Abstract
Bakgrunn
Gut avledet lipidfaktorer har vært innblandet i systemisk skade og betennelse, men de nøyaktige trasé som er involvert er ukjent. I tillegg kosten fett inntak og fedme er uavhengige risikofaktorer for utvikling av tykktarmskreft. Her studerte vi alvorlighetsgraden av eksperimentelle kolitt og utvikling av kolitt forbundet kreft (CAC) i mus med en induserbar blokk i kylomikron sekresjon og fett malabsorpsjon, etter tarmspesifikk delesjon av mikrosomalt triglyserid overføringsprotein (
Mttp-IKO
).
metodikk /hovedfunnene
Mttp-IKO
mus viste mer alvorlig skade med ~90% dødelighet etter dekstran natriumsulfat (DSS) indusert kolitt, sammenlignet med 20% i kontrollene. Intestinal permeabilitet ble økt i
Mttp-IKO
mus sammenlignet med kontroller, både ved baseline og etter DSS administrasjon, i forbindelse med økt sirkulerende nivåer av TNFa. DSS behandlingen økte colonic mRNA-ekspresjon av IL-1β og IL-17A samt inflammasome ekspresjon i begge genotyper, men overflod av TNFa ble selektivt øket i DSS behandlet
Mttp-IKO
mus. Det var en 2-ganger økning i kolon tumorbyrde i
Mttp-IKO
mus etter azoxymethane /DSS behandling, som ble assosiert med økt colonic betennelse samt endringer i cytokin uttrykk. For å undersøke reaksjonsveier for endringer i fettsyre overflod kan samhandle med cytokin signale å regulere colonic epitelial vekst, brukte vi primære muse myofibroblasts å demonstrere at palmitate indusert uttrykk for amfiregulin og epiregulin og forsterket økningen i begge disse vekst meklere da lagt til IL-1βor til TNFa.
Konklusjoner
Disse studiene viser at
Mttp-IKO
mus, til tross for å absorbere nesten ingen fett, utstillings utvidet fettsyre avhengige signalering som i sin tur forverrer colonic skader og øker svulstdannelse
Citation. Xie Y, Matsumoto H, Nalbantoglu jeg, Kerr TA, Luo J, Rubin DC, et al. (2013) Tarm-Specific Mttp sletting Øker Severity of Experimental kolitt og fører til større tumorbyrde i en modell av kolitt Associated kreft. PLoS ONE 8 (6): e67819. doi: 10,1371 /journal.pone.0067819
Redaktør: Josep Bassaganya-Riera, Virginia Tech, USA
mottatt: 14 mars 2013; Godkjent: 22 mai 2013; Publisert: 21 juni 2013
Copyright: © 2013 Xie et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av midler fra National Institutes of Health (HL-38180, DK-56260 og Washington University Digestive Disease Forskning Kjerne Senter DK-52574, spesielt mus og morfologi kjerner) til NOD. DR ble støttet med tilskudd DK-46122 og DK-61216. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Den fortsatte epidemi av fedme og tilhørende komorbiditet har drevet interesse for å forstå trasé og meglere er involvert, spesielt i forhold til betennelse og kreft. Fedme og relaterte metabolske komplikasjoner er blitt demonstrert å spille en rolle i en rekke kreftformer, inkludert kolorektal cancer (CRC) og følgelig kost modifikasjon og vektkontroll betraktes som nøkkelmodifiserrisikofaktorer [1]. Imidlertid er de nøyaktige mekanismene og stier der fedme bidrar til CRC risikoen fortsatt ufullstendig forstått og vil sannsynligvis omfatte endringer i systemisk inflammasjon og cytokin signalering, insulinresistens samt lokale og systemiske effekter av endret næringsopptak inkludert fettsyrer, kolesterol og gallesyrer [2]. På grunn av sin betydning som energikilde, har fett inntaket vært et mål for intervensjon som en strategi for å dempe virkningene av fedme og betennelse på CRC risiko [3].
