Abstract
biofysiske og biokjemiske egenskaper av mikromiljøet regulere cellulære responser som vekst, differensiering, morfogenese og migrering i normale celler og kreftceller. Ettersom to-dimensjonale (2D) kulturer mangler de grunnleggende egenskapene til det native cellulære mikromiljø, har tredimensjonale (3D) kulturer blitt utviklet for å bedre etterligner den naturlige ekstracellulære matriks. Hittil har 3D-kultur-systemer brukte de stort sett kollagen og Matrigel ™ hydrogeler, slik at bare begrenset kontroll over matrise stivhet, proteolytisk nedbrytbarhet, og ligand tetthet. I kontrast, bioengineered hydrogeler tillate oss å uavhengig tune og systematisk undersøke påvirkning av disse parametrene på cellevekst og differensiering. I denne studien, polyetylenglykol (PEG) hydrogeler, funksjonalisert med arginin-glycin-asparaginsyre (RGD) motiver, vanlige cellebindende motivene i ekstracellulære matriseproteiner og matriks metalloproteinase (MMP) spaltingsseter, ble karakterisert med hensyn til deres stivhet, diffusiv egenskaper, og evnen til å understøtte vekst av androgen-avhengig prostata LNCaP kreftceller. Vi har funnet at de mekaniske egenskaper modulerte vekstkinetikken av LNCaP-celler i den PEG hydrogel. Ved kultur perioder på 28 dager, LNCaP-celler gjennomgikk morphogenic forandringer, som danner tumor-lignende strukturer i 3D-kultur, med hypoksiske og apoptotiske kjerner. Vi ytterligere i forhold protein og genuttrykk nivåer mellom 3D og 2D kulturer ved stimulering med syntetisk androgen R1881. Interessant, kinetikken R1881 stimulert androgen reseptor (AR) kjernefysisk trans skilte mellom 2D- og 3D kulturer når observert av immunofluorescent farging. Videre microarray studier viste at endringer i uttrykk nivåer av androgen responsive gener ved R1881 behandling varierte sterkt mellom 2D- og 3D-kulturer. Til sammen dyrking LNCaP celler i tunbare PEG hydrogeler avslører forskjeller i de cellulære responser til androgen stimulering mellom 2D- og 3D-miljøer. Derfor foreslår vi at de presenterte 3D kultur systemet representerer et kraftig verktøy for høy gjennomstrømming prostatakreft narkotika testing som sammenfatter svulstens mikromiljø
Citation. Sieh S, Taubenberger AV, Rizzi SC, Sadowski M, Lehman ML, Rockstroh A, et al. (2012) Fenotypisk Karakterisering av prostatakreft LNCaP celler dyrket i en bioengineered mikromiljøet. PLoS ONE 7 (9): e40217. doi: 10,1371 /journal.pone.0040217
Redaktør: Elizabeth Wilson, University of North Carolina i Chapel Hill, USA
mottatt: 17 november 2011; Akseptert: 6 juni 2012; Publisert: 05.09.2012
Copyright: © Sieh et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Queensland University of Technology oppstart stipend for stol Prof. DW Hutmacher, Prostate Cancer Foundation of Australia, Australian kanadiske Prostate Cancer Research Alliance, Australian Prostate Cancer Research Centre-Queensland og NHMRC stipend. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (CAP) er en av de mest utbredte ondartede sykdommer blant menn i vestlige land. Den 5-års overlevelse for menn diagnostisert med lokalisert Cap nærmer seg 100%; mens, forverrer prognosen raskt på Cap progresjon til avansert og metastatisk sykdom [1] – [2]. Til tross for avansement i deteksjonsmetoder og behandlinger, forblir CAP en viktig årsak til kreft dødsfall hos menn. Derfor er det viktig å få en større forståelse av progresjon fra lokalisert til avansert cap ved hjelp av relevante fysiologiske systemer. Som mange andre kreftceller, har CAP celler blitt grundig studert i todimensjonale (2D) kulturer, der en betydelig grunnleggende forståelse av kreft biologi har blitt oppnådd. Men i native vev blir celler innleiret i ekstracellulær matriks (ECM) som gir ikke bare støtte arkitektonisk, men også kjemiske og mekaniske signaler til cellene [3] – [4]. Nylig, har betydningen av de mekaniske egenskapene til svulsten mikromiljøet blitt stadig mer anerkjent. Generelt er kreftvev og dens stroma er stivere enn ikke-ondartet vev på grunn av unormal avsetning og remodellering av ECM i stroma [5] – [7].
