Abstract
Bakgrunn
prostataspesifikt antigen (PSA) er tradisjonelt brukt som en indikator for tilstedeværelse av prostatakreft (PCA) og strålebehandling er vanligvis brukes til å behandle ubrukelig og lokalt avansert PCa . Men hvor celle PSA-nivå er assosiert med sensitiviteten til PCa til radioterapi er ukjent. Den forrige funn at relB-baserte NF-kB alternativ bane forskjellig regulerer PSA og interleukin-8 (IL-8) i aggressive PCA har rettet vår oppmerksomhet til rollen relB i responsen av PCa til strålebehandling.
metodikk /hovedfunnene
relB og dens mål PSA og IL-8 i PCA celler ble manipulert av ektopisk uttrykk i PCA celler med et lavt endogent nivå av relB (LNCaP) og av RNAi-baserte knock-down in PCA-celler med et høyt nivå av konstitutiv relB (PC3). Effektene av relB, PSA og IL-8 på responsen av PCa til strålebehandlingen ble undersøkt
in vitro
og i xenograft tumorer. RelB regulerer PSA og IL-8 i en invers måte. Når de cellulære nivåer av PSA og IL-8 ble direkte modulert av genetiske manipulasjoner, eller ved tilsetning av rekombinante proteiner, resultatene viser at oppregulering av IL-8 forsterket radioresistance av PCA-celler og samtidig nedregulert PSA. I motsetning til oppregulering av PSA medførte redusert radioresistance med samtidig nedregulering av IL-8.
Konklusjon /Betydning
relB spiller en avgjørende rolle i responsen av PCa til strålebehandling og den inverse ekspresjon av IL-8 og PSA. Resultatene identifisere en tidligere ikke sammenheng mellom IL-8 og PSA i responsen av PCA celler til strålebehandling
Citation. Xu Y, Fang F, St. Clair DK, St. Clair WH (2012) Inverse Sivil mellom Ptil og IL-8 i Prostate Cancer: et innblikk i en NF-kB-mediert mekanisme. PLoS ONE 7 (3): e32905. doi: 10,1371 /journal.pone.0032905
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 6 juni 2011; Godkjent: 07.02.2012; Publisert: 05.03.2012
Copyright: © 2012 Xu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health gir CA 49797 til DKS og CA 11580 til WHS. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den nest vanligste kreftformen i Nord-Amerika og den nest største årsaken til kreft dødsfall i amerikanske menn [1]. Serumkonsentrasjonen av PSA i menn er brukt som en indikator på sykdom i prostata og økt PSA-nivået blir brukt i stor utstrekning som en biomarkør av PCa. Strålebehandling er vanligvis brukes til å behandle tidlig stadium, ubrukelig og lokalt avansert PCa. Men om cellulær PSA kunne anvendes som indikatorer på tumor respons til radioterapi er ikke kjent.
NF-kB, en inflammatorisk responsive transkripsjonsfaktor, spiller en viktig rolle i tumorigenese og resistens overfor terapi-fremkalt cytotoksisitet [2] . Det høye nivå av konstitutiv NF-kB i kreft har vært implisert som en viktig beskyttende mekanisme mot kreft-behandling [3]. Inhibering av NF-kB blir vurdert som et mål for å øke effekten av konvensjonell kjemoterapi og radioterapi [4]. Vi har tidligere vist at overekspresjon av relB, en NF-kB element, undertrykkes PSA ekspresjon i androgen-responsive LNCaP PCA-celler, noe som antyder en negativ effekt av NF-kB på PSA uttrykk [5]. Lykketreff har vi også funnet at hos dyr som bærer relB-overuttrykt LnCap tumorer, det sirkulerende nivå av IL-8 ble øket.