I tillegg til rollen for fedme og fettinntaket ved modulering av inflammasjon og CRC risiko er det vekst informasjon som tyder på at tynntarmen spiller en viktig rolle som en mediator i den inflammatoriske respons på systemisk sepsis [4], [5]. I dette tilfellet har det vært antydet at den tynntarmen utskiller lipid-produkter avledet fra luminal fordøyelse, som så transporteres i mesenteriske lymfekar, hvor de induserer organsvikt i fjerne områder [6], [7]. Annet arbeid har forsterket denne gut-lymfe hypotesen ved å vise at ligering av mesenteric duct (og dermed eliminere levering av kylomikroner fra tarmen til den systemiske sirkulasjonen) opphever de systemiske effekter av sjokk, funn som peker på viktigheten av lipid meklere som kommer fra tarmen i patogenesen av systemisk inflammasjon [8], [9]. Annet arbeid har innblandet lipoproteiner som kjøretøy for transport av vekstfaktorer og morphogens, inkludert pattedyr Wnt3, tyder på en mer fundamental rolle for lipid transport i reguleringen av epithelial vekst og spredning [10].
I denne studien har vi undersøkt rollen til intestinal sekresjon kylomikron for å forstå rollen til intestinal lipidtransport i patogenesen av tykktarmsbetennelse og kolitt knytte kreft (CAC). Vi har nylig vist at mus med betinget tarmen spesifikke sletting av mikrosomale triglyserid transfer protein (
Mttp-IKO
) utvikle tilnærmet komplett blokk av intestinal absorpsjon [11] og viser en overlevelsesfordel ved utfordret med
Pseudomonas aeruginosa
, den vanligste årsaken til gram negative lungebetennelse [12]. Disse funnene hevet muligheten for at blokkerer tarm chylomicron sekresjon kan også dempe virkningene av kjemisk indusert eksperimentell kolitt og i sin tur oppheve kolorektal kreftutvikling følgende azoxymethane /dekstran natriumsulfat (AOM /DSS) utfordring [13]. Våre funn er imidlertid avdekket at
Mttp-IKO
musene verre colonic skader og økt tumorbelastning. Videre fant vi at endret fettsyresignale kan spille en nøkkelrolle i å fremme disse fenotyper.
Materialer og metoder
Dyr
Mttp
FLOX /FLOX villin- Cre-ER
T2 (
Mttp-IKO
) mus (sammen med kull kontroller) ble anvendt for disse studiene, i en bakgrunn av ca 75% C57BL /6 og omtrent 25% 129 /SVJ. Cre rekombinase ekspresjon i Haug av epitelceller ble indusert ved fem daglige intraperitoneale injeksjoner av 1 mg tamoksifen (Sigma), som tidligere beskrevet [11]. Forsøkene ble utført på mus forbruker en vanlig lav fett gnager chow. Eksperimentell kolitt ble indusert ved administrering av 2,5% dekstran natriumsulfat (DSS) (molekylvekt 40000-50000, Cat # 9011-18-1, Affymetrix, Inc., Cleveland, Ohio.), I de angitte tidsrom på figuren sagn og veiet daglig . CAC ble indusert ved injeksjon av 8 uker gamle mus med 10 mg /kg kroppsvekt azoxymethane (AOM, Sigma) etterfulgt av tre sykluser (5 dager) av DSS som starter på 5
th (2%), 26
th (2,5%) og 46
th (2,5%) dagen etter AOM injeksjon, mindre modifikasjoner av protokollen som brukes av andre [14]. Musene ble avlivet 9 uker etter injeksjonen AOM og vev oppsamlet for analyse. Alle dyrestudier ble godkjent av dyrestudier komiteer av Washington University School of Medicine (# 20100146) og ble gjennomført i henhold til National Institutes of Health retningslinjer for bruk av forsøksdyr.
