Abstract
Bakgrunn og formål
Transkripsjonell faktor E2A er avgjørende for normal utvikling og differensiering av B- og T-lymfocytter. Feilregulering av E2A fører til leukemi og tumorigenesis av noen solide svulster. Uttrykket og kliniske betydning av E2A, så vel som dens rolle i kolorektal cancer (CRC) er fortsatt ukjent. Denne studien tar sikte på å vurdere E2A uttrykk i CRC vev, evaluere sin prognose verdi, og undersøke dens rolle i tykktarmskreft cellevekst.
Metoder
E2A uttrykk i CRC vev og normal slimhinne ble oppdaget av immunhistokjemisk farging; Kaplan-Meier-overlevelseskurve og Cox regresjonsmodell ble brukt for å evaluere den prognostiske verdi av E2A. Lentivirus ble anvendt for å konstruere E2A stabilt banket ned celler. MTT-analysen ble anvendt for å detektere endringen celleproliferasjon; cellesyklus ble analysert ved flow-cytometri; og kromatin immunpresipitering (chip) assay ble brukt til å validere den anslåtte bindende mål for E2A
Resultater
Uttrykk for E2A var lavere i CRC vev enn normal slimhinne.; lav E2A uttrykk korrelert med avansert TNM stadium og større tumor størrelse, og spådde dårlig prognose av CRC pasienter. E2A knockdown resulterte i økt celleproliferasjon sats og cellesyklus akselerasjon. ChIP analysen viste MIR-320a var et direkte mål for E2A og oppregulering av MIR-320a i E2a downregulated cellene kan reversere celleproliferasjon og cellesyklus endringer forårsaket av E2A mangel.
Konklusjoner
E2A er en uavhengig prognostisk faktor for CRC pasienter og mål MIR-320a for å regulere celledeling av tykktarmskreftceller
Citation. Huang A, Zhao H, Quan Y, Jin R, Feng B, Zheng M (2014) E2A spår Prognose for pasienter med kolorektal kreft og regulerer veksten av kreft celler ved Targeting MIR-320a. PLoS ONE 9 (1): e85201. doi: 10,1371 /journal.pone.0085201
Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA
mottatt: 3. september 2013, Godkjent: 25 november 2013; Publisert: 13 januar 2014
Copyright: © 2014 Huang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av National Natural Science Foundation of China (NSFC, 30873000). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
pattedyr E2A-genet er lokalisert på kromosom 19 og er ikke-vev-spesifikt og ubikvitært uttrykt i et bredt spekter av celletyper. Ved alternativ spleising, koder E2A-genet to isoformer, E12 og E47 (kollektivt omtalt som E2A proteiner), som begge har den grunnleggende-helix-loop-helix (bHLH) domene og kunne regulere gen transkripsjon ved binding til E-box DNA sekvenser, CAGGTG. Selv om mye uttrykt, er E2A ikke avgjørende i noen organogeneses som skjelett- eller hjerte myogenesen, erytropoese chondrogenesis, og neurogenesis [1], men spiller en viktig rolle i utvikling og differensiering av B [2], [3] og T-lymfocytter [4 ]. E2A mangelfull mus viste en arrest på pro-B-cellen trinn under B-celle utviklingen [3] og transgene ekspresjon av enten E12 eller E47 kan delvis berge B lymphopoiesis initiering; Tilsvarende E2A mangel ført til en blokk på det tidligste stadium av T-celle utvikling [4] og forstyrret thymocytt positiv utvelgelse [5]. Videre E2A er blitt funnet å være involvert i visse cellulære aktiviteter, inkludert celledifferensiering [6], proliferasjon [7], apoptose [8], cellesyklus [9] og epitelial-mesenchymale overgang (EMT) [10].
