Abstract
Bakgrunn
Erkjennelsen EGFR som sentrale orchestrator av metastaserende prosess i kolorektal kreft, men også betydelig heterogenitet av reaksjoner på anti-EGFR terapi, undersøkte vi mønsteret av kompositt svulst kinase styrte aktiviteter EGFR-medierte signal som kan være innblandet i utviklingen av metastatisk sykdom.
Pasienter og metoder
Point mutasjoner i
KRAS
,
BRAF
og
PIK3CA Hotell og
ErbB2
forsterkning ble bestemt i primære svulster fra 63 pasienter med lokalavansert endetarmskreft planlagt for radikal behandling. Ved hjelp av peptid arrays med tyrosinkinase underlag,
ex vivo
phosphopeptide profiler ble samlet inn de samme baseline tumorprøver og korrelert til metastasering overlevelse.
Resultater
Unsupervised clustering analyse av den resulterende fosforylering av 102 array-substrater definert to kreft klasser, både som består av tilfellene med og uten
KRAS /BRAF
mutasjoner. Jo mindre klyngen gruppe pasienter med svulster som genererer høy
ex vivo
fosforylering av fosfatidylinositol-3-kinase-relaterte underlag, hadde en spesielt aggressiv sykdomsforløpet, med nesten halvparten av pasientene utvikler metastatisk sykdom innen ett år oppfølging.
Konklusjon
Høy phosphatidylinositol-3-kinase-mediert signale aktivitet av primærtumor, i stedet for
KRAS /BRAF
mutasjonsstatus, ble identifisert som en kjennetegn på dårlig metastase overlevelse hos pasienter med lokalavansert endetarmskreft gjennomgår radikal behandling av bekkenhulen
Citation. Ree AH, Kristensen aT, Saelen MG, de Wijn R, Edvardsen H Jovanovic J, et al. (2012) Tumor phosphatidylinositol-3-kinase signale og utvikling av metastatisk sykdom i lokalavansert rektal kreft. PLoS ONE 7 (11): e50806. doi: 10,1371 /journal.pone.0050806
Redaktør: Ming Tan, University of South Alabama, USA
mottatt: 29. mars 2012; Godkjent: 25 oktober 2012; Publisert: 30.11.2012
Copyright: © 2012 Ree et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Akershus universitetssykehus Grant 2010-003 (til AHR), EU 7. rammeprogram Grant 222741-METOXIA (til AHR og KF), den norske Kreftforening (til KF), og en sjenerøs pasient donasjon (ca. 10 000 USD ) til støtte for denne spesifikke forskningsaktiviteten (til AHR). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikt: RDW er PamGene International BV ansatt. De andre forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
De mange mer enn 500 proteinkinaser, den kinome, representerer en vesentlig del av det humane genomet, og reseptor-tyrosin-kinaser er viktige mediatorer i signaleringskaskader som regulerer sentrale biologiske prosesser av malignitet, for eksempel proliferasjon, angiogenese, metastase og [1], [2]. For å optimalisere og individual terapeutisk effekt av kinase hemmende midler for metastatisk sykdom kontroll, synes det rasjonelt å utnytte bestemt mønster av svulst kinase aktivitet som funksjonell biomarkør for handlings mål.
I lokalavansert endetarmskreft (LARC) randomiserte studier har fremhevet den sentrale rollen kjemoradioterapi (CRT) i forbindelse med kirurgisk reseksjon å utrydde svulst i bekkenhulen og forbedre langsiktig utfall [3]. Men selv med vellykket lokal behandling, vil et betydelig antall pasienter utvikle metastatisk sykdom som følge av tidlig, uoppdaget systemisk spredning av tumorceller. Innenfor denne referanseramme, våre potensielle ikke-randomisert studie bestående av LARC pasienter som fikk CRT fulgt av radikal kirurgi og ingen ytterligere behandling tilbyr en unik mulighet til å utforske den regulerende rolle av spesifikke kinase signalveier i tumor spredning, angiogenese og metastase i en definert klinisk sammenheng. I denne studien ved bruk av peptid-matriser med tyrosinkinase-substrater [4] – [6] for å analysere pasientenes tumor på diagnosetidspunktet, har vi funnet at pasienter med dårlig CRT reaksjon hadde signifikant forhøyet tumor-aktivitet, tilsvarende signale mediert av VEGFR, EGFR, og phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) /AKT, sammenlignet med gode kontaktbare pasienter [7]. Vi har dessuten rapportert at tumor angiogene signaturer som omfatter PDGFR, VEGFR, og Epor var assosiert med mikroskopisk spredning av tumorceller i benmarg på tidspunktet for diagnose, som for det andre var korrelert med økt risiko for utvikling av metastatisk sykdom følgende løpet av radikal behandlingen av bekkenhulen [8].