IL-8, en NF-kB-aktivert cytokin, er antatt å være en viktig faktor i tumormetastase og motstand mot behandling [6] – [9]. Den sirkulerende nivå av IL-8 er økt i avansert PCa på scenen når svulsten ikke lenger reagerer anti-androgen terapi [10]. Videre er ekspresjon av IL-8 forbedrer PCa androgen-uavhengig metastase [11], [12]. Således kan ekspresjon av IL-8 har betydelig prognostisk verdi for PCa vekst og respons på behandling. Denne studien undersøkte rollene til PSA og IL-8 i radioresistance av PCA celler ved hjelp av
in vitro Kjøpe og
in vivo
tilnærminger. Resultatene avslører tidligere ukjente rollen som IL-8 og PSA som determinanter av følsomheten PCa til strålebehandling.
Resultater
NF-kB up-regulerer IL-8, men nedregulerer PSA i PCa celler
Aktivering av NF-kB veien er antatt å være en viktig faktor som bidrar til utvikling av radioresistance av kreftceller. Fordi Rela og relB er de to store medlemmer av NF-kB familie funnet i PCA-celler [13], bestemt vi effektene av forhold og relB på IL-8 og PSA ekspresjon og Radiosensitivity ved hjelp av flere tilnærminger for aktivering og inaktivering av NF -κB veien. Først Rela eller relB ble overuttrykt i LNCaP celler ved transfeksjon med sine respektive cDNA-konstruksjoner. Som vist på fig. 1A, ble nivåene av PSA ble redusert med både forhold og relB når de overuttrykkes i LNCaP-celler. I motsetning til dette, ble nivåene av IL-8 økte med både forhold og relB. Den tilsvarende effekten av RELA og relB på radioresistance av LNCaP celler var større med overekspresjon av relB.
For å manipulere NF-kB funksjon, Rela og relB cDNA konstruerer (A), Rela og relB sirnas (B), og rela og relB kjernefysisk trans hemmere (IκBαM og p100M) (C) ble transfektert inn LNCaP celler før IR behandling. Nivåene av transfekterte proteiner og den relaterte mål Ptil ble kvantifisert ved Western blot (øverste panel). De vestlige bildene ble normalisert ved β-aktin og deretter normalisert ved et kjøretøy kontroll. Brett endringer indikeres. IL-8-konsentrasjoner i mediet ble kvantifisert ved hjelp av en ELISA-sett (midtre panel). Celle levninger ble kvantifisert ved hjelp av trypanblått eksklusjon assay (nederst panel). * (P 0,05) og ** (p 0,01) indikerer statistisk betydninger i forhold til kjøretøyets styre
For det andre, ble det endogene forhold og relB i LNCaP-celler slått ned ved hjelp av RNA. interferens (RNAi) tilnærming. Rela siRNA eller relB siRNA ble transfektert inn LNCaP celler til taushet sine uttrykk. Som vist på fig. 1B, nivåene av PSA inverst korrelert til reduserte nivåer av både RELA og relB, med større effekt observert for relB. Nivåene av IL-8 ble likeledes redusert i forhold og relB slått ned i cellene, med større effekt for rela siRNA. Radiosensitivity av LNCaP-celler ble forbedret ved å redusere enten forhold eller relB (figur 1B.). Den celleoverlevelse i kontroll siRNA ble redusert til 46,3% av strålebehandling, mens celleoverlevelse ble ytterligere redusert til 30,1% eller 23,4% når forhold eller relB ble slått ned. Statistisk analyse viste signifikante forskjeller i forhold siRNA og relB siRNA sammenlignet med kontroll siRNA. Dermed knock-down av relB nesten doblet det celledrepende effekt av stråling. Imidlertid avliving av relB siRNA pluss bestråling var litt mindre enn den kombinerte effekten av siRNA alene og stråling alene. Således er det mulig at andre hit til celler som allerede var døde kan forklare denne observasjon. Tredje, ble RELA og relB hemmet ved å blokkere deres kjernefysisk trans å ytterligere bekrefte sine roller i reguleringen av PSA og IL-8 uttrykk. Mutant konstruksjon for IκBα (IκBαM) [14] eller p100 (p100M) [15] ble transfektert inn LNCaP celler til å blokkere RELA: p50 dimer eller relB: P52 dimer atomtrans hhv. Som vist på fig. 1C, svarene av PSA og IL-8 uttrykk var lik de oppnådde resultatene fra RNAi-metoden (Fig. 1B). Dermed blokkering av enten RELA eller relB kjernefysisk trans effektivt forbedret Radiosensitivity av LNCaP celler.
