Abstract
Emerging studier har indikert at microRNAs er involvert i utvikling og progresjon av kreft. Her fant vi at Mir-202-3p ble ofte nedregulert i mage kreft vev. Overekspresjon av MIR-202-3p i magekreftceller MKN-28 og BGC-823, markert trykkes celleproliferasjon og indusert celle apoptose både
in vitro Hotell og
in vivo
. Videre var Gli1 uttrykk ofte positivt i mage kreft vev og negativt korrelert med MIR-133b uttrykk. Vi viser at transkripsjonsfaktoren Gli1 var et mål av MIR-202-3p og spiller en viktig rolle som formidler av de biologiske effektene av MIR-202-3p i magekreft. MiR-202-3p også hemmet uttrykk for γ-catenin og BCL-2. Samlet utgjør disse funnene tyder på at Mir-202-3p kan fungere som en roman tumor suppressor i magekreft og sin anti-tumor aktivitet kan tilskrive den direkte målretting og hemming av Gli1
Citation. Zhao Y, Li C, Wang M, Su L, Qu Y, Li J et al. (2013) Reduksjon av MIR-202-3p Expression, en Novel Tumor lyddemper, i magekreft. PLoS ONE 8 (7): e69756. doi: 10,1371 /journal.pone.0069756
Editor: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong
mottatt: 28 februar 2013; Godkjent: 11 juni 2013; Publisert: 25.07.2013
Copyright: © 2013 Zhao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (nr. 81072012, 81101847, 81172324, 91229106 og 81272749), Science and Technology Commission av Shanghai kommune (nr. 10jc1411100, 11jc1407602, 09DZ1950100, 09DZ2260200, 12XD1403700 og 12PJ1406300), viktige prosjekter i National Science and Technology Pillar Program of China (No. 2011BA203191), forskningsfond for doktorgradsutdanning av høyere utdanning i Kina (nr 20110073110071), Key prosjekt Shanghai Education Committee (nr. 12ZZ102, 12ZZ105) og Innovasjon Foundation for PhD Nyutdannede av Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (BXJ201213). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er en av de vanligste kreftformen og den nest vanligste årsakene til kreft dødsfall på verdensbasis [1]. Selv om fremskritt i behandlingen, er overlevelsen av pasienter med GC skuffende, er dette hovedsakelig på grunn av mangelen på spesifikke terapeutiske mål. Derfor er det avgjørende å identifisere de molekylære mekanismene bak utviklingen av magekreft.
microRNAs (mirnas) er en klasse av små (18-25 nukleotider), noncoding, single-strandet endogene RNA. De undertrykker protein uttrykk ved å samhandle med perfekte eller ufullkomne komplementære sekvenser lokalisert i 3’untranslated regioner (3’UTRs) av målgener. Undersøkelser i løpet av de siste årene har vist at feilregulert mirnas spiller viktige roller i forskjellige cancere [1] – [4], inkludert GC [5] – [13]. Data fra studien på mirnas og deres mål gener kan gi spennende terapeutiske muligheter [3].
Vi har nylig identifisert flere mirnas deregulerte i GC, som nedregulering av MIR-126 [14], MIR-409-3p [15], MIR-625 [16], og oppregulering av MIR-21 [17], MIR-301 a [18]. Selv om mange mirnas har blitt identifisert assosiere med GC, trenger fortsatt mekanismen av disse miRNAs i mage tumorigenesis å bli undersøkt. I vårt tidligere arbeid, ble mange mulige mirnas som viste differensial uttrykk mellom GC vev og deres tilstøtende ikke-tumor vev fra 28 pasienter identifisert [19]. Blant dem, MIR-202-3p var en av de mest betydelig redusert miRNAs. Men rollen som MIR-202-3p i GC er sjelden etterforsket.
MiR-202-3p, tidligere kalt HSA-MIR-202, som ligger innenfor en kromosom skjøre området i 10q26. Sletting av den skjøre området har vært forbundet med endometrial [20], hjernesvulster [21], [22]. MiR-202 har blitt rapportert å være deregulert i brystkreft [23], [24], cervical plateepitelkarsinom [25], tykktarmskreft [26] og follikulært lymfom [27]. Petrocca et al. fant at MIR-202 ble nedregulert i kronisk gastritt [28]. MiR-202 har vist seg å bli nedregulert ved 4-hydroxynoneal (HNE) i HL-60-leukemiceller [29]. En fersk studie viste også at MIR-202 direkte rettet mot proto-onkogen MYCN, noe som resulterer i hemming av neuroblastom celleproliferasjon [30].