i metastatisk kolorektalcancer, monoklonale antistoffer rettet mot EGFR, tiden cetuximab og panitumumab, har blitt implementert i klinisk praksis for de siste åtte årene. For optimal utvalg av kvalifiserte pasienter, innledende molekylære data etablert mutasjoner av gener som koder for effektor proteiner nedstrøms av EGFR i svulsten signalkaskade, hovedsakelig mutasjoner i kodon 12 eller 13 av
KRAS
, som prediktor for iboende terapeutisk motstand mot anti-EGFR-monoklonale antistoffer [9]. Videre mutasjoner i gener som koder for andre meklere, primært
BRAF
p.V600E men også
PIK3CA
mutasjoner, er assosiert med resistens [9], mens svulster husing
KRAS
p .G13D kan reagere [10], [11]. Det ble nylig foreslått at forsterking av
ErbB2
omfatter en annen motstand mekanisme [12], [13], og at ervervet resistens oppstår ved mutasjon av
EGFR
seg selv [14] eller resultater fra utvidelses av tumor subkloner med mutert eller forsterkes
KRAS product: [15], [16]. I tillegg til signalering gjennom banen til
KRAS /BRAF
-kodet effektorer, EGFR parallelt aktiverer PI3K-mediert signalering gjennom en flertrinns samspill av budbringermolekyler med effektorer [17], [18]. Til tross for alle de ovennevnte kunnskap har imidlertid objektiv respons til anti-EGFR-antistoffer i metastatisk kolorektal cancer oppnås, i beste fall, i ikke mer enn halvparten av pasientene uten tumoraberrasjoner i EGFR-signaleringsnett som for tiden er testet i rutinepraksis [ ,,,0],9], [19], [20].
hypoteser som kinase signaliserer aktivitet utført av EGFR kan reflektere mutasjon status av gener som koder for effektor proteiner fra en hvilken som helst del av den molekylære nettverk, vi sammenlignet tidligere oppnådd
ex vivo
svulst phosphopeptide profiler fra de LARC studie pasientene [7], [8] med kreft mutasjoner innenfor
KRAS
ekson 2,
BRAF
ekson 15, og
PIK3CA
eksoner 9 og 20, og forsterkning av
erbB2
. Konseptuelt, kan svulsten kinase aktivitet signaturer som omfatter alle samspill signalveier som er relevante utvikles til funksjonelle biomarkører av handlings terapi mål for metastatisk sykdom kontroll. Undersøkelsene i denne studien definert en undergruppe av pasienter LARC, etter reseksjon av primære tumorer med høy aktivitet av PI3K signalveien, med særlig dårlig metastase-overlevelse. Dette funnet tyder på at høy tumor PI3K-mediert signale aktivitet er en biomarkør for risikovurdering og behandling lagdeling.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
fase II, ikke- randomisert studie protokoll (ClinicalTrials ID NCT00278694) ble godkjent av Institutional Review Board og Regional komité for medisinsk og helsefaglig forskningsetikk Sør-Øst Norge, og er i samsvar med Helsinkideklarasjonen. Skriftlig informert samtykke var nødvendig for deltakelse.