In vitro-studier
og få
in vivo
studier har vist at stivheten i den omgivende grunnmasse kan øke kreftcellevekst, modulerer cellesignalisering og lette celle invasjon [8] – [11]. Tatt i betraktning den viktige rollen matrise stivhet, kunstige geometriske begrensninger og høy stivhet pålagt celler på 2D vev kultur plast kan påvirke tumorvekst, vedheft, celle polaritet, morfologi, migrasjon og proteolyse mekanismer [12] -. [15]
i de senere årene har en rekke studier vist at å studere svulster i 3D bedre reproduserer
in vivo
vekstegenskaper og motstand mot kjemoterapeutika enn en 2D tilnærming [16] – [18]. De mest brukte 3D-matriks-modeller er animalske rekonstitueres basalmembranekstrakt, Matrigel ™ [17], [19] – [20], og rottehalecollagen type I matrisene [21] – [24]. Selv om disse naturlig avledede matriser har ECM-lignende biologiske egenskaper, deres iboende egenskaper begrenser fleksibiliteten av å justere matriksen stivhet uten samtidig å påvirke andre matrise egenskaper, såsom proteolytisk nedbrytning og ligand tetthet. Videre Matrigel ™ viser batch-til-batch-forskjeller, noe som reduserer reproduserbarheten av eksperimenter og sammenlignbarhet av datasett mellom ulike laboratorier. For å forenkle den ellers komplekse cellulære interaksjoner av flere komponenter som forekommer i naturlig avledede matriser, er det en økende interesse for bruk av matriser konstruert med spesifikke biologiske og biokjemiske egenskaper av naturlig ECM [25] – [28]. Disse biomimetic matriser tillate en mer systematisk studie av virkningen av visse komponenter eller egenskaper svulsten mikromiljøet på kreftceller. Derfor er nye fremgangsmåter i biomateriale vitenskap fokusert på utvikling av syntetiske matrikser som hyaluronon-avledet eller alginat matriser for dyrking av kreftceller [25] – [28]. Et annet eksempel er PEG-baserte hydrogeler som er inert seg selv i form av å utløse cellesignalveier, men kan utstyres med biokjemiske (for eksempel proteolytisk nedbrytning nettsteder) og biologiske -funksjonaliteter (f.eks RGD motiver i en kontrollert måte) [29]. Fordelaktig kan stivheten av slike hydrogeler være nøyaktig innstilt, uavhengig av deres proteolytiske følsomhet og celletetthet ligand.
Tidligere har vi og andre brukte MMP-sensitive PEG-baserte hydrogeler hvori RGD-motivene er innlemmet i en definert tetthet [13], [30] – [32]. RGD-motivene gir bindingssteder for celler via integriner, og MMP cleavage sekvensene tillate celler å nedbryte matrisen, noe som skaper rom for celleproliferasjon og migrasjon. For å oppnå dette, har en grundig fenotypisk karakterisering av Cap celler dyrket i denne biomimetic ECM ikke blitt rapportert. I denne studien ønsket vi å etablere og validere en 3D-kultursystem for LNCaP-celler som tillater modellering av et tidlig stadium avaskulær tumordannelse. For å gjøre dette, undersøkte vi effekten av hydrogel stivhet på cellevekst. Deretter undersøkte vi morfologi, genekspresjon og proteinsyntese fra LNCaP-celler dyrket i 3D-hydrogeler sammenlignet med konvensjonell 2D-kulturer. Vi har også brukt denne 3D kultursystem for å studere effektene av syntetisk androgen, R1881, på AR signalisering i forhold til 2D kulturer [33] – [34]
Våre funn gir innsikt i rollen mikromiljøet. ved modulering av den cellulære og molekylære oppførsel av kreftceller. Videre viser vi forskjeller i cellulære responser til androgener mellom 2D- og 3D-kulturer. Denne modellen er et springbrett for utvikling av 3D-kultur-systemer replikere
in vivo
svulstens mikromiljø, som åpner for etablering av kraftige verktøy for å bedre forstå Cap biologi, særlig som følge av androgener.