Her viser vi en generell nedgang i MIR-202-3p uttrykk nivå i 150 GC vev sammenlignet med ikke-tumorvev og finner ut at Mir-202-3p nivåer er assosiert med tumorstørrelse og pasienter alder. Dessuten oppdaget vi, for første gang, at MIR-202-3p kunne hemme vekst og induserer apoptose av GC-celler både
in vitro Hotell og
in vivo
ved direkte rettet mot transkripsjonsfaktor Gli1 og hemme uttrykket av Gli1 målgener γ-catenin og BCL-2.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Skriftlig informert samtykke er innhentet fra alle deltakerne. Studien ble godkjent av Human forskningsetiske komité for Ruijin Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University (HREC 08-028), Forsøksdyretiske komité for Ruijin Hospital (LAEC 11-062). Animal prosedyrer ble utført i henhold til en protokoll godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, Kina.
Cell Kultur
Menneskelig GC cellelinjer SGC -7901 og BGC-823 ble kjøpt fra Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). MKN-45 og MKN-28 cellelinjer ble hentet fra den japanske Cancer Research Resources Bank (Tokyo, Japan). NCI-N87, AGS, KATO III og SNU-1 cellelinjer ble opprinnelig kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Humane embryonale nyrecellelinje 293T (HEK-293T) ble bevart i vårt institutt. Celler ble lagret, gjenvunnet fra nedfrysing i flytende nitrogen, og brukes på tidlige passasjer. Alle celler ble opprettholdt i RPMI-1640-medium pluss 10% føtalt bovint serum (FBS) og dyrket i 5% CO2 fuktet atmosfære. Eksponentielt voksende celler ble brukt for eksperimenter.
Pasient Vev
Primær GC vev og matchet ikke-tumorvev ble innhentet fra 150 GC pasienter som gjennomgår radikal gastrektomi ved Kirurgisk avdeling, Ruijin Hospital, Skole of Medicine, Shanghai Jiao Tong University. Prøvene var snap-frosset rett etter operasjonen. Alle prøver ble bekreftet av uavhengige patologisk undersøkelse. Ingen av pasientene fikk preoperativ behandling. For alle pasienter, clinicopathological informasjon var tilgjengelig. Tumor klassifisering i henhold til International Union Against Cancer (2009).
RNA Isolation og kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR)
Total RNA ble ekstrahert fra cellelinjer og vevsprøver ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Konsentrasjon og renhet av RNA-prøvene ble målt ved hjelp av elektroforese og spektrofotometriske metoder. Uttrykket nivåer av MIR-202-3p og U6 liten kjernefysiske RNA (RNU6B) ble analysert i tre paralleller av stammen sløyfe RT-PCR-metoden ved hjelp av hårnål-it ™ mirnas qPCR Kvantitering Kit (GenePharma, Shanghai, Kina) med spesifikke primere formiR-202-3p og U6 liten kjernefysiske RNA (RNU6B). Relativ miRNA uttrykk for MIR-202-3p ble normalisert mot endogen kontroll, U6, ved hjelp av DDCt metoden. De mRNA nivåer av Gli1 og GAPDH ble målt i tre paralleller med SYBR Grønn sanntid PCR (Applied Biosystems, USA) etter produsentens anvisninger. Kvantifisering ble gjort ved hjelp av DDCt relativ kvantifisering metode med Menneskelig GAPDH som en intern kontroll. De følgende primere ble anvendt: Gli1 (sense: 5′-GGA AGT CAT ACT CAC GCC TCG A-3 «, antisense: 5′-CAT TGC TGA AGG CTT TAC TGC A-3′) [31] og GAPDH (sense: 5»-GGA CCT GAC CTG CCG TCT AG-3 «; anti: 5′-GTA GCC CAG GAT GCC CTT GA-3».)
Transient Transfeksjon av miRNA Ligner
speil 202-3p ligner (dsrna oligonukleotider) og negative kontroll mimics1 (NC) (følelse: 5′-UUC UCC GAA CGU HiG ACG UTT-3 «, anti: 5′-ACG UGA CAC Guu CGG AGA ATT-3») ble kjøpt fra GenePharma (Shanghai, Kina). Celler ble sådd ut i 6-brønns plater dagen før transfeksjon for å sikre at 40% konfluens celle i øyeblikket av transfeksjon. Transfeksjon av miRNA etterligner i celler ble utført med Lipofectamine 2000 ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge produsentens prosedyre. De miRNA etterligner ble anvendt ved en sluttkonsentrasjon på 100 nM.