i tillegg til sin avgjørende rolle i normal B og T-celle utvikling, E2A deltar også i tumorigenesis. Studier har rapportert den vel-etablerte rollen til E2A i leukemogenesis: to fusjonsproteiner, E2A-HLF [11] og E2A-PBX1 [12], begge inneholdende de trans domene av E2A og det DNA-bindende domene av HLF eller PBX1, kunne føre til pro-B-celle akutt lymfoblastisk leukemi (ALL) hos ungdom og pre-B-celle-ALL i barn henholdsvis [13]. Videre E2A er blitt funnet å være involvert i onkogenesen av faste tumorer, enten som onkogenet eller som tumor-suppressor-gen. Tilstedeværelse av E2A-PBX1 fusjonsprotein i lungekreft ble nylig rapportert og det korrelert med total overlevelse av pasienter med lunge adenokarsinom in situ [14]. Øket ekspresjon av E2A ble påvist i brystkreft [15], [16] og prostatakreft [17], som det ble funnet å fremme onkogenese. Men mus med null mutasjon av E2A var utsatt for spontant utviklet thymus lymfomer [18] og tap av E2A i primær effusjon lymfom førte til apoptoseresistens [19], noe som tyder på det alternative rollen E2A som en svulst-suppressor genet. Videre har E2A uttrykk blitt foreslått å være av diagnostisk verdi i bestemt undergruppe av gastrisk MALT (mucosal-assosiert lymfoid vev) lymfom [20]. Til sammen kan E2A fungere som en tumor-suppressor gen eller som et onkogen i ulike kreftformer.
uttrykk for E2A i tykk- og endetarmskreft (CRC) og dens prognostisk verdi har ikke vært diskutert før, og det er fortsatt ukjent om E2A fremmer eller undertrykker utviklingen av CRC. I denne studien, til vår kunnskap, for første gang vi undersøkte den kliniske betydningen av E2A i CRC og fant sin nytte som en prognostisk markør; Videre fant vi E2A undertrykte tumorvekst ved å målrette MIR-320a i tykktarm kreft celler, demonstrere sin tumor-undertrykkende rolle i CRC.
Metoder
Pasienter og kliniske prøver
totalt 98 pasienter med kolorektal kreft ble inkludert; pasientene ble behandlet med operasjon mellom juni 2007 og januar 2008 på Shanghai minimal invasiv kirurgi Center. Pasienter ble ekskludert dersom de: hadde fått neoadjuvant kjemoradioterapi; hadde unresectable kolorektal kreft; hadde svulster i andre organer; var usannsynlig å bli intervjuet i løpet av oppfølgingen. Demografiske og clinicopathological data ble hentet av diagrammet gjennomgang. Pasientene ble intervjuet på telefon at tre måneder, seks måneder, og deretter årlig etter operasjonen. Tumorprøver ble skåret umiddelbart etter kirurgiske prøver «fjernelse under operasjonene og deretter fiksert med formalin og konservert ved 4 ° C i to uker før den neste behandlingen; normale vev ble definert som slimhinner plassert i det minste 5 cm borte fra tumor margin og snitt, faste, konservert og behandlet som ovenfor. Denne studien ble gjennomført med skriftlig informert samtykke fra alle inkluderte pasienter før operasjon og under protokollen godkjent av etisk komité Ruijin Hospital Shanghai Jiao Tong University School of Medicine.
Immunohistochemistry og scoring
immunhistokjemi farging ble utført som tidligere beskrevet protokoll [21]. Kort fortalt, etter fiksering med formalin, ble vev embedded med parafin, kutt, og montert på lysbilder. Deretter ble objektglassene vasket med xylen for å deparaffinize, med gradert etanol for å rehydrere, inkubert med citrat-buffer for å hente antigen, og blokkert med 3% H
2o
2 for å inaktivere endogen peroksidase. Glassene ble inkubert med E2A primært antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA; 1:200 fortynning) ved 4 ° C over natten, etterfulgt av inkubasjon med pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert geite-anti-kanin-sekundært antistoff (Santa Cruz) i 30 minutter ved værelsestemperatur. Komplekset visualisering ble utført med en to-løsning DAB Kit (Invitrogen). Negative kontroller ble oppnådd ved å erstatte E2A primære antistoffet med pre-immunt kaninserum.
Lysbilder ble undersøkt av to forskere (Huang og Quan) uavhengig. Scoring kriterier som ble brukt var som tidligere beskrevet med mindre modifikasjoner. Fargeintensitet ble scoret som 0 (ingen farging), en (svak farging), 2 (moderat farging) og 3 (sterk farging); positive celler på hver del ble bedømt som 0 (mindre enn 10%), 1 (10% -25%), 2 (26% -50%), og 3 ( 50%). Sluttresultatet var et produkt av scorene til intensitet og positiv celle i hvert lysbilde. Lysbilder med resultatet 0-3 ble definert som lav uttrykk og 4-9 så høyt uttrykk.
