IRE1-α-GADD153 /CHOP signalveien.
Behandling med BP utløst økt uttrykk for Fas, noe som førte til aktiveringen av caspase-8 og -3 i ondartet hjernesvulst i vårt tidligere studium [5]. Fas overekspresjon også økt på 3 timer etter BP behandling. Således BP-indusert apoptose av humane prostata-cancerceller kan bli mediert i det minste delvis, ved døden reseptor apoptose svei.
Videre aktivering av MAPK har vært implisert i regulering av genekspresjon i ER stress signale kaskade og er involvert i mange aspekter av kontroll av cellulær proliferasjon og apoptose. JNK-reaksjonsveien har også vist seg å være en positiv regulator av ER stress indusert apoptose [33]. I vår studie ble fosforylering av JNK observert etter BP behandling. Inhibering av JNK-ekspresjon ved siRNA førte til nedregulering av IRE1-α og GADD153 /CHOP, og delvis reddet BP-indusert celledød. ER stress-aktiverte IRE1-α binder adapteren proteinet tumor nekrose faktor reseptor-assosiert factor2 (TRAF2), et E3 ubiquitin ligase, som i sin tur aktiverer apoptose signal regulerende kinase 1 (ASK1, også kjent som MAP3K5), fører deretter JNK aktivering. Disse funnene implisere den oppfatningen at BP-indusert ER stress-medierer celledød via samarbeid med JNK veien.
Tumor nekrose faktor relatert apoptose inducing ligand (TRAIL) er en død ligand som kan fortrinnsvis initiere apoptose i forskjellige tumorceller. Nylig, TRAIL-basert terapi, inkludert TRAIL genterapi, rekombinant TRAIL og TRAIL-reseptor-agonistiske antistoffer taste kliniske studier [34] – [37]. Imidlertid, i likhet med mange andre typer kreft, prostatakreft utvikle resistens mot TRAIL [38], [39]. Derfor søker for TRAIL sensibilisatorer er i stand til å overvinne TRAIL motstand i kreftceller er verdifulle. LNCaP er kjent for å være resistente mot TRAIL-fremkalt apoptose assosiert med fravær av PTEN som fremmer konstitutiv aktivering av AKT /PI3K pathway. Siden BP effektivt svekket Akt aktivitet ved å redusere nivået av fosfor-Akt Ser473, noe som gjør BP en kandidat TRAIL allergen.
I konklusjonen, vår studie viste at BP 1) forårsaker prostatakreft cellesyklus arrest i G0 /G1 fase ved å målrette den Akt-GSK-3β-cyclin D1 signale aksen; 2) induserer celledød via ER-stress-og JNK-mediert UPR; 3) utløser apoptose av menneskelige prostata kreft celler gjennom flere apoptotiske veier
in vitro Hotell og
in vivo plakater (Fig. 9).
BP induserer apoptose i menneskelig prostata kreft celler gjennom flere apoptotiske baner, inkludert G0 /G1 fase cellesyklus arrest, død receptor sti og ER stress-avhengige veien.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC kulturer~~POS=HEADCOMP og reagenser
humane prostatacellelinjer LNCaP og PC-3 ble ervervet fra ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA), og dyrket i RPMI 1640 medium med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 U /ml streptomycin, 1% natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin (alle disse reagenser er fra Invitrogen, Carlsbad, CA) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO2.