Cell Proliferation Assay
Ved 24 timer etter transfeksjon med miRNA etterligner,-celler (2 x 10
3 celler /brønn ) ble utsådd i 96-brønners plater og inkubert i 72 timer. Celleproliferasjon ble vurdert i tre paralleller av vannløselig tetrazoliumsalt (WST) assay bruker Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) og målt etter produsentens anvisninger.
Soft Agar Colony Forming analyse
mirna ligner transfekterte celler ble resuspendert med 0,3% bløt agarose (A9045, lav geleringstemperatur, Sigma-Aldrich, USA) i RPMI 1640 inneholdende 10% FBS og lagvis på 0,4% størknet agar i RPMI 1640 inneholdende 10% FBS i 6-brønners plater (1 x 10
3 celler /brønn) ved 24 timer etter transfeksjon. Platene ble inkubert i 2 uker. Kolonier inneholdende minst 50 celler ble tellet.
Apoptose Analyse
En dag før transfeksjon med miRNA etterligner, 1 x 10
6-celler ble utsådd i 6-brønners plater. Førti-åtte timer etter transfeksjon ble cellene høstet og farget med AnnexinV /PI dobbeltfarging kit (BD Biosciences, USA) i henhold til produsentens protokoll. Apoptotiske celler ble vurdert i tre paralleller og gjentatt tre ganger uavhengig av flowcytometri på en FACScan (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA).
Retroviral Transfeksjon for stabile cellelinjer
Genomisk region som inkluderte den primære transkripsjon av MIR-202-3p ble klonet inn i EcoRI-Xhol sete av den modifiserte pMSCV-GW-RFA-PGK-EGFP retroviral vektor. Negative kontroll vektorer hadde ingen innsats. HEK 293T-celler (1 x 10
6 /brønn) ble sådd ut i 6-brønns plater dagen før transfeksjon. Ti ug retroviral konstruksjon som inneholder enten MIR-202-3p eller ingen insert, 2 ug gag /pol og 2 ug VSVG var co-transfektert inn i HEK 293T celler ved hjelp Lipofectamine ™ 2000 reagent og Opti-MEM jeg redusert serum medium i hver tallerken. Virus ble høstet etter 48 timer og 72 timer etter transfeksjon av viral samling medium (RPMI-1640 med 10% varme-inaktivert FBS + 1% glutamin 20 mM HEPES). Infeksjoner av MKN-28-celler ble utført i nærvær av 8 mikrogram /ml polybren i hver brønn i en 6-brønns plate. Celler ble infisert sentrifuge ved 1500 rpm i 30 minutter ved romtemperatur. Virusholdige supernatant ble fjernet etter 2 timer. Positive celler ble valgt for GFP uttrykk ved FACS-sortering og heter RV-MIR-202-3p og RV-MIR-kontroll hhv. MiR-202-3p uttrykk ble bekreftet ved QRT-PCR.
tumorvekst i hårløse mus
Mann BALB /c nu /nu mus, i en alder av seks uker (Institute of Zoology Chinese Academy of Sciences), ble plassert på et bestemt patogen-fritt miljø i Animal Laboratory Unit, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Kina. Mus fikk human omsorg og studieprotokoller ble utført i henhold til en protokoll godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, Kina. Celler (100 ul, 2 × 10
6 celler) fra stabile transfekterte linjer RV-MIR-202-3p eller RV-MIR-kontroll ble samlet og inokulert subkutant i mus. Seks mus ble benyttet for hver gruppe. Mus ble kontrollert ukentlig, og tumorknuter ble målt med et skyvelære. Tumorvolum (V) ble beregnet ved hjelp av formelen V = 4 /3π x L /2 x (W /2)
2, hvor L er den midt-akse lengde, og W er midtaksen width.The tumorceller ble tillatt å vekst 5-uker og tumorvekstkurver og hemmer rater ble beregnet. Etter at musene ble ofret, ble alle kreft grafts skåret, veid, høstet, fast, og innebygd. Hvert eksperiment ble utført to ganger.