Cell kultur
Tykktarmskreft cellelinjer Løvø, HCT116, Caco-2, HT29, SW480, og SW1116 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket og bevart ved Shanghai Institute of Digestive Surgery; normale menneskelige kolon mucosal epitel celle NCM460 ble velvillig donert av Jingqing Zeng (Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, den donator kjøpte NCM460 cellelinje fra Incell Corporation, LLC, San Antonio, TX, USA). Løvø var dyrket i F-12K Nutrient Blanding Medium (Corning Cellgro®, MA, USA), HCT116 og HT29 i McCoys 5A (Corning Cellgro®), SW480 og SW1116 i Leibovitz «L-15 (Corning Cellgro®), og NCM460 i DMEM (Corning Cellgro®). Alt dyrkingsmedium ovenfor ble supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Caco-2 ble dyrket i Minimum Essential Medium (Corning Cellgro®) med 20% FBS. Cellene ble plassert i inkubator (Heracelles, Tyskland) ved 37 ° C, i en fuktig atmosfære med 5% CO
2.
Protein ekstraksjon og Western-blot
celler ble høstet ved en sammenfletting av 80% med RIPA (Solarbio, Beijing, Kina) og proteinkonsentrasjonen ble bestemt med BCA protein Assay Kit (Thermo Scientific, USA) ved å måle OD
562 bruker mikroplateleser (Epoch, BioTek, Winooski, USA) . Western blot ble utført i henhold til tidligere rapporterte protokollen [22] og primære antistoffer som ble brukt var E2A (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA). GAPDH (Kangchen, Shanghai, Kina) ble brukt som lasting kontroll.
RNA og mikroRNA isolasjon, QRT-PCR
Totalt celle RNA ble ekstrahert ved Trizol reagens (Invitrogen) og totale celle microRNAs ( mirnas) ble ekstrahert med Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). RNA revers transkripsjon ble utført ved hjelp PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time (Takara, Shiga, Japan). MRNA nivået av E2A (frem: 5′-CCACT TCACT GAGTC GCACAG-3 «; omvendt: 5′-GTCTC TCCCG AAGGA GGCATA-3′) ble evaluert ved QRT-PCR, ved hjelp av SYBR Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems); RNA nivå av GAPDH (frem: 5»-GGAGC GAGAT CCCTC CAAAAT-3 «; omvendt: 5′-GGCTG TTGTC ATACT TCTCA TGG-3») ble brukt for normalisering. Uttrykket av MIR-320a ble evaluert av QRT-PCR bruker Taqman mikroRNA RT Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), TaqMan mikroRNA Analyser (Applied Biosystems), og Taqman universell PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), i samsvar med produsentens instruksjoner; U6 miRNA nivået ble brukt for normalisering.
Lentiviral transfeksjonsteknologier for stabile uttrykk kloner
E2A /shRNA-EGFP-lentivirus partikler og E2A /sh-negativ kontroll (SHNC) -eGFP-lentivirus partikler , nemlig E2A /shRNA-LV og E2A /SHNC-LV, ble kjøpt fra Novobio (Shanghai, Kina). SHNC ble syntetisert med den samme baser av shRNA men med egge sekvens. Lentiviral transfeksjon og celle screening ble utført i henhold til produsentens instruksjoner for å etablere E2A stabilt downregulated og stabilt NC transefected SW480 kloner, dvs. SW480 /shE2A og SW480 /SHNC. Transfeksjon effektivitet ble evaluert ved visuell undersøkelse av prosenten av EGFP-uttrykkende celler under fluorescens mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan), western blot, og QRT-PCR.
Transient transfeksjon
Plasmider, Pez-M29-E12 (plasmid koding isoform E12), Pez-M29-E47 (plasmid koding isoform E47), Pez-M29-NC (plasmid med negativ kontroll sekvens) og vektor kontroller ble kjøpt fra Genecopoeia (Rockville, MD, USA) og validert ved sekvensering; miRNA-320A ligner (dobbel tråd RNA-molekyler som etterligner MIR-320a) og etterligner NCs (negativ kontrollsekvenser basert på C. elegans microRNAs har minimal sekvens identitet i human) ble kjøpt fra GenePharma (Shanghai, Kina). Celler av log fase ble høstet og sådd ut i 6-brønns plater ved en tetthet på 4 * 10
5-celler /brønn, 24 timer før transfeksjon. Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) ble anvendt for transfeksjon, i samsvar med produsentens anvisninger. Effektivitet av transient transfeksjon ble undersøkt av western blot eller QRT-PCR. Celler transfektert med vektorer ble brukt som kontroll.
