Abstract
De mitotiske kinesin-5 motor proteiner tverrbinding og glir fra hverandre antispin mikrotubuli, og dermed utfører viktige funksjoner i mitotiske spindel dynamikk. Spesifikk hemming av deres funksjon ved monastrol lignende små molekyler er undersøkt i kliniske studier som kreft behandling, med bare delvis suksess. Således er strategier som forbedrer effektiviteten av monastrol lignende anticancer legemidler nødvendig. I denne studien undersøkte vi sammenhengen mellom følsomhet for monastrol og forekomst av mitotisk glidning i flere humane cellelinjer. Vi fant at graden av følsomhet for monastrol, fra mest følsomme for minst følsom, er: AGS HepG2 Lovo Du145≥HT29. Vi viser korrelasjon mellom følsomheten for en spesiell celle-linje for å monastrol og tendensen av den samme celle-linje for å gjennomgå mitotisk glidning. Vi fant også at i de monastrol motstandsdyktig HT29 celler, langvarig monastrol behandlinger øke mRNA og protein nivåer av kromosom passasjer protein Survivin. I kontrast er Survivin nivåene ikke økte ved denne behandling i monastrol-sensitive AGS-celler. Vi viser videre at over-uttrykk for survivin i monastrol-sensitive AGS celler reduserer mitotisk glidning og øker motstanden mot monastrol. Til slutt viser vi at i løpet av kort eksponering for monastrol, Si RNA Slå av survivin uttrykk reduserer celleviabilitet i både AGS og HT29 celler. Våre data tyder på at effektiviteten av anti-kreft behandling med spesifikke kinesin-5 hemmere kan forbedres ved modulering av uttrykket nivåer av survivin
Citation. Asraf H, Avunie-Masala R, Hershfinkel M, Gheber L ( 2015) Mitotisk slippage og Expression of survivin er knyttet til forskjellig sensitivitet of human Cancer Cell-Lines til kinesin-5 hemmer Monastrol. PLoS ONE 10 (6): e0129255. doi: 10,1371 /journal.pone.0129255
Academic Redaktør: Qiliang Cai, Fudan University, Kina
mottatt: May 16, 2014; Godkjent: 06.05.2015; Publisert: 02.06.2015
Copyright: © 2015 Asraf et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av oppstartsfond, det helsevitenskapelige fakultet, Ben-Gurion-universitetet i Negev, tildelt MH og LG; av den israelske Science Foundation bevilgning 165/2013 Awarder til LG (https://www.isf.org.il/english/) og den israelske Science Foundation gi no. 891/2014 tildelt MH (https://www.isf.org.il/english/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
De mitotiske kinesin-5 motor proteiner (BIMC /Kif11 /EG5 /N-2) utføre konserverte funksjoner i mitotiske spindel dynamikk. Oppdaget i begynnelsen av 1990, disse var de første kinesins som mitotiske roller er påvist i en rekke organismer [1-5]. Kinesin-5 motors funksjon som homotetramers med to par av katalytiske domener motor plassert på motsatte sider av en manuallignende tetramere kompleks [6, 7]. Ved denne bipolar struktur, kan kinesin-5 motorer crosslink og glir fra hverandre antiparallellforbundne spindel mikrotubuli [8-11], og dermed utføre sine funksjoner i spindelenheten [1-5] og anaphase spindelforlengelse [12-19].