PSA omvendt korrelerer til IL-8 i PCA celler
PSA og IL-8 har vist seg å være viktige biomarkører i flere stadier av PCa progresjon. Vi har vist at oppregulering av IL-8, men nedregulering av PSA er assosiert med økende tumorgenisitet av PCA-celler [5]. To PCA cellelinjer ble brukt for å validere korrelasjonen av PSA til IL-8: LNCaP, en androgen responsiv PCa cellelinje uttrykker PSA og et lavt nivå av IL-8; PC3, en androgen-uavhengig PCa cellelinje uttrykker et høyt nivå av IL-8, men PSA er umulig å oppdage. Etter transfeksjon av en IL-8 cDNA ekspresjon konstruere inn i LNCaP-celler, ble de relative nivåer av PSA kvantifisert. Som IL-8-ekspresjon økes, cellulær PSA-nivåene doseavhengig redusert. I tillegg knocking- ned PSA av PSA siRNA resulterte i en doseavhengig økning i den cellulære IL-8 nivåer (fig. 2A). Videre uttrykker Ptil i PC3 cellene ført til reduksjon i IL-8 produksjon. Men det var ingen uttrykk for PSA i PC3 cellene selv når IL-8 ble knocked- ned av siRNA (Fig. 2B). Det er blitt vist at NF-kB-aktivering kan mediere prosurvival vei av IL-8: CXCR2 signalering [16]. For å undersøke om NF-kB kan være en mellommann for den observerte inverse forholdet mellom IL-8 og PSA, en NF-kB-luciferase reporter konstruksjon var co-transfektert inn LNCaP celler med Ptil uttrykk konstruere eller PSA siRNA. Som vist på fig. 2C, over- uttrykk for PSA undertrykt, men PSA mangel forbedret NF-kB-mediert transcriptional aktivering.
For å manipulere PSA og IL-8 i PCA celler, ble LNCaP celler transfektert med en IL-8 cDNA konstruere og en PSA siRNA (A); PC3-celler ble transfektert med cDNA PSA konstruere og IL-8 siRNA (B). For å teste om PSA påvirker NF-kB transkripsjonen aktivering, en NF-kB-luciferase reporter konstruksjon ble ko-transfektert med en PSA uttrykk konstruere eller PSA siRNA og en β-gal uttrykk konstruere inn LNCaP celler. Luciferase responser ble normalisert med β-gal aktivitet (C). PSA og IL-8 nivåer ble kvantifisert ved Western blot med normalisering som beskrevet i Figur 1.
PSA og IL-8 leke motsatte roller i Radiosensitivity av PCA celler
Being NF -κB regulerte genprodukter, PSA og IL-8 kan spille en viktig rolle i svarene PCa til strålebehandling. Vi manipulert derfor nivåer av PSA og IL-8 for å direkte bestemme sine roller i Radiosensitivity av PCA celler. Økende IL-8 i LNCaP-celler ved enten å behandle cellene med IL-8-proteinet (fig. 3A, øvre panel) eller stabilt transfektere IL-8 cDNA i cellene (Fig. 3A, lav panel) resulterte i en reduksjon av PSA-nivå og følsomhet for stråling. I tillegg lentiviral-baserte shRNA stabil knock-down av PSA i LNCaP-celler resulterte i økt IL-8 nivåer og redusere radiosensitiviteten av cellene (Fig. 3B). For ytterligere å bekrefte rollene til PSA og IL-8 i Radiosensitivity av PCA celler, Ptil og IL-8 i PC3 cellene ble modulert ved transfeksjon av PSA cDNA og IL-8 siRNA, henholdsvis. Lentivirus-basert ekspresjon av PSA og knock-down av IL-8 i PC3-celler førte til høye nivåer av PSA, reduksjon av IL-8 nivåer og økt radiosensitiviteten av PC3-celler (fig. 3C). Sammen utgjør disse resultatene indikerer den inverse forholdet mellom IL-8 og PSA i PCA celler og foreslår at PSA og IL-8 har motsatt effekt på Radiosensitivity av PCA celler.