Celleproliferering analysen
Celleproliferering Analysen ble utført med Cell Counting Kit-8 (CCK8) (Dojindo, Kumamoto, Japan). I korthet ble cellene spaltet med trypsin (Beyotime, Shanghai), vasket med fosfat-bufret saltvann (PBS) to ganger, filtrert med en sil (BD Falcon), resuspendert i RIPA 1640 medium, telles og fortynnet til en sluttkonsentrasjon på 5 celler /mikroliter. Da celler ble sådd i 96-brønns plater, 200 pl (1000 celler) per brønn, i sixplicate, og plassert i inkubator i 6 dager. Levedyktige celler ble kvantifisert ved hvert 24 timers intervall med CCK8, i henhold til produsentens protokoll, og absorbansen ved 450 nm ble målt ved hjelp av mikroplateleser (epoken, BioTek).
cellesyklusanalyse
Før analyse ble celler (2 x 10
6) ble høstet 48 timer etter forbigående transfeksjon, så vel som de tilsvarende kontroller. Deretter ble cellene vasket to ganger med iskald PBS, fiksert med 75% etanol og lagret ved 4 ° C over natten. Ved analyse ble cellene vasket to ganger med PBS og ble behandlet med RNase ved 37 ° C i en time, etterfulgt av farging med propidium jodid i 30 minutter i mørke. Cellesyklusanalyse ble deretter utført med flowcytometri (FACSCalibur, Becton Dickinson, MD, USA).
Chromatin immunoprecipitation analysen
EZ-Chip ™ Chromatin Immunpresipitasjon Kit (Millipore, Billerica, MA, USA ) ble kjøpt for å utføre chip-analysen, i henhold til produsentens protokoll. I korthet, ble en 15 cm cellekulturplate av SW480-celler (ca. 80% konfluens) fiksert med 1% PFA (Sigma). Deretter ble cellene lysert, sonikert for å skjære DNA, og immunopresipitert med anti-E2A (Santa Cruz) og kontroll-antistoff (IgG). Deretter ble protein /DNA tverrbinding reversert, og DNA ble renset for påfølgende PCR, ved bruk av Takara Ex Taq Hot Start-versjon (Takara).
Statistisk analyse
Alle statistiske analyser ble utført ved å bruke SPSS 15.0 programvaren. Korrelasjonen av kliniske faktorer med E2A-ekspresjon ble undersøkt ved Pearson korrelasjonsanalyse. Effekten av E2A på overlevelse ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier kurve og log-rank test. Univariat og multivariat Cox proporsjonal farer modell ble brukt for å evaluere effektene av E2A uttrykk og clinicopathological parametre på 5-års OS og DFS, henholdsvis. Students t test ble benyttet for å analysere forskjeller mellom de to grupper og en-veis ANOVA ble anvendt i tilfelle av data besto av mer enn to grupper. En to-tailed verdi på
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Uttrykk for E2A korrelert med CRC patologiske etapper
For det første, vi evaluerte ekspresjonen av E2A protein i CRC-vev og normal slimhinne ved immunhistokjemi (figur 1). Kolorektale vevsprøver hentet fra 98 CRC pasienter og normal slimhinne tilgjengelig fra 43/98 pasienter ble undersøkt. De demografiske og clinicopathological parametre for alle inkludert pasienter som var vist i tabell 1. Av de 98 pasienter, ble høy ekspresjon av E2A detektert i normal slimhinne 35/43 og 39/98 tumorvev (
P
0,01) . Farging av E2A i normal slimhinne presentert i kjernen og cytoplasma begge, men i kreftvev, E2A-farging var overveiende atom (figur 1). Enda viktigere, ekspresjon av E2A redusert som CRC avansert (figur 1E-H). Vi deretter gjort en korrelasjonsanalyse for å studere sammenhengen mellom E2A uttrykk og clinicopathological faktorer. Som vist i tabell 2, var lav ekspresjon av E2A signifikant assosiert med høyere TNM trinn (
P
0,01) og større tumorstørrelse (
P
= 0,035), men var ikke relatert til pasienter alder (
P
= 0,761), kjønn (
P
= 0,655), tumorhistologi (
P
= 0,985), eller svulst nettstedet (
P
= 0,120). Dermed E2A var sannsynlig å bli involvert i utvikling og progresjon av CRC
Representative bilder av IHC er vist som:. (A) HE farging av normal slimhinne; (B) HE farging av CRC vev; (C) høy E2A uttrykk (brun farge) presentert som kjernekraft og cytoplasma farging i normal slimhinne; (D) lav E2A ekspresjon i normal slimhinne; (E-H) trinn I (E) til trinn II (F), III (G) og IV (H) CRC vev med forskjellige E2A fargingsintensitet; E2A dukket hovedsakelig i kjernen. Bilder ble tatt under 200 × forstørrelse.