Det humane kinesin-5 HsEg5 er overuttrykt i en rekke forskjellige faste tumorer, noe som tyder på dets rolle i tumorgenese [20, 21]. På grunn av de grunnlegg mitotiske funksjoner av kinesin-5 motorer i spindel dynamikk, og fordi mitose er en akseptert cellesyklus-fase for anti-kreft-intervensjon [22, 23], ble det generelt antatt at spesifikke hemmingen av kinesin-5-motorer kan tjene som et potensielt anti-cancer behandling. Monastrol var det første rapporterte spesifikk hemmer av humant kinesin-5, identifisert i en skjerm for små molekyler som forårsaket mitotisk arrest uten å påvirke mikrotubulidynamikk og andre cellulære funksjoner [24]. Siden oppdagelsen av monastrol, ble flere titalls molekyler rapportert som allosteriske inhibitorer av HsEg5, med variabel potenser [23, 25]. De fleste av disse molekyler er spesifikke for det humane HsEg5 fordi de bindes til et allosterisk område, løkke 5 i det katalytiske domene av kinesin-relaterte motorer (oversikt i [23, 26, 27]), som varierer i lengde og sekvens blant kinesin homologer [28, 29]. Menneskelige celler behandlet med monastrol og monastrol lignende molekyler arrest i mitose med skadet monopolar spindler [24, 30] og gjennomgå mitotisk celledød [31]. I noen tilfeller monastrol behandlede celler er funnet i en G1-lignende fase på grunn av mitotisk glidning [32]. Det sistnevnte fenomen tillater celler å gå videre til det neste G1 fase uten å dividere deres DNA i nærvær av spindelskade (gjennomgått i [33, 34]). Etter mitotisk glidning, kan cellene dør av apoptose forårsaket av en bestemt kontrollpost som overvåker DNA innhold av celler som exit mitose, kjent som «tetraploidy sjekkpunkt» [33, 35].
Flere konkrete HsEg5 hemmere har angitt kliniske studier som cytostatika [36-38]. På tross av den reproduserbar cytotoksisk effekt i vevskulturer, disse kliniske studier begrenset suksess (oversikt i [27, 39]). En av de foreslåtte årsakene til denne ineffektivitet er ufullstendig kjennskap til mitotisk stopp trasé og, som et resultat av manglende evne til å identifisere molekylære komponenter som kan være rettet i tillegg til kinesin-5-inhibitorer for å forbedre effektiviteten i anticancerbehandling [27, 39] .
for å løse dette problemet, i denne studien undersøkte vi følsomheten til monastrol og forekomst av mitotisk glidning i flere humane cellelinjer. Vi har funnet at det er en sammenheng mellom følsomheten for en spesiell celle-linje for å monastrol og tendensen av den samme celle-linje for å gjennomgå mitotisk glidning. Vi videre undersøkt uttrykk for survivin, en anti-apoptotiske kromosom passasjer protein som har vist seg å ha flere mitotiske roller (anmeldt i [40-43]). Vi har funnet at behandling med monastrol induserer økt ekspresjon av Survivin i monastrol-resistente celler, men ikke i celler som er monastrol-sensitive. Konsekvent, viser vi at over-uttrykk for survivin i monastrol-sensitive celler redusert mitotisk glidning og økt monastrol-motstand. Til slutt viser vi at delvis stanse av survivin uttrykk ved Si RNA reduserer celleviabilitet etter kort eksponering for monastrol. Dermed våre data tyder på at kombinert hemming av HsEg5 og modulering av survivin uttrykk kan forbedre styrken av kreft behandling av kinesin-5 hemmere.
Materialer og metoder
Cell kultur, levedyktighet, transfeksjon, og monastrol behandling
AGS og LoVo-celler ble dyrket i DMEM /F-12 (HAM) 1: 1, HT29-celler i DMEM, Du145 celler i RPMI 1640 supplementert med 1% natriumpyruvat, og HepG2-celler i MEM -Eagle Earles medium. Alle media ble supplert med 10% føtalt kalveserum, 2 mM L-glutamin og 1% antibiotisk-antimykotisk oppløsning inneholdende 10 enheter /mL penicillin, 10 ug /mL streptomycin og 1250 enheter /ml nystatin. Medie reagenser ble kjøpt fra Beit HaEmek, Israel. Cellelevedyktigheten ble undersøkt ved anvendelse av natrium-2,3-bis- (2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide salt (XTT, Sigma, Israel), etter en standard prosedyre [44] eller ved Trypan blå analyse [30]. For levedyktighet eksperimenter, opp til 3 dager ved hjelp av XTT analysen, ~ 4×10
3 celler ble sådd per brønn i 96-brønners plater. Antall celler i nærvær av monastrol ble normalisert til antall celler i nærvær av DMSO bare. For eksperimenter med 12 og 24 monastrol behandling, ~ 1.5×10
5 celler per brønn ble sådd ut i 24-brønners plater. Behandling med monastrol ble utført 24 timer etter plettering, og på dette tidspunkt 70-80% konfluens ble oppnådd. Plasmider uttrykker GFP-merket survivin og GFP vektor bare var en gave fra Dr. Dario C. Altieri [45]. Cell transfeksjon ble utført ved hjelp av JetPEI transfeksjon reagens (Polyplus transfeksjon, Tal Ron, Israel). Stabil transfeksjon ble oppnådd ved å dyrke celler i medium inneholdende G418 3 mg /ml (Sigma, Israel) i flere uker til 80% av cellene inneholdt GFP fluorescenssignal. Monastrol (Tocris, UK) konsentrasjoner er angitt for hvert eksperiment. For sammenligning mellom monastrol følsomme AGS og monastrol bestandig HT29 celler, ble ulike konsentrasjoner av monastrol brukes for å oppnå sammenlign fenotyper: 100 pm og 150 pm av monastrol for AGS og HT29 celler, henholdsvis. Basert på figur 1, ville lav konsentrasjon av monastrol har ført til manglende virkning på HT29-celler, mens høy konsentrasjon av monastrol ville ha resultert i død av AGS-celler, begge tilfelle ikke tillater analyse av fenotype. Kontroll eksperimenter ble utført i nærvær av DMSO.