Resultater
Mekaniske og diffusiv egenskaper biomimetic hydrogeler er avhengig av PEG innhold
for å etterligne den tidlige fasen av Cap tumordannelse i 3D, setter vi ut til kultur LNCaP celler i biomimetic PEG hydrogeler. De PEG forløpere konjugert med MMP kutteseter og RGD motiver ble innlemmet i hydrogel nettverket for å gi grunnlegg biomimetic trekk ved naturlige ECM (figur 1A). Siden mekaniske egenskaper av hydrogelen er kjent for å påvirke vekst, morfologi, og invasive fenotype av cancerceller [5], [10], [35], vi først forsøkte å optimalisere hydrogel største stivhet for cellekultur. Cellefrie PEG hydrogeler av varierende stivhet ble fremstilt ved å justere PEG-innhold til 1,5, 2, 2,5% (w /v). Stivheten av hydrogelen ble bestemt ved ubegrensede trykkprøver ved bruk av en microtester (figur 1B, til venstre) og atomkraftmikroskopi (AFM) innrykks målinger (figur 1C, til venstre) som ble konvertert til en stress-belastningskurve (figur 1B, midten) .
(A) En skjema som viser fremstilling av biomimetic hydrogeler. LNCaP celler ble blandet med PEG forløpere som inneholder MMP kutteseter og RGD peptider før FXIII-katalysert polymerisasjon. (B) Global stivhet av cellefrie hydrogeler med forskjellig PEG-innhold (vekt /volum) ble målt ved anvendelse av en microtester. En representativ spenning-belastningskurve registrert for en 2% PEG-gel. Den (elastisk) Youngs modul, E, ble beregnet fra helningen av linjen montert på stress-belastningskurve på 9-12% belastning (i midten). Et spredningsplott som viser Youngs moduler målt for forskjellige PEG-hydrogeler (til høyre). Medianer er angitt med de røde streker. (C) lokal stivhet av cellefrie hydrogeler med forskjellig PEG-innhold (vekt /volum) ble målt ved anvendelse av atomkraftmikroskopi (AFM). En pyramideformet AFM cantilever ble brukt til å utføre innrykk målinger. En representant kraft versus tip-prøve-separasjon kurve er vist nedenfor AFM skjematisk. Den røde linjen representerer passform som brukes til å tilnærme tilnærming kurve med en Hertzian innrykk modell. Youngs moduli, målt for en 2% PEG-hydrogel er normalfordelt i området fra 4 kPa (i midten). Punktplott viser median Youngs moduler målt for forskjellige hydrogeler (til høyre). Røde søylene representerer medianverdier. Begge microtester og AFM innrykks målinger gi lignende Youngs moduler og viser en lineær økning i stivhet med PEG-innhold. (D) Boksplott viser Diffusjonskoeffisientene, D målt for mat fargestoff E133 (794 Da) og FITC-BSA (66 kDa) i cellefritt hydrogeler på ulike PEG innhold. Verdiene av D for E133 er en størrelsesorden større enn for FITC-BSA. Minst tre prøvene ble målt fra tre uavhengige eksperimenter.
Mens microtestor sonder de globale elastiske egenskaper av PEG hydrogeler, de AFM innrykks målingene gi informasjon om deres lokale stivhet fordeling (figur 1C). Begge fremgangsmåter viste en lineær økning i elastisitetsmoduler med forøkning av PEG-innhold og indikerte lignende elastisitetsmoduler, som strekker seg mellom omtrent 0,8 kPa (kPa) til 10 kPa i de 1,5% og 2,5% PEG-hydrogeler, respektivt (figur 1B og 1C, høyre) . AFM målinger viste en homogen fordeling av lokal Youngs modul, E over probet hydrogeler (figur 1C, midten). Når 2,0% hydrogelene ble testet ved anvendelse av microtester før og etter mer enn 4 uker med kultur, fant vi ingen signifikante endringer i den totale matrise stivhet (2.5 til 4.2 kPa), som var i overensstemmelse med variasjoner i de testede 2% (hydrogeler Figur S1). Som tidligere rapportert i 3D-cellekulturer i løpet av tilsvarende matriser [5], [10], [35], tyder dette på at disse biomimetisk PEG-baserte hydrogel blir bare lokalt brytes ned av de innebygde celler, mens den samlede stivhet ikke blir påvirket over analysert vekstperioden.