Histomorphological analyser
Prøver av tynntarm og tykktarm ble fiksert og embedded for seksjonering og hematoxylin og eosin (H E) farging. Hvor angitt, ble tarmavsnitt farget for lipid- dråper ved hjelp av osmiumtetroksyd som beskrevet [12] histologiske score av DSS skade ble foretatt, og kvantifisert ved hjelp av parametrene beskrevet [15]. Intestinal proliferasjon ble undersøkt i mus injisert med 5-brom-2’deoxyuridine (BrdU) (200 ul volum, 5 mg /ml fortynnet i normal saltoppløsning, Sigma), 2 timer før avlivelse. Prøvene ble behandlet for BrdU-farging som beskrevet [12]. Analyse av kolon tumorbyrden ble foretatt ved hjelp av prøver løst i 10% formalin (Sigma) og festet for scoring etter en etterforsker blindet for genotype. Hver prøve ble fotografert med et Nikon SMZ800 dissekere mikroskop og en fotometriske CooLSNAPcf kamera (Imaging Processing Services). Arealet av hver seksjon ble bestemt og størrelsen av tumorer kvantifisert ved hjelp av Metavue software (Molecular Devices). H . E seksjonene ble også anmeldt av en patolog (IN), blinde for genotype
Intestinal permeabilitet og cytokin analyser
Intestinal permeabilitet ble bestemt etter injeksjon av FITC-merket dekstran (FD-4, MW 4000, Sigma). Kontroll og
Mttp-IKO
mus ble gavaged med FD-4 (400 mg /kg kroppsvekt), før og etter 7 dager 2,5% DSS behandling og sera ble samlet fire timer senere. Serum FITC ble målt på en fluorimeter (Synergy HT, BioTek®) ved eksitasjon 485/20, utslipp 528/20. For LPS bestemmelser, ble sera fortynnet 1:10 og oppvarmet ved 70 ° C i 15 minutter til inaktive inhibitorer. LPS ble deretter målt ved hjelp av LAL kromogen endotoksin kvantifisering kit i henhold til produsentens instruksjoner (ThermoScientific, Rockford, IL). Serum TNFa og IL-1β ble kvantifisert ved ELISA hjelp kits kjøpt fra BD Biosciences (San Jose, California) eller R . D-systemer (Minneapolis, Minnesota) Følgende produsentens instruksjoner
Sanntids kvantitativ polymerase chain reaction
Total RNA ble isolert fra tarmvevet ved hjelp Trizol enten under standard protokoller eller for prøver behandlet med DSS, ved hjelp av modifisering beskrevet av Kerr og kolleger [16]. RNA ble kvantifisert ved hjelp av primerpar (sekvenser tilgjengelig på forespørsel) designet av Primer uttrykkelig programvare (Applied Biosystems). Relative mRNA-overflod uttrykkes i forhold til kontroll mus uten DSS behandling, normalisert til GAPDH.
Colonic lipidinnhold, Fekal lipidinnhold og proteinekspresjon
Totale lipider ble ekstrahert fra feces, så vel som fra proksimale kolon, som tidligere beskrevet [11]. Triglyserid (TG), total kolesterol (TC) og frie fettsyrer (FFA) ble målt enzymatisk ved hjelp Wako sett (Wako Chemicals, Richmond, VA). Western blotting ble gjennomført i standard mote bruker antistoffer som kilde er angitt i den aktuelle figuren legende. For colonic TNFa og IL1β innhold prøver av synkende kolon ble homogenisert i buffer inneholdende 20 mM Tris (pH 7,4), 1 mM natriumortovanadat, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton, 50 mM natrium-fluorid, 50 mM β-glycerophosphate og 1 x Komplett mini proteasehemmer cocktail (Roche, Mannhein, Tyskland). TNFa og IL1β nivåene ble målt i avklares supernatantene ved hjelp av ELISA kits beskrevet ovenfor og normalisert til proteinkonsentrasjonen.
Primær musetarm myofibroblasts
myofibroblasts ble isolert fra C57BL /6 villtype mus som beskrevet [ ,,,0],17] og 1 x 10
5 celler per brønn ble sådd ut i 6-brønns plater og dyrket over natten. Fenotypen til disse cellene ble bekreftet ved positiv farging for glatt muskulatur aktin og vimentin og negativ farging for desmin og cytokeratin [13], [17]. Disse myofibroblasts cellene ble deretter dyrket i 12 timer i DMEM inneholdende 0,25% FBA og 0,6% fettsyrefri bovint serumalbumin (BSA, A8806, Sigma), supplert med enten buffer alene (BSA, Control), 200 uM Palmitat-BSA (PAL ), TNFa 100 ng /ml (TNF-alfa) (R D) eller kombinasjoner av 200 mikrometer Palmitate-BSA pluss TNFa 100 ng /ml (TNFa + PAL) eller 200 mikrometer Palmitate -BSA og IL1β 10 ng /ml (IL1β + PAL), som vist i forklaringen. Disse studiene ble alle utført på myofibroblasts ved passering 6-8. Natriumpalmitat ble konjugert med fettsyre-fri BSA ved forhold på 02:01 (palmitate: BSA), for å lage et 3 mM palmitat-BSA stamløsning. Total RNA ble ekstrahert fra de enkelte prøver og mRNA kvantifisert som beskrevet ovenfor.