Celler fra AGS, HepG2, Lovo39, Du145, og HT29 cellelinjer, antydet i nedre venstre hjørne av hvert panel, ble inkubert i opp til tre dager med ulike konsentrasjoner av monastrol, vist på høyre side (0, 20, 50, 100 og 150 pm). Antall levedyktige celler (% av kontroll) ble bestemt ved XTT-assay for mitokondriell aktivitet. Poeng og barer representerer et gjennomsnitt og SEM av 3-4 uavhengige eksperimenter. * P 0,05: antall levedyktige Du145 celler etter 2 dagers behandling med 20 eller 50 uM monastrol, sammenlignet med levedyktige HT29-celler som ble behandlet identisk (rød og blå sirkler). Resultatene tyder på at de ulike cellelinjer er ulikt følsomme for monastrol, med følsomhet rangering: AGS HepG2 Lovo Du145≥HT29
farging
For å visualisere microtubule cytoskjelettet. og DNA, celler ble dyrket på dekkglass, fiksert med 4% paraformaldehyd i 30 minutter, og permeabilisert i 2 minutter med 0,3% Triton-X-100 i 4% paraformaldehyd. Prøvene ble vasket med PBS inneholdende 0,1% BSA (Sigma, Israel). Dekkglass ble inkubert med rotte-anti-tubulin YOL1 /34 og deretter med Alexa 488-konjugert anti-rotte-sekundært antistoff. DNA ble farget med DAPI (0,07 ug /ml). Celler ble observert med en Olympus BX51 mikroskop.
Cell syklus analyse
Floa og tilhenger cellene fiksert med 70% etanol og lagret i -20 ° C i minst 7 dager. Celler ble oppsamlet ved sentrifugering og resuspendert i 0,1% Triton-X-100 og 30 pg /ml RNase A type I-A (Sigma, Israel) ved romtemperatur i 40 min. Nukleær DNA ble farget med 15 ug propidium-jodid i PBS-oppløsning, og DNA-innhold ble målt ved flow-cytometri (BD Biosciences, UK). Celle proporsjoner i sub-G0 /G1, G0 /G1, S og G2 /M-fasene ble analysert ved hjelp av passende programvare. For hver prøve ble 10.000 celler scoret.