Lav uttrykk for E2A spådd dårlig prognose av CRC pasienter
For å undersøke den prognostiske verdien av E2A, brukte vi Kaplan -Meier 5-års overlevelse kurven for å vise forskjellene i resultater mellom lave og høye E2A uttrykk CRC pasienter. Som vist i figur 2, pasienter med høy E2A ekspresjon hadde lenger fem-års overlevelse (OS) og sykdomsfri overlevelse (DFS) enn pasienter med lav ekspresjon. Den 5-årige OS og DFS for høy E2A uttrykk pasientene var 84,6% og 82,1%, og for pasienter med lav E2A uttrykk var 47,5% og 42,4% (
P
= 0,000, for OS og DFS begge). Neste, vi ansatt Cox regresjonsmodell for å undersøke den prognostiske verdien av E2A. I univariat analyse, ble TNM stadium og E2A uttrykk funnet å være prediktiv for OS og DFS; mens i multivariat analyse, begge faktorer også spådd dårligere kliniske resultater (tabell 3). Derfor E2A uttrykk syntes å være et nyttig prediktiv faktor for prognose av CRC pasienter
(A) OS for høy og lav E2A uttrykk pasienter.; (B) DFS for høy og lav E2A uttrykk pasienter. Pasienter med høy E2A uttrykk har gunstigere OS og DFS (
P
= 0,000, for OS og DFS begge).
Bilder
hemming av celleproliferasjon ved E2A i CRC celler
med tanke på kliniske betydningen av E2A, ønsket vi å spørre om E2A spilt en rolle i utviklingen av CRC. Seks tykktarm kreft cellelinjer, Løvø, HCT116, Caco-2, HT29, SW480, og SW1116 og normal human tykktarm mucosal epitel celle NCM460 ble screenet for E2A uttrykk ved hjelp av western blot (figur 3A). Av de syv cellelinjer, NCM460 viste mye høyere E2A uttrykk nivå enn alle andre kreftceller. Tatt sammen med sitt uttrykk i CRC pasienter, ble E2A signifikant nedregulert i CRC vev og celler.
(A) Uttrykk for E2A i normal menneskelig kolon mucosal epitel celle NCM460 og CRC cellelinjer ble vist av western blot. GAPDH ble brukt som lasting kontroll; (B) og (D) Celler med downregulated E2A uttrykket (SW480 /shE2A, Caco-2 /shE2A) viste økt celleproliferasjon hastighet enn den for den negative kontrollen (SW480 /SHNC, Caco-2 /SHNC) og villtype (SW480 /WT, Caco-2 /vekt) celler; (C) og (E) parentale celler (SW480 /shE2A, Caco-2 /shE2A) ble ko-transfektert med E12 eller E47 plasmid (SW480 /shE2A_E12 og SW480 /shE2A_E47, Caco-2 /shE2A_E12 og Caco-2 /shE2A_E47) å gjenopprette E2A uttrykk. Ko-transfekterte celler viste nedsatt celleformering hastighet enn det paren eller vektorkontroll (SW480 /shE2A_VC, Caco-2 /shE2A_VC) transfekterte celler. Alle data representeres som middelverdi ± SD fra 3 uavhengige eksperimenter. (*,
P
0,05).