Statistical Analysis
sammenligning av flere grupper av kontinuerlige datasettene ble utført ved anvendelse av en-veis analyse av varians, etterfulgt av post-hoc t -Test bruker Prism 4.0 (GraphPad Software, San Diego, California) og Microsoft Excel. Data er rapportert som betyr ± SEM. Overlevelses studier ble analysert via log-rank test. En p-verdi 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
Økt alvorlighetsgraden av DSS kolitt i Mttp-IKO mus
Vi administrert 2,5% DSS i drikkevann. i 12 dager for å vurdere effekten på total overlevelse av genotype. Våre funn viser at
Mttp-IKO
mus stille akselerert død og kraftig redusert overlevelse (1/10) sammenlignet med kontroll mus (9/11) Figur 1A. Augmented skade fenotype i
Mttp-IKO
mus var assosiert med større vekttap i kortere (7 dager) eksperimenter (figur 1C) og en forsinket tilbake til baseline vekt (figur 1B), sammen med redusert kolon lengde ( Figur 1D, E). Det var også mer alvorlig histologisk skade som gjenspeiles av økt lamina propria betennelse og krypten drop-out i synkende kolon i
Mttp-IKO
mus på begge 5 dager (figur 2A, B, E) og 7 dager (figur 2C, D, E) og redusert cellulær proliferasjon som vist ved redusert BrdU-inkorporering (figur 2 F).
A. Redusert overlevelse av
Mttp-IKO product: (n = 10) versus kull kontroller (n = 12). 8-10 uker mus ble matet 2,5% DSS i drikkevannet i 12 dager og fulgt opp til 25 dager. ** P 0,01. B. Vekt gjenvinning av kurven etter en syklus av DSS. Mus (n = 4 mus pr gruppe) ble foret med 2,5% DSS i 7 dager og veies hver 1-3 dag i opptil 25 dager etter en
st dag av DSS behandling. * P 0,05. C. Vekttap etter 7days DSS behandling, n = 10-12 mus per genotype. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM% av opprinnelig vekt. * P 0,05, ** p 0,01 D. Representative bilder av brutto utseende av tykktarms fra kontroll og
Mttp IKO
mus etter 7 dager DSS behandling. E. Colon lengde på 0, 5 og 7 dager på 2,5% DSS. Dataene er gjennomsnitt ± SE av 4-9 mus per gruppe * p .. 0.05
A. og B. representant histologiske bilder av sammenlignbare regioner i distal kolon fra kontroll (A.) og
Mttp-IKO
mus (B.) etter 5 dager med DSS behandling. Paneler A og B viser økt slimhinneskader i
Mttp-IKO
mus preget av økt lamina propria betennelse som strekker seg til submucosa med tap av krypter. C og D. representant histologiske bilder av sammenlignbare regioner i synkende kolon fra kontroll (C) og
Mttp-IKO
mus (D.) etter 7 dager DSS behandling. Paneler C og D viser en økning i lamina propria betennelse, focal kryptitt preget av nøytrofil infiltrasjon og samlings krypten drop-out i
Mttp-IKO
mus. Linjene indikerer 100 mikrometer. E. kvantitativt estimat av histologiske skader (n = 5-7 mus pr gruppe). F. BrdU positive krypten cellene i rektal slimhinne. Data var i gjennomsnitt ± SEM av n = 5-6 mus pr gruppe. * P. 0,05
DSS administrasjon induserer ikke makroskopisk liten tarmskade i Mttp-IKO mus og er ikke forbundet med kolon lipid akkumulering
Våre tidligere studier vist at blokkering chylomicron sekresjon fra tarmen av
Mttp-IKO