mRNA analyse
Nivåer av cyclin B, Survivin, og aktin som referanse genet ble bestemt av real time PCR (RT-PCR) av total RNA ekstrahert fra celler behandlet med monastrol. Totalt RNA ekstraksjon ble utført med RNeasy Mini Kit (Qiagen, Tyskland), med DNAse (Qiagen, Tyskland) behandling for å sikre fjerning av genomisk DNA. CDNA-templat ble fremstilt med 1 ug RNA prøver, ved hjelp av Verso cDNA Synthesis Kit som beskrevet av produsenten (Thermo Scientific). For kvantitativ real time PCR, ble maler fortynnet 1:16 og utsatt for Taqman sanntid PCR prosedyren med den absolutte blå QPCR kit (Thermo Scientific). Primere og prober (Solaris) for PCR-amplifisering og produktstørrelse var som følger: Survivin (95 bp) forover primer 5′-TTTCTCAAGGACCACCGCAT-3 «, revers primer 5′-ATGAAGCCAGCCTCGGCCAT-3′, 5»-probe CACCCCGGAGCGGATGG-3 «; Cyclin B (86 bp) forover primer 5»-ATCTGAGACAACTTGAGGAAG-3 «, revers primer 5′-GATGGCTCTCATGTTTCCAG-3′, 5»-probe GGTCGGGAAGTCACTGG-3 «; Actin (134 bp) forover primer 5»-TGGAGAAAATCTGGCACCAC-3 «, revers primer 5′-GGTCTCAAACATGATCTGG-3′, 5»-probe ACCGCGAGAAGATGACC-3 «. Reaksjoner ble utført i ABI-PRISM7500 sekvensdetektoren (Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland). Standard sykkelforholdene for dette instrumentet ble brukt. Glødetemperatur var 60 ° C for alle genene. For hver prøve ble nivåene av cyclin B og Survivin normalisert til referanse genet (aktin) nivåer. Real-time PCR resultatene representerer et gjennomsnitt av tre ulike eksperimenter
Protein nivå analyse ble utført ved hjelp av Western blot (WB) prosedyre som tidligere beskrevet [30], ved hjelp av anti human survivin antistoff (R monastrol ble brukt 24 timer etter plating. -Celler ble transfektert med siSurvivin eller en kryptert (SC) siRNA konstruksjon (40nm, Sigma-Aldrich), ble siRNA transfeksjon utført ved anvendelse av lipofektamin 2000 reagenset i henhold til produsentens protokoll. Målsekvensen av Survivin for siRNA var: 5 «GGACCACCGCAUCUCUACA 3» eller kryptert 5 «GCCCAGAUCCCUGUACGU 3». 12h og 24h etter transfeksjon cellene ble telt ved hjelp av trypanblått.
Statistisk analyse
Kolonner og barer i alle tallene representerer gjennomsnitt ± SEM. Betydningen av forskjellene mellom gjennomsnittsverdier ble bestemt ved hjelp av Student
t
-test. * P 0,05; ** P 0,01
Resultater
For å undersøke hvilke faktorer som påvirker følsomheten av forskjellige celler til monastrol, først preget vi denne følsomheten i fem forskjellige cellelinjer. AGS fra magen adenokarsinom [46 ], HepG2 fra leverkreft [47], LoVo fra colon adenokarsinom [48], Du154 fra prostata kreft [49], og HT29 fra colon adenokarsinom [50]. Celler ble utsatt for langvarig behandling med monastrol av opp til tre dager. Ved hvert tidsintervall ble antall levedyktige celler undersøkt ved hjelp av mitokondriell aktivitet analyse ved bruk av 2,3-bis- (2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide salt (XTT) [44 ]. Våre resultater tyder på at, som forventet, antallet levedyktige celler ble redusert etter langvarig behandling med monastrol i alle cellelinjer. Imidlertid er prosentandel av levedyktige celler i de forskjellige cellelinjer etter behandling med monastrol variert. For eksempel, behandling med 100 uM av monastrol i to dager resulterte i ~ 80% reduksjon i antall AGS og HepG2-celler, ~ 60% reduksjon i antallet av LoVo-celler, og bare ~ 30% reduksjon i Du145 og HT29-celler (figur 1, grønne sirkler). Vi har også funnet en liten, men reproduserbar forskjell mellom levedyktigheten til Du145 og HT29 celler behandlet med monastrol. For eksempel: prosenten av levedyktige Du145 celler behandlet med 20 eller 50 uM monastrol i 2 dager, er betydelig mindre enn for de som ble behandlet identisk HT29-celler. Basert på levedyktighet data (Fig 1), etablerte vi rang av følsomhet for monastrol, fra mest følsomme for minst følsom, som:. AGS HepG2 Lovo Du145≥HT29