endringer i PEG-innholdet er forventet å endre porestørrelsen av PEG-hydrogelene [36] som kan påvirke overføringen av små molekyler, slik som de syntetiske androgen R1881, og også vekstfaktorer som er tilstede i medium i våre eksperimenter. For å beregne spredningen av R1881, målte vi diffusjonskoeffisienten D, på maten fargestoff E133 (792 Da), som har en høyere molekylvekt enn R1881 (284 Da). Vi fant at median-verdier for diffusjon avtok med økende PEG innhold (figur 1D) fra 2,99 ± 0,06 × 10
-6 cm
2 /s for 1,5% PEG hydrogeler til 1,9 ± 0,13 × 10
– 6 cm
2 /s for 2,5% PEG hydrogeler. For å teste om essensielle vekstfaktorer, slik som fibroblastvekstfaktor, vaskulær endotelial vekstfaktor og blodplateavledet vekstfaktor (20-50 kilodalton, kDa) kan også trenge inn i hydrogelen, undersøkte vi diffusjonen av Fluorescein isotiocyanat-konjugert bovint serumalbumin (FITC -BSA) (66 kDa), som har en høyere molekylvekt enn disse vekstfaktorer. Diffusjonskoeffisienten av FITC-BSA var lavere sammenlignet med E133 og avtok med økende PEG-innhold (figur 1D). D-verdier for 1,5-2,5% PEG hydrogeler (1,5-3,0 × 10
-7 cm
2 /s) er i samme størrelsesorden (6 × 10
-7 cm
2 /e) rapportert av Ramanujan
et al product: (2002) og Erikson
et al product: (2008) som måler spredning av BSA i de mykere kollagen gels [37] -.. [38]. Når PEG hydrogeler ble inkubert med FITC-BSA i 24 timer, ble det observert utstrakt inntrengning av FITC-BSA (figur S2). Fra disse resultatene kan vi konkludere med at, selv om overføring av R1881 og vekstfaktorer kan bli bremset ned i geler med høyere PEG-innhold, er porestørrelsen i alle geler er tilstrekkelig stor til å tilveiebringe innebygde celler med løselige faktorer fra kulturmediet.
spredning av LNCaP-celler innenfor biomimetic hydrogeler påvirkes av PEG-innhold og stivhet av hydrogeler
Deretter for å evaluere effekten av matrisen stivhet på celleformering, dyrket vi LNCaP-celler i 1,5, 2,0 og 2,5% hydrogeler over 28 dager (figur 2A, topp panel, ikke sant). Ettlagskulturer (dobling tid, Td = 27 timer) vokste eksponentielt inntil dag 5 og begynte å flate ut etterpå (figur 2A, topp panel, til venstre). Tvert imot, celler proliferert langsommere i 1,5% (Td = 54 timer) og 2% (Td = 58,5 timer) PEG hydrogeler. Eksponentielle veksten skjedde mellom dag 7 og 14 i 3D kulturer (Figur 2A, topp panel, høyre). LNCaP-celler fortsatte å spre seg i det minste opp til 28 dager i 2,0% hydrogeler, mens maksimal celle-tallene ble nådd etter 14 dager i 1,5% hydrogeler. De høyere vekstrater i mykere 1,5% hydrogel i forhold til 2,0% hydrogelen kan være på grunn av den lavere spenning som utøves på cellene av det omgivende mykere hydrogel [39] – [40]. Den sigmoidal vekstkurve vi observere kan sammenlignes med den observerte veksten av LNCaP-xenografter med bevis for langsomt voksende på et tidlig stadium, eksponensiell vekst i det mellomliggende trinn og nedbremsing av veksten på det senere stadium [41] – [46]. På den annen side ble ingen vekst detektert i 2,5% hydrogeler som bekreftes av de levende døde farging (figur 2A, nedre panel) avslører tilstedeværelsen av overveiende ikke-levedyktige celler i 2,5% hydrogel på dag 24. De lyse felt bilder viste at celler var i stand til å danne kolonier i 1,5 og 2,0%, men ikke i 2,5% hydrogeler.