For å finne ut rollene til PSA og IL- 8 i Radiosensitivity av PCA-celler, ble LNCaP-celler behandlet med IL-8-protein eller stabilt transfektert med IL-8 cDNA (A) og stabilt transducted med PSA shRNA lentivirus (B); PC3-celler ble stabilt transducted med PSA cDNA og IL-8 shRNA lentivirus (C). Nivåene av PSA ble kvantifisert ved Western blot og nivåene av IL-8 ble kvantifisert ved enten Western blot eller en Elisa kit. Celleoverlevelse ble kvantifisert ved trypan blå eksklusjons analyser. Western blot ble normalisert med kontroller og celleoverlevelse brøkdel analyse som beskrevet i Figur 1.
Up-regulering av relB reduserer Radiosensitivity av LNCaP svulst
in vivo
de ovenfor angitte data innhentet
in vitro
implisere relB og det er rettet mot, IL-8 og PSA, som har en viktig rolle i den Radiosensitivity av PCa. For å bekrefte rollen relB i Radiosensitivity av PCa og den inverse forholdet mellom IL-8 og PSA uttrykk
in vivo
ble en stabil relB-uttrykk LNCaP klone generert (fig. 4A) og subkutant injisert i flankene av nakne hannmus; tumorvekst ble overvåket i 50 dager ved å måle tumorstørrelse. Tumorvekst prisforandring ble kvantifisert etter den tid (dager) som kreves for tumorstørrelse for å nå et volum på 500 mm
3. Fig. 4B viser at gjennomsnittstiden for kontrollgruppen å nå 500 mm
3 var 54 ± 6,7 dager. Tumorvekst renteøkning i relB-uttrykt klone tok 43 ± 5,6 dager å nå 500 mm
3. Dyr med et gjennomsnittlig tumorstørrelse på 500 mm
3 ble randomisert i to grupper for 1) behandling med fraksjonert stråling (3 Gy stråling per dag i 5 dager), og 2) sham kontroller. Musene ble humant avlivet når svulster nådd maksimal størrelse på 2000 mm
3. Som vist på fig. 4C, i unradiated mus, vektor kontroll svulster vokste fra 500 mm
3-2000 mm
3 i 25 ± 3,7 dager, mens svulsten uttrykker relB nådd samme størrelse på 14 ± 2,3 dager. Ioniserende stråling (IR) effektivt hindret veksten av kontrolltumor innenfor den 50-dagers periode av forsøket. Imidlertid IR bare stanset veksten av relB-uttrykkende tumorer i 20 dager post-stråling, hvoretter tumorveksten ble observert. Forsøket ble avsluttet fordi noen mus i de bestrålte gruppene utviklet dårlige helsemessige forhold implisert av kliniske tegn på systemisk sykdom som dehydrering, anstrengt eller grunne pust, og mister 20% av deres maksimale vekt. Etter at tumorene var fjernet, ble ekspresjon av relB og nivåer av PSA og IL-8 i tumorvev kvantifisert ved anvendelse av et passende antistoff for hvert protein. I samsvar med den høye nivåer av relB identifisert i relB-uttrykt tumorer, ble IL-8 øket, men PSA ble redusert i samme tumorvev (fig. 4D).
A stabil relB uttrykt LNCaP klon ble karakterisert av Western blots (A). RelB /LNCaP-celler ble injisert i hannmus for tumordannelse og vekst rekker til 500 mm
3 (B). Tumorene ble behandlet IR (5 x 3 Gy) og tumorvolum ble målt inntil de nådde 2000 mm
3 (C). RelB, PSA og IL-8-nivåer ble kvantifisert i tumorlysatene og analyseres statistisk (D). Statistiske betydninger av tumorvolumer (C) og nivåene av målproteinene (D) mellom relB uttrykt og bærerkontroll i både no- IR og IR-behandlede grupper, er angitt.