Mitotisk glidning er et fenomen av som i nærvær av mitotisk skade cellene fortsette til G1 fase av den neste syklus uten å dividere deres DNA [31, 33, 34, 51]. Vi neste undersøkt om motstanden i en bestemt cellelinje for å monastrol er relatert til dets tendens til å gjennomgå mitotisk glidning i nærvær av medikamentet. For å karakterisere mitotisk glidning, behandlet vi cellene med monastrol for 48t ved konsentrasjoner som resulterte i minst celle overlevelse, og undersøkes morfologi microtubule cytoskjelettet ved farging (Fig 2A og 2B) og cellesyklus distribusjon av flowcytometri (Fig 2C). -Celler stanset i mitosen ved monastrol har tidligere blitt vist å oppvise monoastral spindler [24, 30]. Vi har funnet at etter 48 timer monastrol behandling to hoved morfologier av cellene var tydelige: G1 lignende eller monoastral mitotiske celler (figur 2A). Antallet av normale mitotiske celler eller celler med uidentifiserte morfologi var ubetydelig. Våre resultater viser at etter 48 timer behandling med monastrol, de forskjellige cellelinjer oppviste forskjellige prosentandeler av celler med monoasters. For eksempel, de fleste overlevende AGS celler fremsto som G1-like store celler med enkle kjerner (Fig 2A). Prosentandelen av monoasters i disse cellene var meget liten, ~ 7% (figur 2B). Vi har funnet at både AGS og HepG2-cellelinjer som er følsomme overfor monastrol, oppviste en liten prosentandel av monoasters ( 10%) og en stor andel av G1-lignende celler, etter 48t monastrol behandling (figur 2B). På den annen side, LoVo, Du145, og HT29-cellelinjer, som er mer motstandsdyktig mot monastrol, oppviser betydelig større prosentandeler, 20-30%, av monoastral spindler (figur 2B), hvilket indikerer at et stort antall av disse cellene blir arrestert i mitose. Analyse av cellesyklus-fase distribusjon viste at etter 48 timer behandling med monastrol, til tross for forskjellen i andelen av mitotiske celler med monoasters, alle undersøkte cellelinjer inneholdt en stor andel av celler med dobbelt DNA-innhold (figur 2C, dobbeltpilen ). Dette indikerer at selv om noen av cellene først med typiske G1-lignende mikrotubul cytoskjelett, hadde cellene fordoblet DNA-innhold, dvs. at de gjennomgikk mitotisk glidning uten DNA divisjon. Våre resultater tyder derfor på at det er en sammenheng mellom følsomhet for monastrol og tendensen til å gjennomgå mitotisk glidning. Monastrol-resistente celler holde mitotisk arrest for lengre tid, mens monastrol-sensitive celler gjennomgå mitotisk glidning
(A AGS) og HT29-celler ble behandlet i 48 timer med 100 uM og 150 pm av monastrol, respektivt. Tubulin cytoskjelettet ble visualisert etter fiksering av farging, ble DNA farget med DAPI. Etter 48h av monastrol behandling, de fleste av AGS-celler vist som store, G1-lignende celler med en kjerne (gule piler), mens en høy prosentandel av HT29-celler ble stanset i mitosen som monoasters (grønne piler). (B) Virkning av langtidsbehandling med monastrol på prosentandelen av monoasters i de forskjellige cellelinjer, som vist nederst. Celler ble behandlet med monastrol, behandles for farging, og prosentandelen av monoasters ble bestemt ved å utføre 200-300 celler for hver cellelinje. Kolonner og barer representerer gjennomsnitt og SEM av 3 uavhengige eksperimenter, * P 0,05, sammenlignet med AGS celler. (C) Fordeling av celle-syklus faser ble bestemt ved strømningscytometri i fravær (kontroll) eller nærvær av monastrol. Cellelinjer som er vist på toppen. Enkle og doble piler representerer topper med 2n og 4n DNA innhold, respektivt.