mus fører til massiv lipid overfylling med villus forvrengning [11], øke muligheten for at den høye dødelighet støtt på følgende DSS administrering kan reflektere grov skader i tynntarmen hos disse mus. Men dette var ikke tilfelle. Som vist i figur 3 AD, observerte vi den forventede lipidakkumulering i tynntarm villi i
Mttp-IKO
mus, men det var ingen grov eller histologiske tegn på sår i en hvilken som helst region av tynntarmen etter 7 dager med DSS behandling. I tillegg, siden Mttp er uttrykt i tykktarmen hos mus (riktignok ved lave nivåer [18], [19]) vi utforsket muligheten for at colonic lipidakkumulering kan bidra til fenotypen observert i
Mttp-IKO
mus . Men dette igjen var ikke tilfelle. Som vist i figur 3E-H, mens vi har oppdaget rikelig lipid dråpe opphopning i tynntarmen hos
Mttp-IKO
mus (som tidligere nevnt [11]) var det bare sjelden, spredte Osmium farging lipiddråper sett i kolon av
Mttp-IKO
mus, og det var ingen akkumulering av triglyserider, kolesterol eller frie fettsyrer i colonic slimhinnen som påvises ved enzymatisk analysen (Figur 3I).
AD. Representant H E farging av tynntarm fra Kontroll og
Mttp-IKO
mus enten uten DSS behandling (A. Kontroll-0 og B. Mttp-IKO-0) eller etter 7 dager DSS behandling (C. Kontroll -7 og D. Mttp-IKO-7). Tynntarmen fra
Mttp-IKO
mus (B og D) viser villus lipid akkumulering (vacuolar struktur i H E flekker), men ingen signifikant skade eller betennelse etter 7 dager DSS behandling (D vs B). E-H. Representant osmiumtetroksyd farging av lipid dråper i tynntarmen (E og F) og Colon (G og H) uten DSS behandling. Lipid dråper vises som brune bilder (piler). Legg merke til de rike lipider dråper i
Mttp-IKO
tynntarms enterocytes (F), derimot med bare spredt lipid dråper i
Mttp-IKO
colonic epitelceller (H). I. Tykktarms lipider ble hentet fra kontroll og
Mttp-IKO
mus uten DSS behandling og lipid arter (TG, TC og FFA) målt. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SEM av 4-5 mus per gruppe.
Økt intestinal permeabilitet i Mttp-IKO mus og rollen til en adaptiv stressrespons
Mens funnene ovenfor innebærer at det ikke er noen brutto endringer i villus integritet i
Mttp-IKO
mus, utforsket vi muligheten for at mer subtile endringer kan være assosiert med barriere dysfunksjon. For å løse denne muligheten, vi administreres FITC-merket dekstran ved gavage til mus av begge genotyper, enten før eller etter 7 dager med DSS administrering. Våre funn viser at serum FITC nivåene var signifikant høyere i
Mttp-IKO
mus i henhold til begge forhold (figur 4A). Disse funnene tyder på at det er endret barrierefunksjon ved baseline i
Mttp-IKO
mus som blir ytterligere svekket i innstillingen av DSS skade. Vi neste vurdert muligheten for at økt intestinal permeabilitet fenotype i
Mttp-IKO
mus kan delvis gjenspeile endringer i uttrykket av integrerte membranproteiner som er involvert i tett veikryss vedlikehold og som har endret uttrykk har vært knyttet til feil i menneske inflammatorisk tarmsykdom [20], [21]. Vi har funnet at ekspresjonen av HNF4α, ZO-1 og Lamb1 ble redusert ved baseline i tynntarmen hos
Mttp-IKO
mus og ble redusert etter behandling DSS, særlig i kontrollmus (Figur 4B). Det var en tilsvarende nedgang i ZO-1 uttrykk i tykktarmen ved DSS behandling med lignende svar i kontroll og
Mttp-IKO
mus (Figur 4C).
A.