(A) vekst~~POS=TRUNC kurver~~POS=HEADCOMP av LNCaP-celler over 7 dager for 2D-kulturer (til venstre) og 28 dager for 3D-kulturer ( til høyre) i normale vekstmedier, målt ved total DNA-innhold (gjennomsnitt ± SE). I 2D kulturer celler spre mye raskere nå konfluens innen 7 dager (toppanelet, til venstre). Veksten profilen av celler er avhengig av de mekaniske egenskapene til bioengineered PEG matriser, der veksten er størst i 1,5%, etterfulgt av celler dyrket i 2% hydrogeler (øverste panel, ikke sant). Ingen celleproliferasjon er oppdaget i de stivere hydrogel (2,5%). Levende døde undersøkelse ble utført ved hjelp av fluorescein diacetat-propidiumjodidfarging på dag 24 av LNCaP celler dyrket i forskjellig PEG innhold (nedre panel). Den lever døde flekker avslører at de fleste cellene er levedyktig (grønn) i både 1,5 og 2,0% hydrogeler men ikke levedyktig (rød) i 2,5% hydrogeler. Bilder ble tatt med CLSM (10 × 0,4 NA). Bright felt bilder bekrefter også at cellene i 2,5% hydrogeler ikke danne kolonier som observert hos 1,5% og 2,0% hydrogeler på dag 28. (B) (topplaten) En representant CLSM 3D projeksjoner av LNCaP kolonier merket med Phalloidin (aktin, rød ) /DAPI (kjerner, blå) fra dag 7 til dag 28 (20 x, 1,0 NA). Kolonier er mer avrundet på dag 7 og dag 14, men blir uregelmessige aggregater fra dag 21 og utover. Boksplott av kolonistørrelse og form faktor analysert fra seks CLSM bilder (nederst panel) viser betydelig økning i spheroid størrelse og reduksjon i form factor (p 0,001) på dag 28 i forhold til dag 7 kulturer blir oppdaget. (C) Et representativt histologi i dag 28 kulturer avsløre dannelsen av invasive «fingre» (pil) som trenger inn i omgivende hydrogel (til venstre). H E flekk (midten) viser en hul kjerne. Immunhistokjemi flekk av Caspase 8 (til høyre) bekrefter apoptotiske celler i kjernen (brun). (D) Spredningsplott av kolonistørrelse, celle nummer og kjernestørrelse hvis noen analysert fra 10 mikrometer tykke histologiske seksjoner. Dette viser at hver koloni størrelse øker lineært med celletallet. Kjernestørrelse øker også lineært med kolonistørrelse. Minst tre uavhengige eksperimenter ble utført for hver analyse. Skala barer: (A, venstre, B) 250 nm, (A, høyre) 100 mikrometer og (C) 50 mikrometer
Basert på denne spredningen studien har vi valgt 2,0% PEG hydrogeler for. gjennomføre etterfølgende eksperimenter. Til dags dato, den lokale stivhet inne i prostatakjertelvevet er ukjent. Imidlertid er stivheten i 2% geler på 4 kPa er innenfor det rapporterte området mykt vev (1-10 kPa) og brystkjertelvevet (4 kPa) [5], [47].
LnCap sfæroider i biomimetic hydrogeler variere morfologisk og fenotypisk fra LNCaP celler i 2D kulturer
Deretter undersøkte vi morfologi LNCaP celler dyrket i inntil 28 dager i 2% biomimetic PEG hydrogeler. Confocal bilder av Phalloidin og 4 «, 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI) farget hydrogel (figur 2B, topp panel og Figur S3, til venstre) og time lapse videomicroscopy (Video S1) viste at enkeltceller proliferated i kolonier på opptil 200 mikron i diameter i hydrogelen. Disse koloniene lignet morfologi LNCaP kolonier dyrket i Matrigel ™ (Figur S3, til høyre) som vi og andre har tidligere beskrevet [48] – [49]. Kolonien størrelse økte fra dag 7 til dag 21 og holdt seg konstant etterpå (figur 2B, nedre panel). Celle aggregatene var sfærisk form opp til dag 21 deretter å bli uregelmessig, som bekreftet ved en betydelig reduksjon i formfaktoren på dag 28 (figur 2B, nedre panel). Den Phalloidin-DAPI og haematoxylin og eosin (H E) stainings av frysesnitt viste at de dag 28 kolonier dannet «finger-lignende «strukturer og ofte presentert en hul sentral kjerne (figur 2C). Tilstedeværelsen av apoptotiske celler i denne regionen, som detektert via caspase 8 farging, ble også observert. Denne økte antall av apoptotiske celler i kjernen som også er blitt beskrevet i andre
in vitro
3D tumor kulturer [17], [19]. Ytterligere histologisk undersøkelse av 3D-kulturene støtter at økningen i størrelse av hver koloni var i forhold til celletallet og størrelsen av kjerner dannet (figur 2D). Apoptotiske kjerneformasjoner sett oftere i dag 28 kulturer i forhold til andre tidspunkter (data ikke vist).