Pasienter og prosedyrer
Pasientpopulasjonen rapportert her ble registrert mellom oktober 2005 og mai 2008. Pasientkvalifikasjonskriterier, evalueringsprosedyrer, studere behandling, og kontrollhandlinger av oppfølgings er blitt beskrevet i detalj tidligere [7]. Etter neoadjuvant fluoropyrimidin /oksaliplatinbasert CRT og påfølgende operasjon ble resected primære vevsprøver histologisk evaluert for behandlingsrespons i henhold til standardkriterier (histopathologic iscenesettelse, ypTN) og histomorphologic tumor regresjon Karakter (TRG). I korte trekk ble den sistnevnte gradert i en av fem kategorier TRG, som strekker seg fra fraværet av gjenværende tumorceller i den resekterte prøven (TRG1) til mangelen på morfologiske tegn til behandlingsrespons (TRG5) [21]. Oppfølgingsdata ble hentet fra den kliniske database og sensurert 31. desember 2011. Gyldige observasjoner av tilstedeværelse eller fravær av fjernmetastaser som kreves utpekt radiologisk undersøkelse. Fire pasienter med synkrone resektable levermetastaser ble ekskludert fra analysen av metastaser overlevelse.
tumorprøver
På tidspunktet for diagnose, ble baseline studiespesifikke primær tumor biopsier innhentet fra 79 pasienter med lokalavansert endetarmskreft under tung sedasjon, snap-frosset i flytende nitrogen, og lagret ved -80 ° C, som rapportert tidligere [7]. Av de inkluderte pasientene ble 16 pasienter ekskludert fra studien, som 12 pasienter hadde tumorbiopsi-prøver som kinase aktivitet profilering ikke hadde blitt gjennomført fordi pasientene var enten ikke kvalifisert etter studie registrering (
n
= 4) hadde trukket samtykke (
n
= 1), hadde uventet døde under preoperativ behandling (
n
= 1), hadde utviklet metastatisk sykdomsprogresjon under preoperativ behandling som utelukket definitive kirurgi (
n
= 1), hadde tumorcelle-innhold mindre enn 20% i løpet av de biopsiprøve (
n
= 3), eller hadde en biopsiprøve hvori kinaseaktivitet analyse manglet av ukjente årsaker (
n
= 2), og ytterligere fire pasienter som ikke har svulst-DNA isoleres, fordi ingen biopsi materiale holdt seg for formålet. Dermed svulst kinase aktivitetsprofiler basert på tidligere matrise phosphosubstrate data ble vellykket identifisert for 63 pasienter som hadde sine tumor
KRAS /BRAF /PIK3CA /ErbB2
mutasjonsstatus fastsatt, og denne studiepopulasjonen var til stede i de aktuelle analysene.
Tumor genmutasjon Analyser
KRAS
,
BRAF
, og
PIK3CA
målsekvenser ble forsterket av polymerase kjedereaksjon, og basis erstatninger ble oppdaget av denatureringsmiddel, sykling temperatur kapillær elektroforese [22], [23], i henhold til tabell S1.
ErbB2
amplifisering ble analysert ved bruk av TaqMan® Copy Number Assay (Applied Biosystems, Oslo, Norge) protokollen [24] og kalibrert i forhold til hver enkelt pasients tilsvarende DNA isolert fra perifere mononukleære blodceller. Tumor DNA-prøver med relativ kvantifisering verdier høyere enn fem ble ansett forsterket for å sikre scoring høyverdig samlings
ErbB2
forsterker bare, utelate lav grad polysomy av kromosom 17.
svulst kinase aktivitet Profiling
Fremstilling av tumorprøve lysater og multipleks analyse av tumor-kinase-aktivitet ved anvendelse av peptid-matriser med tyrosinkinase-substrater (tyrosine kinase PamChip96 Array; PamGene International BV, «s-Hertogenbosch, Nederland), er blitt beskrevet i detalj tidligere [7 ]. Den gjennomsnittlige tumor celleinnhold i lige snitt var 46%, og ingen forskjell ble funnet mellom svulster med villtype og mutert
KRAS /BRAF product: (
P
0,67; to-utvalg
t
-test). Fire tekniske replikater ble analysert fra hver pasientprøve for å generere
ex vivo
phosphosubstrate profiler.