Nedregulering av anti-apoptotiske protein Survivin ble tidligere vist å øke mitotisk glidning i nærvær av spindelen skade [52] . Vi dermed en hypotese om at i løpet av eksponering for monastrol, vil uttrykket av survivin variere mellom monastrol-sensitive og -resistente celler. For å teste denne hypotesen, sammenlignet vi mRNA og proteinnivåer survivin i monastrol bestandig HT29 celler og monastrol-sensitive AGS celler (fig 3). Slik tillater måling av endringer i proteinnivå før apoptose [30], behandlet vi cellene med monastrol for kortere tid, 12 timer og 24 timer. For å vurdere den mitotiske status av de undersøkte cellene, fulgt vi mRNA (figur 3A) og protein (figur 3B og 3C) nivåer av proteinet mitotiske cyclin B. Vi har funnet at etter 24 timers behandling med monastrol HT29-celler utviser økte nivåer av cyclin B sammenlignet til 12 timer for behandling, noe som indikerer at de er stanset i mitosen (figur 3). På den annen side, i AGS-celler, cyklin B-nivåene ble øket allerede på 12 h av behandling med monastrol og cyclin B nivåer oppviste en tendens til å avta ved 24h, 0,05 P 0,1 (Fig 3). Dette tyder på at behandling med monastrol for 24 timer allerede forårsaker delvis mitotisk glidning i AGS celler mens HT29 cellene opprett mitotisk arrest. Undersøkelse av survivin mRNA (fig 3A) og protein (figur 3B og 3C) nivåer avdekket at i HT29 celler «nivåer av survivin økt på 24 timer behandling med monastrol, noe som tyder på at Survivin er involvert i å opprettholde mitotisk arrest. På den annen side, i de AGS celler mRNA-nivåer av Survivin uendret på 24 timer sammenlignet med 12 h behandling med monastrol. Videre, i de AGS cellene, gjennomsnittsproteinnivåer Survivin var lavere i 24 timer sammenlignet med 12 h av monastrol behandling, selv om denne forskjellen ikke statistisk signifikant (figur 3B og 3C, høyre panel). Disse resultatene tyder på at forhøyede nivåer av Survivin i en spesiell celle-linje er korrelert med motstanden av denne cellelinje til monastrol behandling.
HT29 og AGS-celler ble behandlet med monastrol i 12 timer og 24 timer og behandlet til mRNA analyse ved RT PCR (A) og proteinnivå analyse av WB (B og C). 150 pm og 100 uM monastrol ble brukt til HT29 og AGS celler, henholdsvis. I A og C, søyler og barer representerer gjennomsnitts og SEM verdier for 3-4 uavhengige forsøk. I hvert forsøk nivåer av cyclin B (til venstre) og Survivin (til høyre), indikert på toppen, i nærvær av monastrol ble normalisert til kontrollverdiene oppnådd med DMSO bare. * P 0,05; ** P 0,01; a-0,05 P 0,1 i forhold til 12h av monastrol behandling. (B) Representative WB analyse av cyclin B og Survivin protein ekspresjon i AGS (venstre) og HT29 (høyre) celler behandlet med monastrol i 12 timer og 24 timer, er angitt på bunnen. Lik protein lasting var følger av uttrykket av aktin (nedre paneler). (+) Monastrol; (-) DMSO
For å undersøke om forhøyet uttrykk nivåer av survivin direkte opprettholde vedvarende mitotisk arrest, vi tilført de monastrol følsomme AGS celler med et plasmid som koder for villtype survivin protein smeltet til GFP (. pSurvivin, [45]), og skapte en poly-klonal stabilt transfektert AGS cellelinje (se Materialer og metoder). GFP-uttrykkende vektor ble anvendt som en kontroll. AGS celler som uttrykker pSurvivin plasmid utstilt 5,2 ± 0,9 (SEM, n = 4) ganger økning i survivin uttrykk (Fig 4A, nederst). Etter dannelsen av stabilt-transfekterte cellelinjer, ble cellene behandlet med 100 uM monastrol og behandlet for tubulin immunofarging, levedyktighet, og cellesyklus-fordelingsanalyse (fig 4A-4D). Vi har funnet at etter 24 timers behandling med monastrol, prosentandelen av mitotiske celler arrestert med monoasters betydelig økt i Survivin-uttrykkende celler i forhold til AGS celler som uttrykker vektoren bare (figur 4A og 4B). Disse data indikerer at overekspresjon av Survivin øker evnen av AGS-celler for å opprettholde mitotisk stopp i nærvær av spindelskade indusert av monastrol. Analyse av cellesyklus-fase distribusjon indikerer at etter 12 timer behandling med monastrol, andelen av Survivin-uttrykkende AGS-celler med dobbel (4n) DNA-innhold er betydelig økt sammenlignet med celler som bare uttrykker vektoren (figur 4C, 12h), som indikerer at Survivin induserer vedvarende mitotisk arrest. Viktigere, etter 24 timers behandling med monastrol vi fant ingen forskjell i andel av cellepopulasjonen med 4n DNA innhold mellom cellene som uttrykker survivin og de som uttrykker vektoren bare (fig 4C, 24h). Likevel, etter 24 timers behandling med monastrol, var det en betydelig økning i antall celler med monoasters i Survivin-uttrykkende celler, og indikerer at cellene er i mitotisk stopp, sammenlignet med celler som bare uttrykker vektoren, som gjennomgikk mitotisk glidning og ble bestemt til celle død (figur 4A og 4B). Således våre data tyder på at i fravær av Survivin overekspresjon, AGS-celler gjennomgår mitotisk glidning og celledød etter behandling med monastrol, mens overekspresjon av Survivin induserer mitotisk stopp, sannsynligvis redde cellene. I tillegg, i samsvar med den foreslåtte anti-apoptotiske funksjon av Survivin [45, 53], har vi funnet at overekspresjon av Survivin i AGS-celler økte levedyktigheten til disse celler etter 24 og 48 timer behandling med monastrol (figur 4C).