Nedregulering av relB forbedrer Radiosensitivity av PC3 svulster
for ytterligere å validere den beskyttende rollen relB mot stråling, ble et lentivirus-basert relB siRNA PC3 klone valgt (fig. 5A) og injiseres i flankene av nakne hannmus. I kontrollgruppen siRNA-gruppen, til det gjennomsnittlige tiden for en svulst nå 500 mm
3 var 11 ± 2,1 dager, mens den gjennomsnittlige tiden i relB knock-down gruppe utvidet til 26 ± 5,1 dager (Fig. 5B). Tumorer ble behandlet med IR på 3 x 5 Gy etter tumor nådde en gjennomsnittlig størrelse på 500 mm
3. I unradiated kontroll mus, tumorstørrelsen i kontrollgruppen siRNA gruppen vokste raskt fra 500 mm
3 innen 3 til 2000 mm 15 ± 3,1 dager. Sammenlignet med kontrollgruppen siRNA-gruppen, tumorvekst i relB knock-down gruppe var betydelig lavere enn i kontrollgruppen siRNA-gruppen. IR hemmet veksten av kontrolltumor med tendensen til gjenveksten etter 20 dager post IR. Interessant, IR ikke bare kontrollert svulst gjenvekst, men det er også redusert tumorstørrelse i relB siRNA gruppen (Fig. 5C). Forskjellene observert
in vivo
er ikke enkle refleksjoner av vekstforskjeller
in vitro
fordi det ikke er noen signifikant reduksjon i cellevekst når relB ble stabilt slått ned i PC-3 celler. Således er det bestrålingssensibilisering effekt ved knock-down av relB grunn av hemming av strålings-induserbar NF-kB-aktivering. Virkningene av siRNA-mediert knock-down av relB ble bekreftet ved Western blot analyser av relB og IL-8 i tumorvev (fig. 5D). Disse resultatene støtter rollen relB i responsen av PCa til strålebehandling.
En lentivirus-basert relB siRNA knock-down PC3 klonen ble preget av Western blot (A). RelB shRNA /PC3-celler ble injisert i hannmus av tumordannelse (B). Tumorene ble behandlet med IR (3 x 5 Gy) når tumorvolumene nådde 500 mm
3 og tumorene ble tillatt å vokse til 2000 mm
3 (C). RelB og IL-8-nivåer ble kvantifisert i tumorlysatene og analyseres statistisk (D). Statistisk analyse for tumorvolum og nivåene av target proteiner som beskrevet i figur 4.
Diskusjoner
PSA er et androgen reseptor (AR) -regulated serin protease produsert av prostata epitelceller [17]. Selv om en forhøyet serum PSA-nivå korrelerer med tilstedeværelse av PCa, mange faktorer, så som inflammasjon, infeksjon, prostatisk hyperplasi samt vev prosesser føre til visse tap av integritet av prostatakjertelen, og lekkasje av PSA fra lumen til den mellomliggende væske og inn i den generelle sirkulasjon. [18], [19]. I tillegg kan PCa være til stede i fravær av forhøyede serum PSA-nivå [20]. Det er faktisk ingen detekterbare nivåer av PSA i androgen-uavhengig PCA-cellelinjer, slik som PC3 og DU-145. Selv om PSA blir brukt som en biomarkør for diagnose av PCa, dens biologiske funksjon er ikke blitt fullstendig klarlagt. Resultatene fra denne studien viser at celle PSA-nivået kan være en viktig indikator på PCa celle respons på IR. Nedregulering av PSA i androgen responsiv LNCaP-celler fører til redusert Radiosensitivity og ekspresjon av PSA i androgen-uavhengig PC3 celler resulterer i forbedret radiosensitiviteten, noe som tyder på at PSA spiller en viktig rolle i responsen av PCA-celler til radioterapi.