Tilpasning av Array data
Data visualisering og behandling av tidligere oppnådd array-data (ArrayExpress tiltredelse nummer E-TABM-913), som rapportert tidligere [7], ble utført ved anvendelse av BioNavigator versjon 5.10.70 (PamGene International BV). Tumorene ble delt i to grupper; villtype og mutert
KRAS /BRAF
status (36 og 27 prøver, henholdsvis). Dataene på rekke peptid fosforylering, etter overgang fra rekke signalintensitet, var log-transformerte etter å ha håndtert et lite antall negative datapunkter ved å trekke 1% persentil av den totale datasettet og deretter sette alle gjenværende datapunkter med verdi mindre enn 1 til verdien 1. Denne tilpasningen tilnærmingen ble valgt for å balansere antall datapunkter som var satt til verdien av en og omfanget av kollektive oppadgående forskyvning av hele datasettet. Korrigering av plate-til-plate variasjon ble oppnådd ved å normalisere substratet signalintensitet til den midlere signalintensiteten av alle vill-type tumorer i de respektive plater ved hjelp av følgende formel: N
psm = log
2 (S
PSM) – log
2 (G
pm), der N
PSM er normalisert signal for underlaget p prøve s på plate m, S
PSM er den tilsvarende ikke-normalisert signal, og G
pm er gjennomsnittlig signal fra villtype svulster i underlaget p på tallerkenen. Phosphosubstrates med en sample-gjennomsnittet signal mindre enn 10 ble ekskludert, slik at 102 peptider for videre analyse (tabell S2).
Statistical Analysis
Basert på signalverdiene for disse resulterende 102 matrise fosfor, unsupervised analyse ble utført søker prinsipal komponent analyse og
k
en anordning clustering, med 10 Monte Carlo gjentakelser, ved hjelp av standard funksjonene som tilbys i Matlab Statistikk Toolbox (Matlab R2010A, Mathworks, Natick, MA, USA). Binary veiledet klassifisering analyse ble utført ved hjelp av delvis-minste kvadrater diskriminant analyse i Matlab R2010A, i hovedsak som beskrevet tidligere [7]. Utførelse av klasse partisjon med hensyn til tumormutasjonsstatus ble vurdert ved 20-fold kryssvalidering. Fordeling av parametere mellom pasienter med svulster husing differensial molekylære egenskaper ble sammenlignet ved hjelp av Fishers eksakte test for kategoriske data og to-utvalg
t
-test for kontinuerlige variabler. Log-rank test ble benyttet til å beregne noen forskjell i metastase overlevelse mellom undergrupper av pasienter. Dataanalysen ble utført ved hjelp av SPSS Predictive Analytics programvare (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
P
-verdier mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Tumor Mutasjoner
Point mutasjoner i
KRAS
,
BRAF
, og
henholdsvis PIK3CA Hotell og forsterkning av
ErbB2
ble påvist i 35%, 6,3%, 9,5% og 3,2% av de primære svulster fra 63 LARC tilfeller (Tabell 1); i flertall, ble et enkelt gen avvik funnet. Fire svulster næret
BRAF
mutasjon, enten p.D594G eller p.V600E, som en ensom aberrasjon. I seks svulster,
PIK3CA
mutasjoner ble funnet; i to av tilfellene,
KRAS
ble også mutert. Bare to prøver, både uten andre detekterte mutasjoner, viste forsterket
ErbB2 product: (i kraft av mer enn 5 gangers tumor
ErbB2
nivå i forhold til nivået i pasientens tilsvarende normal DNA). Det ble ikke observert forskjeller mellom pasienter som hadde
KRAS /BRAF
villtype og muterte tumorer om radiologisk TNM stadium ved diagnose, histopathologic ypTN scenen eller histomorphologic TRG score på de kirurgiske prøver å følge CRT, utvikling av metastatisk sykdom ved median oppfølging -up av 53 måneder (fra 7-70), eller alder (tabell S3).