TUNEL Analyse
Terminalen nucleotidyl transferase-mediert nick slutten merkingsassay (TUNEL) ble utført i henhold til produsentens instruksjoner av blindgaten ™ Colorimetric TUNEL System kit (Promega, USA). Vev ble fiksert i 10% nøytralisert formalin og innstøpt i parafinblokker. Seksjoner (4 mm) ble så fremstilt for undersøkelse. Etter deparaffinization, ble delene behandlet med 20 g /ml proteinase K i 10 minutter, med 0,3% H
2o
2 i metanol i 10 min, og 0,1% Triton X-100 i 0,1% natriumsitrat i 2 min på is. Deretter ble seksjonene inkubert med TUNEL reaksjonsblandingen i 60 minutter ved 37 ° C. Ytterligere inkubering med peroksidase-konjugert antistoff ble utført i 30 minutter ved 37 ° C. Seksjonene ble farget med diaminobenzidine løsning i 10 min ved romtemperatur og deretter kontra med hematoksylin.
Immunohistochemistry
Profiler (6 mm tykk) av formalinfiksert, parafininnebygd svulst specimenswere deparaffinized i xylen og rehydrert i gradert alkohol. Endogen peroksidase ble blokkert ved bruk av 3% H
2o
2 i 10 min. Etter antigen gjenfinning i citrat-buffer (pH 6,0), ble vevssnittene inkubert med normalt geiteserum for å blokkere ikke-spesifikk antistoffbinding (20 min ved værelsestemperatur). Snittene ble deretter inkubert med Gli1 antistoffer (1:50, SC-20687, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) ved 37 ° C i humidchambers i 2 timer. Etter vasking med PBS tre ganger, ble seksjonene inkubert med peroksydase-konjugert anti-kanin-IgG i 1 time ved romtemperatur. Deretter ble platene vasket med PBS og inkubert i 5 minutter med DAB substrat for mindre enn 30 min. Hematoxylin ble brukt for kontra.
Konstruksjon av plasmider og luciferaseaktiviteten Assay
A 203-bp i full lengde av villtype (WT) Gli1-3’UTR eller mutant Gli1-3 « UTR (Mut) inneholder den antatte MIR-202-3p bindingssetet ble syntetisert (Sangon, Shanghai, Kina). Etter fordøyelsen ved Spel og Hindi, ble fragmenter av villtype og mutant Gli1-3’UTR klonet i Spel og Hindi områder av pMIR-Rapport Luciferase vektor (Applied Biosystems) og heter pMIR /Gli1 og pMIR /Gli1 /mut, henholdsvis. DNA-sekvensering ble benyttet for å bekrefte konstruksjonene.
HEK-293T-celler ble sådd ut i 24-brønners plater i 24 timer før analysen ytelse. I hver brønn, 100 ng pMIR /Gli1 eller pMIR /Gli1 /mut, 2 ng PRL-TK (Promega, Madison, WI, USA) inneholder Renilla luciferase og 100 nM miRNA ligner ble transfektert hjelp Lipofectamine ™ 2000 reagent og Opti-Memi redusert serummedium. Relativ luciferaseaktivitet ble beregnet ut 48 timer etter kotransfeksjon ved hjelp Dual-Glo Luciferase-analyse (Promega, USA) i henhold til produsentens prosedyre. Firefly luciferase aktiviteten ble normalisert til Renilla luciferase aktivitet.
Western Blot analyse
Celler og tumor ble lysert ved hjelp av M-PER reagenser og Halt proteasehemmer Cocktail kits (Pierce, USA). Proteinkonsentrasjonen av cellelysatene ble kvantifisert ved anvendelse av en BCA Protein Assay Kit (Pierce, USA). Protein ble separert ved SDS-polyakrylamid-gelelektroforese og blottet på 0,22 um-polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore, MA, USA). De følgende spesifikke antistoffer ble brukt: Gli1 (1:1000, Cell Signaling Technology), γ-catenin (1:2000, BD Biosciences, USA), BCL-2 (1:2000, EPITMICS, USA), og GAPDH (1: 20000, Abcam, UK). Protein nivåer ble normalisert til total GAPDH
Bygging av Gli1 Expression Plasmid og Transfeksjon
Ved å forsterke cDNA av MKN-28 ved hjelp av følgende primere. Forstand (5’AGT TGA ACA TGG GAT ATC AT-3 «) og antisense (5′- ATG CGG CCG CTT AGG CAC TA-3»), i full-lengde Gli1 ble oppnådd, spaltet med EcoR V og Not i og klonet inn i pcDNA3.1 vektoren (Invitrogen) og navngitt pcDNA3 0,1-Gli1. DNA-sekvensering ble benyttet for å bekrefte konstruksjonene.