(A-D) AGS-celler ble stabilt transfektert med et plasmid som uttrykker GFP (vektor) eller et plasmid som koder for overekspresjon av survivin-GFP (pSurvivin). Celler ble behandlet med 100 uM monastrol og behandlet for mikrotubuli-farging (A og B), cellesyklus-fordelingsanalyse (C), og levedyktighet test (D). (A) Representative bilder av mikrotubuli-cytoskjelettet i AGS celler som bærer en tom vektor eller pSurvivin, som vist nederst. Cellene ble behandlet med 100 uM monastrol for 24 timer. G1-lignende celler (gule piler) og mitotiske celler (grønn pil) er observert. Siden mitotiske celler er rund, er deres brennplan som er forskjellig fra de flate G1-lignende celler. Bilder i (A) er fokusert på G1 celler og derfor monoasters i mitose ikke er sett i disse bildene. Derfor mitotiske celler vises som lyse kuler (grønne piler). Nederst: Survivin WB analyse av prolifererende AGS-celler i nærvær (+) eller fravær (-) av pSurvivin overekspresjon plasmidet. (B) Kvantifisering av% av mitotiske celler, basert på bildene som vist i (A). bare grå-vektor; blå-pSurvivin. Kolonner og barer representerer gjennomsnitt og SEM av tre uavhengige eksperimenter der totalt 200-300 celler ble talt. ** P 0,01, sammenlignet med vektor bare. (C) stabilt-transfektert AGS-celler ble behandlet med monastrol i 12 timer og 24 timer (angitt på toppen) og behandlet for cellesyklus-fase fordelingsanalyse ved strømningscytometri. Enkle og doble piler representerer topper med 2n og 4n DNA innhold, henholdsvis. Tallene i parentes representerer prosentandelen av celler med dobbel (4n) DNA-innhold. (D) Levedyktigheten av stabilt transfekterte celler i nærvær av 100 uM monastrol i 24 timer og 48 timer. bare grå-vektor; Blue-pSurvivin. Antall levedyktige celler ble bestemt ved XTT-assay for mitokondriell aktivitet. Prosent av levedyktige celler ble beregnet i forhold til kontroll eksperimenter med DMSO bare. Kolonner og barer representerer gjennomsnittet og SEM av 3 uavhengige eksperimenter. * P 0,05, sammenlignet med vektor bare. (E) AGS og HT29 celler ble transient transfektert med survivin (mørk grønn) eller kryptert (SC, lys grønn) Si RNA sekvens. 12 timer etter transfeksjon AGS og HT29-celler ble behandlet med 100 og 150 pm monastrol, henholdsvis i 12 timer og 24 timer (angitt på bunnen). Levedyktighet av celler ble bestemt ved trypan blå. Prosent av levedyktige celler ble beregnet i forhold til kontroll eksperimenter med DMSO bare. Kolonner og barer representerer gjennomsnittet og SEM av 2-4 uavhengige forsøk preformed i tre paralleller. * P 0,05; ** P 0,01; a-0,05 P . 0,1, sammenlignet med egge Si RNA sekvens
For ytterligere å undersøke sammenhengen mellom celleviabilitet etter monastrol behandling og uttrykk for survivin, vi delvis forstummet survivin uttrykk ved Si RNA ( fig 4E). Egge RNA-sekvens tjente som en kontroll. Undersøkelse av mRNA-nivåer av Survivin ved RT PCR bekreftet at selv forbigående transfeksjon av egge RNA-sekvens forårsaket ingen endring i mRNA-nivåene av Survivin, transfeksjon med Survivin Si RNA forårsaket ~ 70%, og 50-60% reduksjon i Survivin mRNA-nivåer i AGS og HT29-celler, henholdsvis (ikke vist). Vi har funnet at etter 12 h fra eksponering til monastrol, delvis stanse av Survivin uttrykk forårsaket