tumor kinase aktivitet profiler
Ex vivo
svulst kinase aktivitetsprofiler ble avledet fra 102 array-substrater som hadde signalintensitet over definert terskel (tabell S2), med relative fosforylering nivåer varierende innenfor en log
2 rekke -1,0 til 1,0. Basert på de genererte phosphosubstrate profiler, en binær klasse partisjon modell diskriminert riktig mellom tumor
KRAS /BRAF
villtype og mutasjonsstatus i 67% av tilfellene. Ingen forbedring i presisjon av klassen partisjonen ble oppnådd på inkludering av enten
PIK3CA
eller
ErbB2
avvik som flere lag med informasjon til gruppen av tumorprøver med genmutasjoner.
Figur 1 viser resultatet tomten som følge av prinsipal komponent analyse av datasettet av 102 phosphopeptide underlag; hver flekk representerer en av de 63 prøver i et tredimensjonalt hovedkomponent plass. Ved inspeksjon av resultatet plottet, ble en enkelt svulst (lukket trekant) observeres som en klar avvik til fordelingen av prøvene langs den første hovedbestanddelen, og dessuten, de gjenværende prøvene så ut til å skille seg i to grupper, som begge består av et forholdsvis balansert antall
KRAS /BRAF
villtype og muterte tumorer. Deretter, ved hjelp av resultatet av de tre hovedkomponentene som inndata og utelukke avvikende tumor fra videre analyse,
k
en anordning clustering ble påført for å oppnå to distinkte grupper av prøver for derved å tildele noen grensetilfeller i enten av de to. Som følge av denne prosedyren, 15 av 62 prøver (24%), hvorav 11 (69% av 15) var
KRAS /BRAF
vill type saker, gruppert i mindre gruppe (Cluster-gruppe 2; lukkede sirkler). Selv om større klynge av 47 prøver (Cluster-gruppe 1, åpne firkanter) besto av 26 (55%)
KRAS /BRAF
vill type svulster,
KRAS /BRAF
villtype og muterte saker ble likt fordelt i de to kreft klynger (
P
= 0,17).
Unsupervised clustering analyse av kinase substratfosforylering nivåer generert av svulster fra 63 pasienter. Fordeling av de enkelte prøver av
KRAS /BRAF
villtype (rød) og muterte (blå) svulster visualiseres ved hjelp av resultatet for de tre første komponentene i en prinsipal komponentanalyse (PC1-3) av serien fosforyleringsnivå nivåer av 102
ex vivo
kinase underlag.
k
en anordning clustering ble brukt til å oppnå to grupper av tumorprøver, angitt med åpne firkanter (Cluster-gruppe 1) og lukkede sirkler (Cluster-gruppe 2), henholdsvis. Den lukkede trekant representerer en enkelt avvik til utdeling av vareprøver langs PC1, som utdypet i resultater.
I figur 2, ved hjelp av de resulterende gruppene fra unsupervised clustering analyse, tumorprøver (horisontal akse) og peptider (vertikal akse) ble sortert langs en linje som forbinder de to klase centroids henhold til deres projeksjon og vekt i signalendring henholdsvis illustrerer at Cluster-gruppe 2 svulster generert høyere
ex vivo
substratfosforylering nivåer enn prøvene av Cluster-gruppe 1 for alle de 102 peptider. Rekkefølgen av peptid-substrater med hensyn til hvordan deres forskjell i fosforylering nivåer på tvers av tumorprøver skilt mellom de to klyngegrupper,
dvs.
kresne svulst kinase aktivitetsprofil, er oppført i tabell 2. Interessant, forskjeller i fosforylering av substrater knyttet til PI3K avhengige faktorer (en PIK3R1, tre CTTN1, en PLCG1, to PDPK1, og ett RASA1 peptider) bidro sterkere til diskriminering av klase grupper, som de i hovedsak ble funnet i øvre halvdel av listen , enn phosphosubstrates knyttet til signale mediert av
KRAS /BRAF
-kodet effektor pathway (en RAF1 og fire MAPK isoformene peptider). En av de tre EGFR array-peptider ble funnet blant phosphosubstrates sterkt skille mellom de to klyngegrupper.