Mttp-IKO Hotell og kontroll mus enten før DSS eller 7 dager etter DSS behandling ble oralt administrerte FITC-dekstran og serumnivåer målt 4 timer senere. Dataene er gjennomsnitt ± SEM av 7-8 mus per gruppe * P. 0,05. B. og C. mRNA ekspresjon av gener relatert til ER stress og epitelial barriere functioin i tynntarmen og tykktarmen. mRNA uttrykk ble målt ved QPCR og uttrykt som ganger endring sammenlignet med ikke-DSS behandlet kontrollmusene etter normalisert til intern kontroll GAPDH. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM av 4-5 mus pr gruppe. D. Effekten av TUDCA på overlevelse andel av kontroll og
Mttp-IKO
mus på DSS. 8-10 uker gamle mus ble behandlet med TUDCA eller saltoppløsning intraperitonealt under samtidig administrering av DSS (2,5%) i drikkevannet i 12 dager. n = 5-9 hver gruppe. * P. 0,05
Vi har også undersøkt parametere av utfoldet protein respons (UPR) og integrerte stressrespons trasé i tynntarmen og tykktarmen av begge genotyper og virkningen av DSS eksponering. Disse funnene demonstrert økt baseline uttrykk for grp78 og Chop i tynntarmen av
Mttp-IKO
mus (figur 4B), som tidligere nevnt [22]. Imidlertid DSS behandling ikke klart å produsere en ytterligere økning i hvilken som helst av disse stress markørene, men snarere en tendens til å redusere ekspresjon av grp78 og Hakk i tynntarmen hos
Mttp-IKO
mus (figur 4B). Derimot var det ingen baseline endringer i UPR mRNA i tykktarmen av
Mttp-IKO
mus, men DSS behandling resulterte i økt overflod av Xbp-1s i begge genotyper (Figur 4C). Disse funnene tyder på at det er ingen baseline UPR respons i tykktarmen av
Mttp-IKO
mus. For å undersøke muligheten for at en adaptiv ER stressrespons kan påvirke skade fenotype observert i
Mttp-IKO
mus, behandlet vi mus med kjemisk anstand tauroursodeoxycholic syre (TUDCA) siden tidligere studier har vist at denne strategien demper UPR i metabolske spenningsforholdene i mus [22], [23]. Disse funnene viser at TUDCA behandling klarte å redde alvorlig fenotype av DSS behandlet
Mttp-IKO
mus og hvis noe førte til akselerert død i disse dyrene (Figur 4D). Disse funnene sammen lede oss til å konkludere med at funksjonene i ER stress og UPR bemerket i tynntarmen av
Mttp-IKO
mus er adaptive i naturen og at opphevelse av denne responsen fører til verre skade.
Forbedret colonic betennelse i Mttp-IKO mus i respons til Departementenes skade
Vi observerte den forventede økningen i uttrykket av flere cytokin mRNA i tykktarmen av DSS behandlet mus, inkludert IL-1β, IL-17A og NLRP3, med tilsvarende induksjon i begge genotyper (figur 5A). Men vi har observert en større økning i TNFa uttrykk i tykktarmen av DSS behandlet
Mttp-IKO
mus sammenlignet med kontroller (figur 5A). Vi har også undersøkt serumnivåer av LPS, IL-1β og TNFa, som tidligere har blitt forbundet med tarmskade i mus behandlet med DSS [14], [24]. Disse funnene viser at serum TNFa nivåene ble konsekvent forhøyet i
Mttp-IKO
mus, både ved baseline og etter DSS behandling, mens serumnivåer av LPS og IL-1β var mer variabel (figur 5B-D).