Siden det meste av forrige karakterisering av LNCaP cellefenotyp er basert på 2D kulturer, vi setter ut for å undersøke 3D dyrket LNCaP celle morfologi. Som vist i figur 3A, ble LNCaP-celler for 2D spre seg ut med spindellignende morfologi. I 3D-kulturer imidlertid ble cellene arrangert i kompakte celleaggregater, hvorpå enkeltceller vedtatt en mer avrundet morfologi sammenlignet med monolayer celler. Innenfor LNCaP kolonien, epiteliale markør E-cadherin (ECAD) samlokalisert med celle-celle-kontakter, mens i kulturer 2D ECAD er mer jevnt fordelt på celleoverflaten. Vi neste utførte farging for hypoksi markør med Pimonidazole i begge kulturer å evaluere oksygen tilgjengeligheten til celler, oppdager en høyere hypoksi nivå i 3D enn i 2D kulturer. Denne observasjonen er i overensstemmelse med tumorxenografter og kliniske tumorer hvor hypoksi og sentral apoptose /nekrose er et vanlig trekk i dårlig vaskulariserte faste tumorer og tidligere 3D sfæroide kulturer uavhengig av celletyper [42], [50] – [54]. Vår rapport viste også at i de tidligere 3D-kulturene (dag 14), hvor sfæroiden størrelse var mindre (fig S4), mindre Pimonidazole farging var tydelig sammenlignet med dag 28 kulturer (figur 3). Dette tyder på at flercellede aggregater, avhengig av kolonistørrelse kan påvirke oksygenoverføring innenfor kolonien. Tilsvarende, når LNCaP-celler ble dyrket i mykere geler (f.eks Collagen I og Matrigel ™), ble hypoksi påvist med Pimonidazole flekker på dag 24 av vekstkultur (figur 3B). Kuler i suspensjonskulturer også støte oksygenmangel, spesielt mot midten av sfæroidene [42], [50], [55]. Dette tyder på at oksygenoverførings begrensningen er ikke spesifikk for den PEG hydrogelmatriks, men er også sannsynlig å bli påvirket av tett celle-celle-kontakt og høy celletetthet i 3D-kulturer.
(A) En sammenligning av 2D kulturer (dag 6) og histologi deler av 3D-kulturer (dag 28) avslører forskjeller i celle morfologi og fenotype. Cytoskeletal organisasjon (aktin, rød) av celler i 2D kulturer avslører en spredt og langstrakt celle morfologi (topplaten). Cellen og kjernen (blå) størrelsen av 2D kulturer er større enn 3D-kulturer. I 3D-kulturer, celler vedta en brostein morfologi og kompakt celle arrangement. De danner også omfattende celle-celle-kontakt inne i kolonien. Epitelial markør, E-cadherin (ECAD, grønn) er lokalisert i cellemembranen og i celle-celle-kontakter for begge kulturer (midtre panel). Hypoksi farging med Pimonidazole (grønn) viser at det er mindre hypoksiske celler i 2D kulturer i forhold til 3D-kulturer (nederst panel). Hypoksi detekteres innenfor det LNCaP koloni i nærvær av en apoptotisk kjerne (pil). (B) Pimonidazole stainings utført på LNCaP-celler dyrket i PEG-hydrogeler, Collagen I og Matrigel ™ til 24 dager viser tilstedeværelse av hypoksi i alle matriser. CLSM bildene ble tatt ved 40 × forstørrelse og 1,25 NA. Skala barer: (A) 75 mikrometer og (B) 100 mikrometer
Protein og mRNA nivåer av LNCaP markører i 3D kulturer forskjellig fra 2D kulturer ved stimulering med 1 nM R1881 i 48 timer
.