En tenkt linje trukket mellom bestemt Tyngdepunktet av hver av pasienten Cluster-gruppe 1 og Cluster-gruppe 2 (avbildet i figur 1), og de 63 tumorprøver (horisontal akse, som er merket for genmutasjoner som angitt) og 102 phosphosubstrates (vertikal akse) ble sortert langs denne linje i henhold til projeksjon og vekt i signalforskjell, respektivt. Red tilsvarer høyere og blå til lavere substratfosforylering nivåer. Piler betegner matrise peptider som representerer faktorer som har EGFR-rettet signalveier, som vist, og identiteten til hvert peptid substrat, i rekkefølge fra toppen til bunnen av figuren, er gitt i tabell 2. I denne analysen, den eneste avvik til distribusjons av prøver, som utdypet i Resultater, sorterte igjen av Cluster-gruppe 1 i varmen-kartet.
Tabell 3 oppsummerer tumor og behandling karakteristikk av 62 pasienter inkludert i enten Cluster-Group en eller Cluster-Group 2. Igjen ble det ikke observert forskjeller mellom klyngegrupper om TNM stadium, ypTN scenen, eller TRG poengsum. Metastase overlevelse ble vurdert for 58 pasienter, som de fire pasienter med synkrone levermetastaser ble utelatt fra denne analysen, med Cluster-gruppe 2 viser dårligere metastase overlevelse enn Cluster-gruppe 1 (
P
= 0,011 ; figur 3). Legg spesielt merke, mens en femtedel av pasientene i Cluster-konsernet en utviklet metastatisk sykdom over en oppfølgingsperiode på 36 måneder, pasienter i Cluster-gruppe 2 så ut til å ha en mye mer aggressiv sykdom, som nesten en halv hadde blitt diagnostisert med metastaser etter mindre enn ett års oppfølging.
Dette resultatet parameter ble analysert for 58 pasienter som funksjon av lav (Cluster-gruppe 1) eller høy (Cluster-gruppe 2)
ex vivo
substratfosforylering aktivitet av primærtumor.
Separat, når man sammenligner
KRAS /BRAF
vill type svulster som en hel gruppe med hele gruppen av svulster huse slike mutasjoner, ble prøver uten mutasjoner som genereres betydelig høyere fosforylering av 11 de 102 array-peptidene som utgjør tyrosin-kinase aktivitetsprofiler (
P
-verdi rekkevidde 0,0034 til 0,049). I figur 4 er de sampler innenfor hver av disse to gruppene tumor arrangert horisontalt i rekkefølge fra lave til høye nivåer phosphopeptide, for å visualisere den høyere prosentandel av
KRAS /BRAF
villtype tumorer som produserte høyere enn bety fosforylering nivåer for de 11 substrater (18 av 36 prøver) enn svulster med muterte
KRAS /BRAF
utfører tilsvarende (6 av 27 prøver;
P
= 0,036). Et flertall av de diskriminerende phosphosubstrates ble ansett å representere signal faktorer som er forbundet med EGFR-utført veien. Innenfor hele 102-peptid panel ble seks peptider som representerer medlemmer av EGFR familien av reseptor-tyrosin-kinaser (tre EGFR, ErbB2 to, og en ErbB4) identifisert (tabell S2). Mens ingen av de tre EGFR array-peptider ble funnet blant phosphosubstrates skille tumor
KRAS /BRAF
mutasjonsstatus på konsernnivå, alle de tre peptider som representerer ErbB2 og ErbB4 var blant de kresne underlag.
de 63 tumorprøver er organisert langs den horisontale aksen, kommentert av vill-type eller muterte
KRAS /BRAF Hotell og merket for andre genmutasjoner som spesifisert, mens de 11 kresne kinase substrater (
P
-verdi utvalg 0,0034 til 0,049 på sammenligning av
KRAS /BRAF
vill type svulster som en hel gruppe med hele gruppen av svulster som bærer slike mutasjoner) er avbildet langs den vertikale aksen. For hvert peptid-substrat, er posisjon (er) av tyrosin-fosforyleringssete (e) i proteinet er angitt. Red tilsvarer høyere og blå til lavere substratfosforylering nivåer.