A. mRNA uttrykket av gener relatert til betennelser i synkende kolon av kontroll og
Mttp-IKO
mus før og etter 7 dager DSS behandling. mRNA ble målt ved QPCR og uttrykt som fold endringer i forhold til ikke-DSS-behandlede kontrollmusene etter normalisert til GAPDH. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM av 5-9 mus pr gruppe. * P 0,05. B.-D. Serumcytokinene i kontroll og
Mttp-IKO
mus. Blod ble samlet inn fra kontroll og
Mttp-IKO
mus før eller 7 dager etter DSS behandling. Serum LPS (B), IL1β (C) og (D) TNFa nivåer ble målt som beskrevet i Metoder. Dataene er gjennomsnitt ± SEM av 8-10 mus per gruppe. * P. 0,05
Kolon skade og betennelse er assosiert med økt mottakelighet for CAC i Mttp-IKO mus
En betydelig mengde data tyder på at betennelse er en viktig driver for tumorigenesis og arbeid antyder en utløsende lenke formidlet via veier som involverer inflammatoriske cytokin signalering [25], [26]. Gitt tilbøyelighet til
Mttp-IKO
mus å manifestere en mer alvorlig fenotype i respons til Departementenes mediert skade, spurte vi om denne økte tykktarmsbetennelse var assosiert med en endret colonic tumorbyrde etter administrasjon av azoxymethane fulgt av tre sykluser av DSS (figur 6A). Funnene avdekker større svulst mangfold (figur 6B) og total tumorbelastning (figur 6C, D) (verifisert av patologisk undersøkelse av en patolog blindet for genotype) i
Mttp-IKO
mus i forbindelse med økt celleproliferasjon som dokumentert av BrdU inkorporering (figur 6E, F).
A. Øvre panel: Skjematisk oversikt over AOM /DSS-protokollen (detalj i Methods). Musene ble avlivet 12 dager etter den siste syklus av DSS. n = 13-15 mus hver gruppe. Nedre panel: Prosent vektendring under AOM-DSS behandling. B. Representative colonic bilder. C. Antall kolorektal tumorer per musen indusert av AOM-DSS behandling. D. Tumor byrde i AOM-DSS behandlet kontroll og
Mttp-IKO
mus. Data fra panelene D. er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av tumorområdet normalisert til total kolonområdet, n = 9-10 mus i hver gruppe. E. og F. Økt polypp spredning av BrdU flekker. (E) er et representativt bilde, er øvre panel en kontroll polypp, nedre panel er fra en
Mttp-IKO
polypp. (F) er det stolpediagram som viser gjennomsnitt ± SEM (n = 5-6 mus pr gruppe). * P. 0,05
provoserende signaler kombinert med endret fettsyre signaliserer kjøretur vekst mekler sekresjon i Mttp-IKO mus
For å forstå mer i dybden mekanismene bak den proliferative fenotype observert i tykktarmen av
Mttp-IKO
mus i respons til AOM /DSS, vi igjen undersøkte uttrykk mønstre av IL-1β og TNFa. Vi observerte økte mRNA overflod av IL-1β i
Mttp-IKO
mus (figur 7A) og en trend til økt IL-1β protein uttrykk (figur 7B). Ekspresjonen av TNFa-mRNA var sammenlignbare med genotype men vi har observert en signifikant økning i TNFa-proteinnivåene i tarmvev fra
Mttp-IKO
mus (figur 7B). Disse funnene igjen støtter hypotesen om at en endret inflammatorisk respons bidrar trolig til økt tumorbelastning observert i
Mttp-IKO
mus.
A. Endret mRNA uttrykket av gener relatert til betennelser og vekst. Genuttrykk i AOM /DSS-behandlet synkende kolon ble målt ved QPCR og uttrykt som ganger endring i forhold til å styre mus etter normalisering til GAPDH. Dataene er gjennomsnitt ± SEM (n = 4 i hver gruppe). * P 0,05. B. Protein innhold av IL1β og TNFa i homogenates av synkende kolon fra AOM /DSS-behandlet kontroll og
Mttp-IKO
mus ble målt med ELISA. Dataene er gjennomsnitt ± SEM (n = 4 i hver gruppe). * P 0,05. C. Western blot analyse av amfiregulin (Areg), (1:1000 fortynning av primær antistoff fra Thermo Fisher Scientific, Cat # RB-258); Akt (1:1000 av primær antistoff fra Cell Signaling, Cat # 9272); p-Akt (1:1000 av primær antistoff fra Cell Signaling, Cat # 9271) i homogenates av prøver utarbeidet (Methods) fra vev som er nevnt ovenfor i B. D. Western blot ble kvantifisert ved Kodak bilde stasjon 440 og Carestream MI SE programvare. Søylediagram reflekterer gjennomsnitt ± SEM av relative uttrykk i forhold til å styre etter normalisering til GAPDH. E. Fecal lipid arter i chow-matet kontroll og
Mttp-IK
O mus. Totalt fekal lipider ble hentet ut og kolesterol (Chol), triglyserider (TG), fosfolipider (PL), og frie fettsyrer (FFA) kvantifisert enzymatisk. Fettinnhold presenteres som ug /g avføring og FFA innholdet er også presentert som mikromol /g avføring (innfelt). Dataene er gjennomsnitt ± SEM (n = 4-5 per gruppe) ** p 0,01. F. mRNA overflod av Areg og ereg i grunnskolen tarm myofibroblasts etter den angitte stimulering. Myofibroblasts ble stimulert med angitte faktorer i 12 timer. Gene (mRNA) uttrykk ble målt ved QPCR og uttrykt som ganger endring sammenlignet med kontrollceller etter normalisering til GAPDH. Eksperimenter ble utført to ganger med tre paralleller for hvert eksperiment. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Forskjellen mellom verdiene av gruppe er angitt med en annen bokstav for å indikere statistisk signifikans (p 0,05 eller høyere). G. Western blot analyse av Areg protein uttrykk i tarmslimhinnen homogenates fra kontroll og
Mttp-IKO
mus på vestlig diett i 2 uker.