IL-8, et pro-inflammatorisk cytokin, entydig uttrykk i androgen-uavhengig PCA-celler, men ikke i androgen-responsive PCA-celler [8], [21]. Forhøyede IL-8 nivåer i avansert PCa har vært ansett for å være en viktig faktor som bidrar til kreftcellevekst og overlevelse etter behandlinger [6], [12]. Denne studien viser en interessant sammenheng mellom Ptil og IL-8 i responsen fra PCA celler til strålebehandling. Den omvendte forholdet mellom PSA og IL-8 uttrykk forvirrer en konklusjon om at de observerte forandringer i radiosensitiviteten av PCa er avhengig av PSA-nivå; alternativt kan den observerte effekten av PSA være formidlet, delvis, ved en endring i IL-8-nivå. Dataene som presenteres i denne rapporten direkte viser rollen som IL-8 i Radiosensitivity av PCA celler. Sammen utgjør disse resultatene markere den intrikate forholdet mellom IL-8 og PSA, som bidrar til responsen av PCA-celler til radioterapi.
NF-kB er konstitutivt aktiv i mange kreftformer, og det virker i opp-regulering av antiapoptotic og onkogene gener [10], [22], [23]. En annen viktig biologisk funksjon av NF-kB er knyttet til samordning av den medfødte og ervervede immunresponser som opprettholder cellulære forsvarssystemer [3]. Hemming av NF-kB anses derfor et nyttig supplement til tradisjonell kjemoterapi eller radioterapi. NF-kB består av fem Rel-beslektede proteiner, som inneholder den forhold /P50 heterodimeren-mediert klassiske veien og relB /P52 heterodimeren-mediert alternativ bane [3], [10], [13]. RelB er unikt uttrykt i avanserte PCA-celler og relB-basert alternativ reaksjonsvei spiller en viktig rolle i den tumorigenesis av PCa [24], [25]. Vi har tidligere vist at selektiv inhibering av den alternative reaksjonsvei bemerkelsesverdig undertrykker tumorigenisitet av PCA-celler [5], [26], [27]. Resultatene fra denne studien viser at relB kan også spille en viktig rolle i den radioresistance av PCA-celler, delvis via en omvendt effekt på de uttrykk for IL-8 og PSA.
AR-aktivitet er essensiell for PCa initiering og progresjon. Selv når PCa utvikler seg til hormon ildfast fase, forblir AR signalering gjennom en rekke av androgen-uavhengige mekanismer [28]. Dermed ablasjon av AR-funksjonen er målet for førstelinjebehandling. Selv om disse behandlingene er i utgangspunktet effektive, oppstår tilbakevendende svulster med restaurerte AR aktivitet [29] eller med andre ligand binding reseptorer [30]. Som en AR mål, overvåker PSA screening forvaltningen av PCa. Imidlertid er tilstedeværelsen av AR ikke tilstrekkelig for å forutsi effektivitet av behandlingen fordi nivået av PSA kan også reguleres av mange andre faktorer. Et stort antall studier har vist at både AR og NF-kB signale er viktige faktorer i utviklingen av PCa. Restaurering av AR-aktivitet i fravær av androgen er ansett som en mekanisme for PCa som det utvikler seg til den hormon ildfaste trinn [29]. I tillegg er NF-kB-mediert IL-6-STAT3 aktivering er antatt å være en viktig mekanisme for tumormetastase [31]. Imidlertid er krysstale mellom de to signalveier unnvikende. Resultatene av denne studien viser at overekspresjon av relB øket cellenivå av IL-8, men reduserte nivået av PSA, noe som tyder på at NF-kB målgener forskjellig vis kan bli regulert av forskjellige medlemmer av NF-kB familie eller som relB kan tjene som co-aktivator for IL-8 transkripsjon mens han tjenestegjorde som en negativ co-regulator for PSA transkripsjon. Det har vist seg at kombinasjonen av relB og aryl hydrokarbon-reseptor (AhR) kan aktivere transkripsjon fra et relB /AhR element som ligger plassert oppstrøms fra den IL-8-kB området [32]. Det har også blitt vist at NF-kB undertrykker PSA transkripsjon gjennom en androgen reseptor element plassert i promoterregionen av et gen [33]. Våre funn er i overensstemmelse med den mulighet at NF-kB ikke bare har kapasitet til å aktivere sin målgen, men også for å hemme dets mål-genet avhengig av sammensetningen av faktorer som påvirker transkripsjonen.