Celler ble sådd ut i 6-brønns plater dagen før transfeksjon for å sikre 80-90% konfluens celle i øyeblikket av transfeksjon. I hver brønn, cellene ble transfektert med 250 pmol av MIR-202-3p etterligner eller kontroll, sammen med 4 ug av pcDNA3.1-Gli1 eller pcDNA3.1 tom vektor, ved hjelp av Lipofectamine 2000. WST Analysen ble utført ved 24 timer post-transfeksjon, mens apoptose analyse ble utført på 48 timer etter transfeksjon.
Statistical Analysis
Kontinuerlige variabler ble sammenlignet med Student
t
test for variabler normalfordelte og Wilcoxon rank sum test for variabler nonnormally fordelt. Forholdet mellom de MIR-202-3p ekspresjonsnivåer og clinicopathologic parametere ble analysert ved anvendelse av Pearson Chi-square-test. Alle verdier er presentert som gjennomsnitt ± SDS. Alle statistiske analyser ble utført med PASW Statistikk 18,0 programvare (IBM, USA). En to-tailed verdi på
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Uttrykket av MIR-202-3p er redusert i GC og korrelerer med Clinicopathologic parametere
uttrykk for Mir-202-3p ble undersøkt ved QRT-PCR i tumorvev og matchet ikke-tumorvev fra 150 GC pasienter (fig. 1a). Resultatene viser at ekspresjon av MIR-202-3p var signifikant nedregulert i tumorvev sammenlignet med matchede ikke-tumorvev i 68% (102/150) av pasientene GC. (P 0,001; Fig. 1A, B)
(A) Relativ uttrykk for MIR-202-3p i 150 GC pasient vev sammenlignet med tilstøtende ikke-tumorvev. QRT-PCR-resultater er vist som -ΔΔCT verdier. (B) Boksene representerer 25 gjennom 75-prosentiler. De horisontale linjene representerer medianverdier. Værhårene representere den 10. og 90th persentiler. ***,
P
. 0,001
For ytterligere å belyse sammenhengen mellom uttrykksnivået MIR-202-3p og clinicopathologic faktorer i menneske GC, de 150 tilfellene var videre analysert (tabell 1). Basert på relative MIR-202-3p uttrykk, ble de 150 tilfellene stratifisert i 3 grupper: Mir-202-3p lav uttrykk (tumor /non-tumor ratio 0,66, n = 85), MIR-202-3p moderat uttrykk (tumor /non-tumor ratio 0,66 til 1,5, n = 34) og Mir-202-3p høy uttrykket (tumor /non-tumor ratio 1,5, n = 31). Mir-202-3p uttrykk nivåer ble negativt korrelert til tumorstørrelse og positivt korrelert til alder hos disse pasientene, med MIR-202-3p lav uttrykk gruppen viste signifikant større tumorstørrelse (p = 0,013) og eldre alder sammenlignet med moderat eller høy ekspresjon gruppene (p = 0,028). Men gjorde MIR-202-3p uttrykk nivåer ikke viser noen sammenheng med kjønn, differensiering, tumor beliggenhet, svulst lokal invasjon, lymfeknutemetastaser eller TNM stadium.
Overuttrykte MIR-202-3p hemmer GC Cell Proliferation
Gitt at Mir-202-3p er betydelig redusert i GC, kan det fungere som en tumor suppressor. Derfor undersøkte vi om overekspresjon av MIR-202-3p i GC celler påvirkes cellevekst. MKN-28 og BGC-823 cellelinjer, som uttrykk for MIR-202-3p var lavest i de åtte testede GC cellelinjer (Fig. 1C), ble valgt for de påfølgende expreiments. Syntetiske MIR-202-3p ligner og negativ kontroll ligne molekyler (NC) ble transfektert inn MKN-28 og BGC-823 celler henholdsvis. Ektopisk uttrykk for MIR-202-3p i celler ble bekreftet ved QRT-PCR.