For å direkte undersøke funksjonen av E2A, vi bygget E2A stabilt slått ned klone, SW480 /shE2A celler, og den negative kontrollen klone, SW480 /SHNC celler, med E2A /henholdsvis shRNA-LV og E2A /SHNC-LV. Knockdown effektivitet ble validert av western blot og QRT-PCR (figur S1 A). Så, vi har oppdaget endringene celle spredning av SW480 /shE2A og SW480 /SHNC celler med MTT-analyse, ved hjelp av villtype SW480 celler (SW480 /WT) som kontroll. Som vist i figur 3B, SW480 /shE2A viste høyere spredningshastighet enn SW480 /SHNC og SW480 /WT-celler, noe som indikerer en undertrykkende rolle E2A i proliferasjon. For ytterligere å demonstrere anti-spredning rolle E2A, vi utførte kotransfeksjonen i stabile SW480 /shE2A celler med to plasmider, Pez-M29-E12 (koding isoform E12) og Pez-M29-E47 (koding isoform E47) for å oppveie downregulation effekt ved shE2A. Co-transfeksjon reddet E2A ekspresjon av SW480 /shE2A celler til normalt nivå (fig S1 A) og også gjenopprettet formeringshastigheten (figur 3C). Videre transfeksjon av E12 eller E47 inn i villtype SW480-celler ble signifikant hemmer celleproliferasjon og inhiberings effekter forårsaket av E12 og E47 viste ingen forskjeller (figur S1 B). For å utelukke cellelinje avhengig mulighet, konstruerte vi Caco-2 /shE2A og Caco-2 /SHNC kloner å gjenta forsøkene ovenfor og resultatene viste E2A hadde samme anti-spredning rolle i Caco-2 celler (Figur 3D E) . I tillegg manipuleres vi E2A uttrykk i NCM460 celler. E2A taushet restaurering også påvirket NCM460 cellevekst i en undertrykkende måte (figur S1 C). Sikkert, E2A kan være en negativ regulator av spredning i tykktarm kreft celler.
E2A regulert cellecyklusprogresjonen av SW480 celler
Neste vi ønsket å vite hvilke mekanismer gjennom hvilke E2A regulerte SW480 celleproliferasjon. I tidligere publikasjoner, ble E2A rapportert å være involvert i cellesyklusregulering [9], [23], [24]. Derfor har vi gjort cellesyklus analyse av flowcytometri for å oppdage mulige endringer etter E2A downregulation og restaurering. Konsekvent, endringen av cellesyklus forklart forandring i celleformering: som vist i Figur 4A, cellesyklus av SW480 /shE2A celler avvek fra SW480 /SHNC og SW480 /WT-celler, med flere celler kommet inn i S-fasen, noe som indikerer øket celleproliferasjon. Når SW480 /shE2A-celler ble ko-transfektert med enten E12 eller E47 plasmid, cellesyklusen var normalisert, som var i overensstemmelse med restaurering av celleproliferering (figur 4B). Videre transfeksjon av E12 eller E47 inn i villtype SW480 resulterte i en reduksjon av S-faseceller (figur S1 D). Lignende regulering effekter ble også sett i NCM460 celler (Figur S1 E). Dermed E2A kan regulere cellesyklus for å kontrollere cellevekst
(A) nedregulering av E2A i SW480 celler førte til en økning av celler i S-fasen og samtidig en nedgang på celler i G1 /G0-fasen.; (B) ektopisk uttrykk for E12 eller E47 økt celler i G1 /G0 fasen av SW480 /shE2A celler og redusert S fase celler. Data viser gjennomsnitt ± SD fra 3 uavhengige eksperimenter. (*,
P
0,05).
E2A kontrollert cellesyklus ved å målrette MIR-320a
Funnene ovenfor videre førte oss til å undersøke hvordan E2A regulert cellesyklus endring. De siste tiårene har microRNAs (mirnas) er funnet å være involvert i patogenesen av menneskelige sykdommer, inkludert kreft [25]. Uventet, fant vi en miRNA, MIR-320a, som var en metastase demper [26], ble regulert av E2A. I SW480 /shE2A celler, ble uttrykket av MIR-320a nedregulert (figur 5A) og transfeksjon av enten E12 eller E47 inn i denne gruppen av celler (figur 5B) eller inn i villtype SW480 celler (figur S1 F) kunne oppregulere MIR-320a . For å undersøke om MIR-320a var et mål direkte regulert av E2A, utførte vi kromatinet immunoprecipitation (chip) analyse. Resultatene viste at E2A kan binde til E-boksen (GCAGGTG, ved -138bp, oppstrøms MIR-320a stemloop) av MIR-320a, noe som tyder E2A kan regulere uttrykket av MIR-320a ved å målrette sin promotersekvens direkte (figur 5C) .