strålebehandling bevirker vekststans og død i kreftceller, enten ved direkte ionisering av DNA eller ved generering av reaktive oksygenarter (ROS) som kan skade DNA. Det er blitt vist at genotoksiske midler, inkludert IR, indusert ved dobbeltstrengbrudd (DSB) stimulere NF-kB vei til å generere positiv tilbakekoplingssløyfer via cytokinproduksjon, noe som i sin tur aktiverer DNA-reparasjonsmekanismene [34] – [36]. Cytokin-aktiverte NF-kB veien kan også føre til induksjon av antioksidant enzymer, som beskytter kreftceller mot ROS genererer therapeutics. Våre tidligere studier som viser at inhibisjon av NF-kB og dens antioksidant mål, mangan superoksyd dismutase (MnSOD), bemerkelsesverdig øker Radiosensitivity av aggressive prostatakreftceller [5], [25], er i overensstemmelse med de funn for dette senere mekanisme.
Den mekanismen som PSA kan modulere cellulær respons på strålebehandling fortsatt ukjent. Det er mulig at den observerte negative effekten av PSA skyldes delvis til økningen i IL-8-nivå når PSA er redusert. Faktisk ble omvendt sammenslutning av PSA og IL-8 observert i begge androgen-responsive og androgen-uavhengig PCA celler, noe som tyder på at den økte forholdet mellom IL-8 til Ptil bidrar til radioresistance av PCA celler. Future studie for å finne ut hvordan nivået av PSA påvirker produksjonen av IL-8 ville være interessant.
I sammendraget, bruker denne studien komplementære eksperimentelle tilnærminger for å vise at relB bidrar til radioresistance av PCA celler og omvendt regulerer IL -8 og PSA uttrykk. Den omvendte forholdet mellom IL-8 og PSA nivåer er prediktiv for responsen fra PCA celler for stråling, noe som tyder på potensialet for å forbedre strålebehandling av PCa ved direkte modulering av IL-8 og /eller PSA nivåer. Dette er den første eksperimentelle bevis for å implisere rollen av PSA i radioterapi av PCA-celler. Innsikt hentet fra denne studien gi et vitenskapelig grunnlag for bruk av IL-8 /PSA-forholdet som en mobil indikator for forvaltningen av PCA celler ved stråling.
Materialer og metoder
Cellekultur og behandling
human prostata carcinoma LNCaP og PC3 (American Type Culture Collection, ATCC) ble dyrket og opprettholdt i RPMI-medium med 10% føtalt bovint serum. Celler ble behandlet med IR anvendelse av en 250 kV røntgenmaskin (Faxitron røntgen Corp.) med maksimal energi på 130 kV, 0,05 mm Al-filter, i en dose på 0 til 5 Gy. For å undersøke effekten av IL-8 på strålings responser, ble LNCaP-celler forbehandlet med IL-8 (BD Biosciences) i konsentrasjoner på 0 til 100 pg /ml i 12 timer før stråling. Radiosensitivity av PCA celler ble kvantifisert ved hjelp av celleoverlevelse brøkdel bestemmes av trypanblått eksklusjon analysen, som tidligere beskrevet [26].