en reduksjon i levedyktighet av AGS og HT29-celler med 50-60%, sammenlignet med celler transfektert med det forvrengte RNA-sekvens (figur 4E). Mens monastrol-sensitive AGS-celler viste bare en tendens (0,05 P 0,1), den monastrol-resistente HT29-celler viste en tydelig signifikant reduksjon i levedyktighet etter delvis overlevende lyddemping (P 0,05), som indikerer at Survivin er nødvendig for levedyktighet og motstand mot monastrol. Etter 24 timer med behandling med monastrol ble levedyktighet monastrol-sensitive AGS celler ytterligere redusert i celler transfektert med survivin Si eller egge RNA (figur 4E). I de monastrol-resistente HT29-celler, delvis stanse av Survivin ekspresjon induseres en økt levedyktighet i forhold til det forvrengte RNA-sekvens, noe som indikerer at det er tilpasningsmekanismer i disse cellene til å delvis reduserte nivåer av Survivin. Tatt sammen, våre data tyder på at økende nivåer av Survivin løpet av mitotisk stopp er knyttet til cellenes levedyktighet, som er i det minste delvis er relatert til dens evne til å indusere forlenget mitotisk stopp ved behandling med monastrol.
diskusjon
studier løpet av det siste tiåret har vist at når cellene behandles med anti-mitotiske stoffer som kinesin-fem spesifikke hemmere, kan to hovedscenarier oppstå: celler kan enten opprettholde mitotisk arrest og dø av mitotisk apoptose [30, 31], eller gå videre til neste G1 fasen av mitotisk glidning og gjennomgår apoptose [33, 34]. I det sistnevnte tilfelle celler raskt dør av apoptose forårsaket av «tetraploidy checkpoint» [33, 35]. Ved dette scenariet vil celler som gjennomgår mitotisk glidning lettere i nærvær av monastrol bli utsatt for apoptose indusert av tetraploidy sjekkpunkt og dermed være mer følsomme for monastrol. Imidlertid tetraploidy sjekkpunkt ble funnet å være avhengig av proteinet p53 tumor suppressor [51, 54]. Således blir cellene forventes å være mer følsomme for monastrol hvis de gjennomgår mitotisk glidning og uttrykke et villtype p53. Faktisk er de cellelinjer som ble undersøkt i dette studiet uttrykker begge versjoner av p53-protein: p53 er villtype i AGS [55], HepG2 [56], og LoVo [57]-cellelinjer, mens det er mutert i HT29 [58] og Du145 [49] celler. Våre funn at graden av følsomhet for monastrol er AGS HepG2 Lovo Du145≥HT29 støtter ideen om at cellene vil være mer følsomme for kinesin-5 hemmere hvis de har en tendens til å gjennomgå mitotisk glidning og bære villtype p53-allelet. Tendensen til å gjennomgå mitotisk glidning per se ikke er direkte avhengig av p53 status siden lovo celler som bærer WT p53 [57] gjennomgå mitotisk glidning i samme grad som HT29 og Du125 celler, som bærer et mutert p53 [49, 58 ] (fig 2B og 2C). Likevel oppstår økt celledød i lovo cellene når WT p53 tillater aktivering av «tetraploidy sjekkpunkt».
Når mitotisk glidning oppstår i p53 muterte celler, celler fortsette med spredning uten riktig å dele DNA.
In vivo
, dette kan føre til opphopning av mutasjoner som reduserer cytotoksiske /anti-kreft aktivitet av kinesin-5 hemmere [22, 27, 39]. Derfor er et av de strategier for å øke effektiviteten til anti-mitotiske anti-kreft-medikamenter kan være for å indusere forlenget mitotisk stopp i krefttyper som uttrykker muterte versjoner av p53.