(A) MIR-320a uttrykk ble redusert i SW480 /shE2A celler som vist ved QRT-PCR; (B) Co-transfeksjon av E12 eller E47 i SW480 /shE2A celler kunne normalisere uttrykk for MIR-320a; (C) Øvre panel: sekvens av Mir-320a genet viser E-box, den anslåtte bindingssetet av E2A; nedre panel: ChIP analysen viste E2A bundet til Mir-320a på sitt E-box, GCAGGTG; Co-transfeksjon av MIR-320A ligner reverseres cellesyklus endringene (D) og cellevekst (E) av SW480 /shE2A celler; (F) Co-transfeksjon av MIR-320A ligner redusert celleproliferasjon sats på Caco-2 /shE2A celler. Dataene er uttrykt med gjennomsnitt ± SD av 3 uavhengige eksperimenter. (*,
P
0,05).
Da vi spurte om MIR-320a var målet der E2A regulert celleproliferasjon. Ved trans MIR-320A ligner inn SW480 /shE2A celler, fant vi cellecyklusprogresjonen forårsaket av E2A knockdown ble arrestert og celleproliferasjon hastigheten ble redusert (figur 5D E). Også co-transfeksjon av MIR-320A ligner i Caco-2 /shE2A celler hemmet celledeling rate (figur 5F). Derfor E2A regulert celleproliferasjon ved direkte rettet mot Mir-320a
Diskusjoner
Til tross for store anstrengelser har blitt gjort for å forbedre forebygging og behandling av CRC, sin sykelighet og dødelighet fortsatt høy. Både ble anslått til å være den tredje blant alle krefttilfeller i USA, 2013 [27]. Den tumorigenesis av CRC er et multiplum prosess mediert ved å akkumulere endringer i celleproliferasjon evne og et bredt spekter av genetiske lidelser [28]. Basert på disse, har nyere studier fokusert på å finne nye biomarkører og avvikende genetiske særtrekk i CRC [29]. Her viste vi E2A var en roman prognostisk markør for CRC og MIR-320a var et direkte mål gjennom hvilke E2A regulert tykktarmskreft cellesyklus for å kontrollere cellevekst.
Rollen E2A i normal B og T-celle utvikling og leukemogenesis har blitt godt undersøkt [13], [30], [31] og det ble også vist å være involvert i brystcancer, prostata cancer, gastrisk MALT og thymus-lymfom [15], [17], [18], [20 ]. Spesielt er E2A uttrykk forbundet med tumor celledifferensiering og pasientenes prognose ved brystkreft [15] og svulst stadier i prostata kreft [17]. Derfor er E2A trolig bli en faktor knyttet til tumorutvikling og har prognostisk verdi. I støtte for dette, fant vi at E2A uttrykket ble betydelig redusert i CRC vev sammenlignet med normal slimhinne og immunhistokjemi viste en gradvis redusert scoring av positive E2A flekker som kliniske faser avansert, noe som indikerer en negativ assosiasjon av E2A med CRC utvikling og sannsynligvis tumor- undertrykkende effekt av E2A. I Cox regresjonsanalyse fant vi lite uttrykk for E2A spådd dårlig prognose av OS og DFS i CRC pasienter uavhengig av alder, kjønn, tumorlokalisering, tumorhistologi og tumorstørrelse. Disse resultater, som foreslått et undertrykkende rolle E2A i CRC, var i overensstemmelse med funnene i lymfom [18], [32] og leukemi [4], men motsagt med de som finnes i bryst- og prostatakreft [15], [17 ]. Med tanke på flertrinnsprosess CRC kreftutvikling og ulike biologiske atferd av svulster, kan avviket bli forstått i det minste delvis