Cell transfeksjon
For å uttrykke RELA, relB, PSA, IL-8, p100M og IκBαM proteiner i PCA celler, ble uttrykk konstruerer koding disse proteinene brukes. Rela (p65) uttrykk konstruere er en gave fra laboratoriet av Nancy Rice (NIH); den p65 cDNA ble klonet mellom H
ind
III – X
ba
setene i pRC-CMV vektor; RelB, Ptil og IL-8 uttrykk konstruksjonene ble kjøpt fra Åpne Biosystems. RelB Katalog Nr .: MHS1010-7507797; PSA Katalog Nr .: MHS1010-9205472; IL-8 Katalog Nr .: MHS1010-58052. CDNA ble klonet mellom E
COR
V – N
ot
setene i pCMV-Sport6 vektor; P100M konstruksjon ble gitt av Dr. Shao-Cong Suns lab ved Pennsylvania State University [37]. P100M sekvensen ble klonet mellom H
ind
III – X
ba
setene i pCMV4 vektor; IκBαM konstruksjon ble gitt av Dr. Bill Imbert laboratorium, vedheft cellulaire, Hôpital de Sainte Marguerite, Marseille, Frankrike. IκBα (S32-36A) mutant sekvens ble klonet ved E
Kor
V nettstedet i pcDNA 3,1 vektor. Alle vektorene inneholder en CMV-promoter, og ble anvendt uten noen induserbar tilstand. De stabile transfekterte kloner ble utvalgt ved neomycinresistens. Å slå ned endogen RELA, relB, Ptil og IL-8 i PCA celler, ble den spesifikke siRNA (Santa Cruz Biotech.) Transfektert. Lentivirus-basert shRNA konstruerer (Open Biosystems) ble brukt til å stabilt knock-down målene i henhold til produsentens instruksjoner. Nivåene av proteiner ble bekreftet ved Western blot. En NF-kB-luciferase reporter plasmid inneholdende fire kopier av NF-kB elementer som er koblet til en SV40 promoter i pGL3 vektor (Promega) ble tidligere konstruert [25]. Reporteren konstruksjonen ble ko-transfektert med PSA-ekspresjonsvektoren eller PSA siRNA (Santa Cruz Biotech.) Og β-galaktosidase (β-gal) konstruere inn i LNCaP-celler for å bestemme virkningen av PSA på NF-kB transkripsjonen aktivering.
Dyr
Fire uker gammel mannlig NCRNU (nu /nu atymiske nakne) mus ble kjøpt fra Taconic (Hudson). 1,8 x 10
6 PCA-celler blandet med Matrigel (BD Biosciences) ble injisert inn i de riktige flankene av musene. Tumorvolumer ble beregnet ukentlig ved hjelp av en standard formel (A × B
2 × 0,52, A og B representerer diagonal svulst lengder). De tumorvev ble oppsamlet, og 100 ug vev ble lysert for å kvantifisere protein nivåer ved hjelp av Western blot. Dyreforsøk prosedyrene ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Kentucky, godkjenning Protokoll nr 01077M2006.
Western blot.
For å kvantifisere protein nivåer, celler og vev ekstrakter ble separert ved hjelp av SDS-PAGE, 8% (vekt /volum) polyakrylamidgel, og deretter overført til en nitrocellulosemembran og blottet med primære antistoffer mot rela, relB, P100, IκBα, PSA, IL-8 og β-aktin. Et geit anti-mus IgG HRP-konjugert sekundært antistoff ble anvendt for å detektere forhold, PSA, IL-8, og β-aktin. Andre proteiner ble påvist ved anvendelse av et geite-anti-kanin-IgG-HRP-konjugert sekundært antistoff. Immunoblot ble visualisert ved et forbedret kjemiluminescens påvisningssystem (ECL, Amersham Pharmacia Biotech.).
IL-8 kvantifisering
Dyrkede media ble oppsamlet ved slutten av forsøksprosedyrer. Nivåene av IL-8 utskilt fra dyrkede celler ble kvantifisert ved anvendelse av et IL-8 ELISA-sett (BD Biosciences) i henhold til produsentens protokoll.
Statistiske data analyser
Flere uavhengige eksperimenter ble utført for hvert sett av data. Bilder i Western blot ble kvantifisert ved hjelp av Carestream Molecular Imaging-programvaren (Carestream Health Inc.). Statistisk signifikans ble analysert ved anvendelse av en enveis ANOVA og Tukey multiple sammenligningstest, etterfulgt av data analyse med Graphpad Prism.