i løpet av den innledende fasen av CAP, er det store flertallet av svulster androgen avhengige og responsive; Videre spiller det AR signalveien en viktig rolle i tumorutvikling og er viktig gjennom progresjon [56] – [57]. Av denne grunn er androgenavhengige LNCaP-celler er mye brukt i 2D kulturer for å studere androgenreseptoren (AR) signalering, som aktiveres av androgener og analoger som R1881. For å utvide vår kunnskap om LNCaP respons på R1881 i 2D kulturbaserte eksperimenter, undersøkte vi effekten av R1881 på Cap markør uttrykk i 3D kulturer (figur 4). Immunofluorescerende farging viste translokasjon av AR inn i cellekjernen i både 2D og 3D-kulturer etter 7 timer på 1 nM R1881 behandling (figur 4A). Det er godt etablert i 2D kultur som en gang AR binder seg til R1881, blir den transportert til kjernen hvor den starter transkripsjon av målet gener, slik prostataspesifikt antigen /Kallikrein 3 (PSA) [58]. Vår foreløpige studien indikerte at AR målgener som PSA, ble indusert ved høyere nivåer etter lang tids R1881 behandling (etter 36 timer) i både 2D og 3D kulturer (Figur s5a). Derfor, valgte vi for dette studiet en 48 h R1881 behandling for begge kulturer. Interessant, skjønt 2D- og 3D-kulturer svarte til den 48 h R1881 behandling, som vist ved en økning i mRNA og proteinnivåer av PSA, lokalisering av AR i cellekjernen ble påvist i noe mindre grad i 3D-kulturer sammenlignet med 2D-kulturer. Imidlertid ble verken lokalisering eller intensiteten av luminal epitel markør, Cytokeratin 8 (CK8) påvirket av R1881 behandling i 2D eller 3D kulturer.
(A) Immunofluorescent stainings av LNCaP celler etter 7 h behandling med R1881 showet co -localization av AR og cellekjernen i både 2D (dag 6) og 3D (dag 28) kulturer (topplaten). Tilsvarende AR lokalisering i begge kulturer er vist i gråtoner (nederst panel). (B) Celle fenotyper av 2D (dag 6, venstre panel) og 3D (dag 28, høyre panel) kulturer dyrket i androgen fattigmedium eller R1881 supplementert medium (48 h) ble sammenlignet ved immunofluorescent stainings. Proteiner av interesse er i grønt, aktin i rødt og kjernen i blått. I 2D kulturer, AR lokalisert i kjernen og PSA i cytoplasma ved R1881 stimulering. Uten behandling, forblir AR i cytoplasma og PSA er ikke oppdaget. Den luminal epitelial markør, er CK8 påvist i begge kulturer uavhengig av behandling tilstand. I 2D kulturer, CK8 flekker klart filamentfibre, mens i 3D, er CK8 lokalisert på celle grensen. I 3D-kulturer, er extranuclear AR lokalisering observert i både ikke behandlet og R1881 behandlet flercellede aggregater. PSA er også produsert rikelig i R1881 behandlet 3D kulturer, men bare på et svært lavt nivå når den ikke behandles. Forstørrede regioner i hver spesifikk farging og kultur tilstand (hvite bokser) er vist under de tilsvarende bildene. CLSM bildene ble tatt ved 60 x forstørrelse (1,4 NA) for A, og 40 x forstørrelse (1,25 NA) for B. skala barer:. (A) 30 pm, (B) 75 um og 25 um (forstørrede områder)
for å undersøke effekten av R1881 på nivåer av proteiner, fokuserte vi på uttrykket av AR, Ptil og CK8 ved å utføre Western blot analyse. Ved R1881 behandling, ble PSA og CK8 nivåer forbedret i 2D og 3D kulturer sammenlignet med ikke-behandlede etanol kontroller selv om heving av CK8 protein ved R1881 var ikke tydelig i immunfluorescens farging i 2D og 3D kulturer, noe som kan tilskrives mangel på sensitivitet (av antistoffet som brukes) (figur 5A, B). Interessant, i behandlede kulturer 2D, ble AR proteinnivåer forhøyet sammenlignet med ikke-behandlede kontroller, en indikasjon på stabilisering av ligand bundet AR og /eller en økning i AR produksjon [59] – [60]. Derimot ble ingen signifikante endringer påvist i 3D kulturer. Samlet tyder dette på en differensial regulering av AR protein uttrykk i 2D og 3D kulturer som svar på R1881. Effekten av R1881 på mRNA-nivåer i 2D- og 3D-kulturene ble ytterligere undersøkt ved kvantitativ Real Time-Polymerase Chain Reaction (QRT-PCR). I samsvar med økt proteinnivå, Ptil og CK8 mRNA nivåer økt i begge kulturer (figur 5C). I likhet med western blot analyse ble AR mRNA nivå ikke signifikant påvirket av R1881 behandling i 3D kulturer, men gjorde viser en nedadgående trend når behandlingen ble forlenget (Figur S5b). Til tross for høyere AR uttrykk i 2D kulturer sammenlignet med 3D kulturer, PSA uttrykk var lik mellom kulturer, som vist i figur 5C. Forbløffende nok i ikke behandlede kulturer, baseline PSA mRNA nivået var signifikant høyere i 3D i forhold til 2D kulturer. AR og PSA mRNA nivåer i LNCaP tumorxenotransplantater fra intakt Ikke overvektige diabetikere /alvorlig kombinert ImmunoDefficiency (NOD /SCID) mus (Figur S5C) var sammenlignbare R1881 stimulert 3D kulturer, men ikke 2D kulturer. Dermed våre funn tyder på at våre 3D kulturer bedre reflektere
in vivo
svulster.