WST cellevekstanalyse viste betydelige cellevekst hemninger i MKN-28 celler transfektert med MIR-202-3p (Fig. 2.a). Lignende resultater ble observert i BGC-823-celler (Fig. 2.b). For ytterligere å karakterisere effekten MIR-202-3p på cellevekst, utførte vi soft agar-kolonidannelse analysen i transfekterte celler. Vi har funnet at antall kolonier fra MKN-28-celler transfektert med de MIR-202-3p etterligner var nesten halvparten av det fra kontrollgruppen og foreldre gruppe (Fig. 2C). Lignende resultater ble observert i BGC-823-celler (Fig. 2.D). Disse resultater viser at MIR-202-3p kan undertrykke celledeling av GC-celler
in vitro
.
Celleproliferasjon ble evaluert av WST-analysen i MKN-28-celler (A) og BGC -823 celler (B). Cellene ble transfektert med MIR-202-3p etterligner eller NC 24 timer etter transfeksjon ble utsatt for WST analysen sammen med foreldre celler. Resultatene er middel av tre uavhengige eksperimenter ± S.D. *,
P
0,05. Effekten av MIR-202-3p på celleformering ble bestemt ved kolonidannelsesbestemmelsen i MKN-28-celler (C) og BGC-823-celler (D). Celler transfektert med 100 Nm Mir-202-3pmimics eller kontroll ble sådd på seks-brønns plater sammen med foreldre celler. Antallet kolonier ble talt på den 14. dagen etter seeding. Representative fotografier av kolonier er vist i venstre paneler. Relevant kvantifisering av resultatene er vist i søylediagrammer (høyre panel). Resultatene er middel av tre uavhengige eksperimenter ± S.D. *,
P
. 0,05
Overuttrykte MIR-202-3p induserer GC Cells apoptose
Siden veksthemming kanskje grunnet blokkert cellecyklusprogresjonen eller økt apoptose, vi neste på forhånd dannede celledeling syklusanalyse og apoptose ved strømningscytometri. Våre data tyder på at de apoptotiske priser av både MKN-28 og BGC-823 celler transfektert med MIR-202-3p ligner signifikant oppregulert (Fig. 3A, B). Det var imidlertid ingen signifikant forskjell i cellesyklus mellom ulikt behandlede grupper (data ikke vist). Resultatene indikerte at overekspresjon av MIR-202-3p induserer apoptose i GC cellene kan bidrar til vekst hemmende egenskaper MIR-202-3p.
(A) Representative histogrammet viser apoptose av MKN-28 celler transient transfektert med 100 nm MIR-202-3p etterligner eller NC og foreldreceller (venstre paneler). Prosentandelen av apoptotiske celler fra tre uavhengige eksperimenter ± S.D. er vist i stolpediagrammene (høyre paneler). (B) Representative histogrammet viser apoptose av BGC-823 celler transient transfektert med 100 nM MIR-202-3p etterligner eller NC og foreldreceller (venstre paneler). Prosentandelen av apoptotiske celler fra tre uavhengige eksperimenter ± S.D. er vist i søylediagrammer (høyre panel).
Overuttrykte MIR-202-3p Hemmer tumorigenitet og øker apoptose
in vivo
Gitt at speil 202-3p hemmer GC celler vekst og induserer apoptose
in vitro
, vi neste undersøkt om MIR-202-3p kunne undertrykke tumorvekst og indusere apoptose
in vivo
. Celler av MKN-28, RV-MIR-202-3p (MKN-28 celler med retrovirus-mediert MIR-202-3p stabil uttrykk) eller RV-MIR-kontroll (MKN-28 celler med tom vektor) ble oppnådd som beskrevet i Materiale og metode. Cellene ble injisert subkutant i nakne mus. Svulstdannelse ble overvåket. Svulsten latens tid viste en signifikant forskjell mellom mus injisert med RV-MIR-NC-celler og RV-MIR-202-3p celler (Fig. 4A). Det er av stor interesse at svulster som stammer fra RV-MIR-202-3p cellene vokste betydelig saktere enn RV-MIR-kontrollgruppe hele tumorvekst (Fig. 4B). Den gjennomsnittlige vekten av svulster som følge av RV-MIR-202-3p var betydelig mindre enn svulster som stammer fra RV-MIR-kontroll (Fig. 4C, D).