Diskusjoner
Den viktige funn i denne studien var at høy
ex vivo
fosforylering av PI3K relatert substrater av primærtumor, snarere enn
KRAS /BRAF
mutasjonsstatus, kan være et kjennetegn på dårlig metastase overlevelse i LARC pasienter etter radikal behandling av bekkenhulen. Denne spesielle undergruppe av studie pasienter hadde aggressiv sykdomsutvikling, med en betydelig andel av pasientene blir diagnostisert med metastatisk sykdom i løpet av mindre enn ett års oppfølging.
Mens moderne multimodal behandling av LARC har ført til betydelig forbedring av lokal sykdomskontroll, er utvikling av metastatisk sykdom fortsatt en stor utfordring [3]. For øyeblikket finnes det ingen enighet om systemisk behandling kan redusere risikoen for metastaseutvikling i endetarmskreftpasienter [25], noe som delvis kan forklares med det sparsommelige biomarkører for risikovurdering og behandling lagdeling. I pasientens kullet som analyseres her, har vi tidligere har vist at tilstedeværelsen av disseminerte tumorceller i benmarg på tidspunktet for diagnose korrelert med utvikling av åpenlys metastatisk sykdom [8]. Spørsmålet om hvorvidt tumor
KRAS /BRAF
mutasjonsstatus kan være en pålitelig biomarkør for det formål å velge høyrisikopasienter til anti-EGFR terapi, men fortsatt ukjent. Til tross for overbevisende effekt av behandling ved metastatisk sykdom fra villtype
KRAS /BRAF
kolorektal tumorer [9], inkludert funn av en høy andel av resectability av levermetastaser etter cetuximab baserte systemisk behandling [26], den tillegg av cetuximab til standard kjemoterapi hos pasienter med villtype
KRAS
tykktarmskreft ikke klarte å møte endepunktet av langvarig sykdomsfri overlevelse i en nylig avsluttet randomisert studie ved adjuvant behandling [27]. En tilsvarende undersøkelse for resected endetarmskreft har ikke blitt gjort.
I denne studien, binære veiledet klassifisering analyse av
ex vivo
dannede phosphopeptide profiler diskriminert riktig mellom tumor
KRAS /BRAF
villtype og muterte prøver i to tredjedeler av tilfellene. Fordi denne datahåndtering ble utført for å muliggjøre påvisning av små forskjeller mellom de to gruppene som sammenlignes, det gjorde ikke helt sammenligne med utfallet av den uten tilsyn analyse av hele 102-phosphosubstrate panel. I sistnevnte dukket opp to alternative fenotypiske svulstpopulasjonene; en mindre en, som omfatter en firedel av hele kullet, og en større klynge av svulster, både bestående av prøver med og uten
KRAS /BRAF
mutasjoner med lik fordeling i løpet av de to kreft klynger. I metastatisk kolorektalcancer, kan objektiv respons på anti-EGFR antistoffer kan forventes i en tredjedel av uselekterte pasienter, og omvendt, tumor
KRAS
mutasjoner kan bli funnet i nesten en tredjedel av respondere [19]. Vår observasjon at
KRAS /BRAF
villtype og muterte tumorer hadde overlapp kinase aktivitetsprofiler er i overensstemmelse med den økende erkjennelse av tumor heterogenitet, reflektert i uensartet mutasjonstatus, som determinant for variabel respons til anti-EGFR-antistoff terapi .