For å utforske mekanismene på spill i denne respons, foretok vi en undersøkelse av mulige formidlere av denne pro-proliferative fenotype. Avskrift profilering viste ingen signifikante endringer i mRNA uttrykk av flere kandidatformidlere (figur 7a), men det var en trend til økt amfiregulin protein uttrykk og en økning i fosfor-Akt overflod (figur 7C, D). Disse funnene foreslått for oss at utskillelsen av mediatorer fra tarm myofibroblasts kan spille en rolle i vekstmodulering via parakrine veier. Til støtte for denne muligheten er det arbeid som viser en rolle for stromal myofibroblast produksjon av amfiregulin og epiregulin fremme kolon tumorvekst i innstillingen av betent menneskelige kolon [27]. Vår tilnærming ble ledet av tidligere funn som viser at små intestinale epitelceller fra
Mttp-IKO
mus gjennomgå lipotoxic skade etter kort sikt høyt fett fôring [22]. Basert på disse observasjonene, mistenkt vi at vedvarende vekstfremmende effekten av tarm
Mttp
sletting ble potensielt formidlet av myofibroblasts.
For å utforske denne muligheten nærmere, vi slått til primær murine tarm myofibroblasts for å undersøke amfiregulin og epiregulin regulering. Vi først etablert som fecal fettinnhold ble økt som følge av malabsorpsjon av fett i
Mttp-IKO
mus, som tidligere dokumentert [11]. Spesielt demonstrerte vi økt fekal frie fettsyrer (FFA) overflod samt økt innhold av kolesterol og fosfolipider i
Mttp-IKO
mus (Figur 7E). Vi har fastslått at den fecal FFA-konsentrasjonen i kontrollmusene (-60 umol /g) var lik den som nylig rapportert [28]. Vi fokuserte vår oppmerksomhet på de rike mettede fettsyrer, velge palmitinsyre som et første mål i å undersøke reguleringen av både amfiregulin og epiregulin [29]. Våre funn viser slående oppregulering av amfiregulin og epiregulin mRNA i grunnskolen musetarm myofibroblasts med 200 mikrometer palmitat (figur 7E). Videre er det kjent induksjon av amfiregulin og epiregulin av TNFa og IL-1β [30] ble ytterligere forbedret ved å inkludere palmitat (figur 7E). Disse funnene antyder at fettsyrer spiller en rolle i vekstmodifiserende reaksjoner i forbindelse med andre kjente mediatorer. I tråd med dette forslaget demonstrerte vi økt tynntarm uttrykk for amfiregulin uttrykk i
Mttp-IKO
mus etter eksponering for et fettrikt vestlig kosthold (figur 7F, G). Til sammen funnene sterkt at økt colonic fettsyre tilgjengelighet, produsert av defekt tynntarm chylomicron montering og påfølgende blokk i normal lipid absorpsjon, forverrer inflammatorisk og andre adaptive trasé som øker colonic spredning.
Diskusjoner