(A) En representant Western blot viser en økt grad av alle de undersøkte proteiner i 2D kulturer når de ble behandlet med R1881 sammenlignet med ikke-behandlede (etanol kontroller), mens i 3D kulturer, bare PSA og CK8 er betydelig forhøyet. (B) signal-forhold av proteiner i forhold til a-tubulin fra Western-blots av R1881 behandlede og kontrollgrupper etanol (-R1881) er presentert som gjennomsnitt ± SE. Protein quantifications støtter endringene vist i immunoblotter over. (C) QRT-PCR som representerer uttrykk for LNCaP cellemarkører (gjennomsnitt ± SE) hvor Ptil og CK8 er oppregulert på mRNA-nivå ved behandling i både 2D og 3D kulturer sammenlignet med ikke-behandlede 2D eller 3D grupper. AR er bare forhøyet i 2D kulturer. Signifikant forskjell (p 0,05) mellom behandlede og ikke-behandlede prøver i løpet av tilsvarende grupper (enten 2D eller 3D-kulturer) er betegnet med (*), og mellom lignende behandling av forskjellige grupper er betegnet med (Δ). Triplikatprøver ble analysert fra minst tre uavhengige eksperimenter.
Androgene respons av LNCaP celler i 3D kulturer endres i forhold til 2D kulturer under en R1881 fratatt tilstand
Gitt de ovennevnte forskjeller i PSA og AR uttrykk og AR lokalisering mellom 2D- og 3D LNCaP cellekulturer, utførte vi microarray analyse for å grundig vurdere transkripsjons forskjeller mellom 2D og 3D LNCaP cellekulturer i henhold androgen fratatt og R1881 behandlet tilstander, med fokus på androgen-responsive gener. Vi fant differensial regulering av 4157 (1896 opp, 2261 ned) og 3306 (1304 opp 2002 ned) androgen-responsive gener i R1881-behandlet 2D og 3D LNCaP cellekultur, henholdsvis. Den R1881 behandlede 2D (2D + R1881) og 3D (3D + R1881) kulturer delt 2862 vanligvis regulert androgen-responsive gener (1165 oppover- og 1697 nedregulert gener) i forhold til de respektive etanol kontroller (Figur 6A). Interessant, ganger endring i ekspresjon nivå av 898 (31%) av disse gener ble betydelig redusert i 3D + R1881 når sammenlignet med 2D + R1881. Dette var spesielt tydelig i opp-regulerte gener, som vist i spredningsplott (fig. 6A), noe som tyder på en androgene respons i fravær av androgener når LNCaP-celler ble dyrket i 3D-kulturen. Sammenligning av 3D og 2D etanol kontroller (3D + EtOHvs2D + EtOH) viste at 1469 androgen-responsive gener ble uttrykt forskjellig (figur 6B). Dette tyder sterkt på at redusert fold endring av androgen-regulerte gener i respons til R1881 i 3D-kulturen i forhold til 2D + R1881 ble forårsaket av en sterk forskyvning av basislinjen ekspresjonsnivået av androgen regulerte gener (fig. 6B).