av varsel, studie pasienter som viser høy tumor PI3K-mediert signale aktivitet, som alle matrise substrater av dette spesifikke pathway (PIK3R1, CTTN1, PLCG1, PDPK1, og RASA1) var svært fosforylert, hadde særdeles dårlig metastasis- overlevelse etter radikal behandling av bekkenhulen. Den PI3K Komplekset består av en regulatorisk subenhet som finnes i flere isoformer (PIK3R1 og CTTN1), og en katalytisk subenhet kodet av
PIK3CA
. På regulatorisk subenhet fosforylering av reseptor tyrosin kinaser eller G-protein (RASA1) -koblet reseptorer, er den katalytiske subenheten i stand til å generere phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate, som aktiverer 3-phosphoinositide-avhengig protein kinase 1 (PDPK1) og senere AKT og nedstrøms mammalian target of rapamycin (mTOR). I tillegg er den en-fosfatidylinositol-4,5-bifosfat fosfodiesterase gamma-1 (PLCG1) avgjørende for generering av aktivering av andre messenger molekyler i EGFR-rettet, PIK3-mediert signalveien [17], [18]. I sammenheng med våre observasjoner, selv uten gyldig bevis i dag, er det fristende å spekulere i at LARC pasienter kan være kvalifisert for adjuvant systemisk behandling basert på denne høyrisiko biologisk funksjon. Gitt funn at PI3K kompleks kan være en viktig signalnettverk orchestrator av tykktarmskreft metastaser, kan therapeutics rettet mot PI3K /AKT eller nedstrøms mTOR kompleks [17] være rasjonell, og innenfor denne referanseramme,
ex vivo
phosphosubstrate teknologi kunne vise til utviklingen de nødvendige biomarkører av signalveien druggability.
i egen analyse som sammenligner
ex vivo
phosphopeptide profiler genereres av
KRAS /BRAF
vill -type svulster som en hel gruppe med de kollektivt hentet fra gruppen av tumorer som bærer disse mutasjoner, ble erbB2 og erbB4 blant de rådende substratene diskriminerende disse to gruppene. Men med tanke på at de 11 kresne substrater i denne analysen dukket opp fra et totalt antall på 102 peptider som utgjør tyrosin kinase aktivitet profiler, kan den falske funnraten være så høy som 50% med statistisk signifikans nivå på
P
0,05. Likevel kan resistens mot anti-EGFR-antistoff behandling være mediert av aktivering av ErbB2-mediert signalisering, enten via amplifikasjon av
ErbB2
eller økede nivåer av ErbB3 /ErbB4 ligand heregulin [13]. Videre
ErbB2
ble nylig funnet å bli forsterket i en tredjedel av svulster, hovedsakelig tykktarmskreft, bekreftet å være villtype for
KRAS /BRAF /PIK3CA
men motstandsdyktig mot anti-EGFR-antistoff terapi; svulster med
ErbB2
forsterkning ble betydelig anriket i denne spesifikke befolkningen i forhold til umarkerte pasienter [12]. I den foreliggende kohort av LARC pasienter, men bare to saker ble avsluttet for å ha
ErbB2
forsterkning.
Spesielt ved bruk av high-throughput kinase substrat matriser, en sammenheng mellom tumor kinase aktivitet og metastase -Gratis overlevelse ble funnet i dette LARC kohort. For klinisk praksis kan denne teknologien være praktisk mulig, da det er robust med små mengder vev, typisk 10-15 mikrogram av totalt protein er tilstrekkelig til [4] – [6]; Det har imidlertid hittil vært anvendt for å adressere et begrenset antall kliniske emner [7], [8], [28] – [30]. Konseptet er betinget av fersk frosset svulstvev for bevaring av kinase aktivitet, og for etterforskningen rapportert her, vi tok fordel av en eksisterende biobank av biopsiprøver prospektivt samlet fra studiepasienter, slik at analysen av kvalitetssikret svulstvev. Men den nåværende LARC befolkningen ikke hadde fått anti-EGFR-antistoff behandling og dermed slike resultatdata var utilgjengelig for korrelasjon til de genererte svulst kinase aktivitetsprofiler.
Ved valg av kreftpasienter til kinase hemmer legemiddel, den rådende gull -standard er hovedsakelig basert på påvisning av genet avvik i pasientenes svulster.