Tidligere studier har vist selv contradictive roller E2A i spredning:. Stanse av E2A i bryst [15 ] og prostatakreftceller [17] hemmet cellevekst, men i lymfom, leukemi, hematopoetiske stamceller, og CRC kreftceller, tap av E2A førte til økt proliferasjon [7], [30], [32], [33]. Dessuten håndheves E47 overekspresjon hemmet cellevekst av T-celle ALL [34]. Å tydelig vise hvilken rolle E2A i tykktarmskreft cellevekst, bygget vi en E2A stabilt downregulated SW480 klone å undersøke dens effekt. I samsvar med tidligere resultater funnet i blodkreft malignitet og CRC, observerte vi at nedregulering av E2A betydelig økt celleproliferasjon sats og kotransfeksjonen med enten E12 eller E47 plasmid kan oppveie denne effekten, noe som tyder på direkte rolle E2A i å regulere cellevekst. Følgelig cellesyklus analyse viste en progresjon fra G1 /G0 fasen til S-fasen i E2A downregulated celler. Selv om noen studier viste cellesyklus arrestert på G1 fase i E2a mangelkreftceller [17], [23], våre resultater var støttende til pro-spredningseffekt og i overensstemmelse med funnene i de fleste studier som viste akselerert cellecyklusprogresjonen etter E2A mangel [24], [35] – [39]. Til sammen knockdown av E2A fremmet cellecyklusprogresjonen og dette resulterte i økt celledeling. Disse funnene gir delvis, om ikke fullstendig, innsikt i svulsten undertrykkende rolle E2A i CRC.
Som en transkripsjonsfaktor, E2A utøver sine funksjoner ved å regulere genekspresjon og studier har rapportert sine nedstrøms mål inkludert p21, Id1 , c-Myc, etc [17], [24], [36]. I vår studie fant vi MIR-320a var et mål regulert av E2A modulerende cellesyklus og celledeling. Human MIR-320a er lokalisert på kromosom 8p21.3, en locus av levermetastatisk følsomhet [40], og det har blitt rapportert å være regulator av glykolyse [41] og dysregulerte i kreft [42]. Studier har vist at Mir-320a undertrykker tumorigenesis og metastase i CRC [26], [43], [44]. Uventet, identifiserte vi E-boks med MIR-320a som et bindingssete av E2A med TESS (transkripsjon Element Search System), og vi faktisk vist at E2A bundet til Mir-320a hjelp ChIP analysen. Ekspresjon av MIR-320a ble regulert ved E2A direkte og enda viktigere, oppregulering av MIR-320a kunne reversere endringer forårsaket av E2A knockdown, noe som ytterligere foreslås det som et nedstrøms effektor av E2A. Likevel er det fortsatt uklart om effekten av E2A på MIR-320a er en global effekt. Til sammen foreslår at MIR-320a er ett av målene gjennom hvilke E2A regulerer cellesyklusprogresjon og celleproliferasjon.
I sammendraget presenterer vi overbevisende bevis som viser at E2A er en prognostisk faktor for CRC pasienter og skuespill et tumorundertrykkende rolle i CRC-celler. Gjennom forpliktende direkte til MIR-320a, regulerer E2A kreft cellecyklusprogresjonen og kontroller cellevekst. Men rollen som E2A i solide tumorer er ikke fullt ut forstått, og våre funn bare delvis avsløre de molekylære mål og virkningsmekanismer av E2A. Derfor er fremtidige studier er nødvendig for å validere våre funn og grundig belyse rollen E2A i CRC.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1. product: (A) Venstre: E2A protein uttrykk for villtype SW480, kontroll SW480, og banket ned SW480 celler. Høyre: Endring av E2A ekspresjon i SW480-celler etter transfeksjon av shE2A, E12 eller E47: shE2A redusert ekspresjon av E2A i SW480, mens E12 og E47 øket E2A-ekspresjon i SW480 /shE2A celler, i forhold til kontrollene; (B) Transfeksjon av E12 eller E47 hemmet SW480 /WT cellevekst; (C) E2A regulerer cellevekst i NCM460 celler; (D) Transfeksjon av E12 eller E47 øket G
0 /G
en fase av SW480 /WT-celler og redusert S-fasen; (E) E2A regulerer cellesyklusprogresjon i NCM460 celler;