(A) Svulsten latency var antall dager til utbruddet av følbar tumor og verdiene er gitt som middelverdi ± SD *,
P
0,05. (B) tumorvekstkurver ble målt etter injeksjon. Tumordiametere ble målt etter 7 dager. (C) Tumorvekt; verdiene er angitt som gjennomsnitt ± S.D. *,
P
0,05. (D) Fotografiet viser representative funksjonene tumorxenotransplantater 35 dager etter vaksinasjonen. (E) Representative bilder av TUNEL analysen av tumorxenotransplantater av mus (venstre panel). Prosentandelen av apoptotiske celler ble tellet (høyre panel). Resultatene er middel av tre uavhengige eksperimenter ± S.D. *,
P
. 0,05
I tillegg ble tunel analyser av tumorvev utført. Som vist på fig. 5E, RV-MIR-202-3p celler viste en mer tumorcelle positiv farging og en betydelig høyere apoptotisk indeks enn de RV-MIR-kontrollceller (
P
0,01). Disse resultatene tyder på at Mir-202-3p hemming av tumorigenitet skyldes økt apoptose
in vivo
.
(A) Relativ uttrykk for MIR-202-3p og Gli1 i åtte GC cellelinjer ble utført av QRT-PCR. Resultatene er middel av tre uavhengige eksperimenter ± S.D. (B) Sekvens av Gli1 3’UTR viser MIR-202-3p bindingssetet og mutasjon av Gli1 3’UTR bindingssetet for å skape Gli1-mut. (C) MIR-202-3p ligner nedregulert luciferasepreparater aktiviteter kontrollert av villtype Gli1 3’UTR (
P
0,01), men ikke påvirke luciferase aktivitet styres av mutant Gli1 3’UTR. Resultatene er middel av tre independentexperiments ± S.D. (D) Gli1 mRNA i MKN-28 celler ble analysert ved QRT-PCR i 48 timer etter transfeksjon med MIR-202-3p ligner og NC. (E) Representative Western blotting bilder av angitte protein i MKN-28 celler (venstre panel), med relevant kvantifisering (høyre panel). Resultatene er middel av tre uavhengige eksperimenter ± S.D. *,
P
0,05. (F) Gli1 protein ble påvist i RV-MIR-kontroll eller RV-MIR-202-3p celler fra subkutan svulst i nude mus (venstre panel), med relevant kvantifisering (høyre panel). Resultatene er middel av tre uavhengige eksperimenter ± S.D. *,
P
. 0,05
MiR-202-3p Direkte Target Gli1
For å forstå mekanismen bak tumorhemmende egenskaper MIR-202 -3p i GC, vi søkte for sine antatte mål gener med potensielle pro-onkogene funksjoner ved hjelp av elektroniske søkeverktøy (RNAhybrid og Miranda algoritmer), og gener spådd av begge de bioinformatiske verktøy ble valgt som kandidat målgener av MIR-202 -3p. Blant de hundrevis av kandidat gener spådd, transkripsjonen aktivator Gli1 er av spesiell interesse (figur S1). Den antatte sekundære strukturen av RNA hybrid for human MIR-202-3p og Gli1 er vist i figur S2. Gli1 har blitt rapportert sterkt uttrykt i GC [32], [33]. Det foreslås at minkende uttrykk for Gli1 resulterte i GC cellelinjer veksthemming og apoptose [33].
En ytterligere hint om den potensielle rolle MIR-202-3p i reguleringen av Gli1 uttrykk kom fra analysen av åtte forskjellige mage kreft cellelinjer (MKN-45, SGC-7901, AGS, NCI-N87, SNU-en, KATO III, BGC-823 og MKN-28). Statistisk analyse viste en signifikant omvendt mønstre uttrykk mellom MIR-202-3p og Gli1 ((r = -0,345,
P
. . 0,001, figur 5A)
For å vurdere den kliniske relevansen av disse funnene, undersøkte vi sammenhengen mellom uttrykk for Gli1 med MIR-202-3p uttrykk i GC vev. Vi fant ut at Gli1 og MIR-202-3p utstillings inverse uttrykk mønster i GC vev (tabell 2). disse resultatene støtter forutsetningen at nedregulering av MIR-202-3p øker nivået av Gli1 genet i magekreft.
luciferaserapportørplasmid analysene ble utført for å verifisere en direkte interaksjon mellom MIR-202-3p og 3’UTR av Gli1. luciferase journalister ble konstruert som inneholder enten et villtype Gli1 3’UTR sekvens inkludert MIR-202-3p bindingssetet (pMIR /Gli1), eller en mutert Gli1 3’UTR (pMIR /Gli1 /mut) (fig. 5B ). den pMIR /Gli1 og pMIR /Gli1 /mut luciferase reporter konstruksjoner ble transfektert inn i HEK-293T celler, sammen med MIR-202-3p eller NC etterligner. den relative luciferase aktiviteten i pMIR /Gli1 reporter ble markert trykt sammenlignet med av pMIR /Gli1 /mut i en MIR-202-3p avhengig måte (fig. 5C). Dette resultatet indikerer sterkt at 3’UTR av Gli1 bærer de direkte bindingsseter fra Mir-202-3p.
For å finne ut på mRNA nivå eller protein nivå Mir-202-3p nedregulert Gli1, vi har oppdaget Gli1 uttrykk ved QRT-PCR og Western blot. Som vist på fig. 5E, det Gli1 proteinnivå ble redusert i MIR-202-3p ligner-transfekterte MKN-28 celler sammenlignet med NC ligner-transfektert og foreldre MKN-28 celler. I mellomtiden var det ikke noen effekt av MIR-202-3p på Gli1 mRNA nivå (fig. 5D). Disse resultatene antyder sterkt at Mir-202-3p negativt regulerer Gli1 uttrykk på translasjonsforskning nivå.
Blant de genene som er rapportert å hemme apoptose av GC, γ-catenin (Plakoglobin) og BCL-2 er direkte transkripsjons mål av Gli1 [34], [35]. Som vist på fig. 5E, protein nivåer av γ-catenin og BCL-2 ble markert redusert i MKN-28 celler transfektert med MIR-202-3p etterligner.
I tillegg undersøkte vi uttrykk for Gli1 protein i subkutane svulster avledet fra RV-MIR-kontroll og RV-MIR-202-3p i nakne mus ved western blot analyse. Den Gli1 protein nivå i svulster fra RV-MIR-202-3p demonstrert downregulation sammenlignet med i RV-MIR-kontroll (Fig. 5F). Disse resultatene antyder sterkt at Mir-202-3p negativt regulerer Gli1 uttrykk etter transcriptionally.
Overuttrykte Gli1 berger Effekt av MIR-202-3p i GC Cells
Siden MIR-202-3p downregulated Gli1 å hemme celleproliferasjon og indusere apoptose, er det begrunnet at overekspresjon av Gli1 kan reversere dette fenomen i det minste delvis. Faktisk, når Gli1 overekspresjon plasmid (pcDNA3.1-Gli1) ble innført i MKN-28 eller BGC-823 celler transient transfektert med MIR-202-3p etterligner, ble den hemmende effekten av MIR-202-3p på cellevekst delvis reversert, som ble observert av WST cellevekstanalyse (fig. 6A, B). Videre progresjon mot apoptose ble også hindret når Gli1 ble overuttrykt i MKN-28 eller BGC-823 celler transient transfektert med MIR-202-3p ligner (Fig. 6C, D) .Disse data dokumentere at veksthemming og celle apoptose indusert av MIR-202-3p er i det minste delvis er knyttet til dens effekt på Gli1 uttrykk.
ved transfektert med Gli1 ekspresjonsvektor (pcDNA3.1-Gli1), MKN-28-celler (A) og BGC-823 celler ( B) ble delvis reddet fra MIR-202-3p veksthemmende egenskaper. -Celler ble transfektert med MIR-202-3p etterligner eller kontroll, sammen med pcDNA3.1-Gli1or pcDNA3.1 tom vektor (pcDNA3.1) ved 24 timer etter transfeksjon ble underkastet WST-analyse. Resultatene er middel av tre uavhengige eksperimenter ± S.D. *,
P
0,05. Representative histogrammer som viser apoptose MKN-28 celler (C) og BGC-823 celler (D) transfektert med MIR-202-3p etterligner eller kontroll, sammen med pcDNA3.1- Gli1) eller pcDNA3.1 ved flowcytometri (venstre panel). Prosentandelen av apoptotiske celler fra tre uavhengige eksperimenter ± S.D. er vist i søylediagrammer (høyre panel).
Diskusjoner
Akkumuler bevis har vist feilregulering av spesifikke miRNA i GC [4], [13], [36].
