Abstract
Betydelig fremgang har blitt oppnådd mot å belyse de molekylære mekanismene som ligger til grunn brystkreft progresjon; ennå, mye mindre er kjent om de tilhørende mobil biofysiske egenskaper. For å oppnå dette, bruker vi tidsbortfalt konfokal mikroskopi for å undersøke samspillet mellom celle motilitet, tre-dimensjonal (3D) matrise stivhet, matrisearkitektur, og transformere potensial i en mammary epitelcellelinje (MEC) kreft progresjon serie. Vi bruker en godt karakterisert brystkreft progresjon modell hvor human-deriverte MCF10A mecs overuttrykker enten ErbB2, 14-3-3ζ, eller begge deler ErbB2 og 14-3-3ζ, med tom vektor som en kontroll. Cellemotilitet analyser viste at mecs overuttrykke ErbB2 alene utstilt særlig høy migrasjon hastigheter når kultivert toppen to-dimensjonale (2D) matriser, mens overekspresjon av 14-3-3ζ alene mest undertrykte migrasjon oppå 2D matriser (sammenlignet med ikke-transform MECS). Våre resultater tyder også på at co-overekspresjon av 14-3-3ζ og ErbB2 proteiner letter celle trekkfugl kapasitet i 3D-matriser, noe som reflekteres i celle migrasjon hastighet. I tillegg kan 3D-matriser med tilstrekkelig stivhet betydelig hindre vandrende evne delvis transformerte celler, men økte 3D matrix stivhet har en mindre effekt på aggressiv trekkende atferd utstilt ved fullt transformerte celler som co-overuttrykker både ErbB2 og 14-3-3ζ. Til slutt viser denne studien at for mecs innehar delvis eller full transformerende potensial, de overuttrykke ErbB2 alene viser størst følsomhet for celle migrasjon hastighet til matrise arkitektur, mens de overuttrykk 14-3-3ζ alene utstillings minst følsomhet for matrise arkitektur. Gitt den nåværende kunnskapen om brystkreft mechanobiology disse funnene samlet tyder på at cellemotilitet styres av et komplekst samspill mellom matrisemekanikk og trans potensial
Citation. Baker EL, Srivastava J, Yu D, Bonnecaze RT, Zaman MH (2011) Cancer Cell migrasjon: Integrerte Roller av Matrix Mekanikk og Transforming potensial. PLoS ONE 6 (5): e20355. doi: 10,1371 /journal.pone.0020355
Redaktør: Donald Gullberg, Universitetet i Bergen, Norge
mottatt: 9 februar 2011; Godkjent: 19 april 2011; Publisert: May 27, 2011
Copyright: © 2011 Baker et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble gjort mulig av United Negro College Fund (UNCF) /Merck Graduate Science Research Dissertation Fellowship til ELB, den filantropiske Educational Organization (PEO) Scholar Award til ELB, Charles Tate Foundation UT Seed Grant til MHZ og DY, og National Institutes of Helse finansiering (1R01CA132633) til MHZ. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
De aller fleste av brystkreftrelaterte dødsfall skyldes metastatiske svulster; således forstå samspillet mellom de cellulære mikromiljø og brystkreft metastatisk potensial er kritisk viktig for utvikling av effektive behandlinger for denne sykdom. Betydelig fremgang er oppnådd mot å avsløre de molekylære mekanismene som ligger til grunn brystkreft progresjon [1], [2]; imidlertid kvantitativ karakterisering av de assosierte cellulære biofysiske egenskaper forblir ufullstendig. Fundamentalt har metastase fortsetter via migrering og invasjon av kreftceller gjennom variabel ekstracellulære matriks (ECM) miljøer, og studier har vist at cellemigrering er faktisk følsom for matrise mekaniske egenskaper [3], [4], [5]. Likevel er systemene nivå relasjoner mellom matrisemekanikk, sykdomsutvikling og cellemotilitet i brystkreft ikke godt forstått, spesielt med hensyn til fysiologisk relevante tredimensjonale (3D) matrise miljøer.
I løpet av de siste to tiårene , nøkkel brystkreft biomarkører har blitt identifisert og knyttet til bestemte stadier av sykdommen. To viktige faktorer er ErbB2 (HER2 /neu) og 14-3-3ζ proteiner, begge med sitt overekspresjon er blitt korrelert med dårlige prognoser kliniske av brystkreftpasienter [6], [7]. ErbB2 og 14-3-3ζ har likeledes vist seg å indusere cellulære funksjoner in vitro som er sammenlignbare kliniske presentasjoner. ErbB2 er et transmembran reseptor tyrosinkinase av den epidermale vekstfaktor-reseptor-familien av proteiner, og er involvert i flere signalbaner som modulerer cellevekst, differensiering, apoptose, og andre viktige cellulære prosesser [8]. På analog mecs som er konstruert for å overuttrykke ErbB2 har vist seg å oppvise hyperplasi og luminal fylling i 3D-kultur, selv om ikke fullstendig transformasjon og invasjon [9], [10]. ErbB2 er utvilsomt en av de mest studerte molekylene i området for brystkreft [11], og er et viktig mål for legemiddelutvikling. Faktisk, gitt dens evne til å gi resistens mot visse typer kreftterapi og dens prognostisk verdi, bestemme dens status med hensyn til nylig diagnostiserte tilfeller av brystkreft er blitt standard praksis [12]. Påfallende er den ErbB2-proteinet overuttrykt i over 50% av tidlige stadium ikke-invasiv brystkreft (duktalt karsinom in situ, DCIS) [13]; ennå, er det overuttrykt i bare ca 25% av senere stadium invasive og metastatisk brystkreft [7]. Forklaring av disse tilsynelatende inkonsistente ErbB2 uttrykk profiler har unngikk forskere hittil; Men resultatene som presenteres her, tyder på at dette fenomenet kan forklares delvis av en bryst epitelceller (MEC) følsomhet for matrise arkitektur.
14-3-3ζ protein tilhører en større familie på syv 14- 3-3 regulatoriske proteiner som er allment uttrykt og som er involvert i en rekke cellulære homeostatiske prosesser, blant annet en generell celleoverlevelse /anti-apoptotisk mekanisme [14]. Det er blitt vist at overekspresjon av 14-3-3ζ confers mecs i 3D kultur med en betydelig motstand mot anoikis [15] (en type av apoptose som oppstår når epitelceller løsner fra ekstracellulære ligander), som fremmer luminal fylling og driver mot mecs transformasjon [16]. Overekspresjon av 14-3-3ζ har også blitt vist å indusere bemerkelsesverdige morfologiske trekk av epitel-mesenkymale overgang, som er karakteristisk for progresjon mot en invasiv fenotype [9], [15], [17]. Videre analyser av pasient biopsier viser at over 40% av metastatisk brystkreft overuttrykker dette proteinet [6]. Til tross for sine evner til å skjenke ikke-transformerte celler med onkogene attributter, overekspresjon av verken ErbB2 eller 14-3-3ζ alene er tilstrekkelig til å gi en fullstendig transformasjon in vitro. Imidlertid har deres samarbeidende over-ekspresjon er vist å fremme utviklingen fra ikke-invasivt karsinom til invasiv kreft in vitro og er også forbundet med progresjon av DCIS til invasive og metastatisk brystkreft hos pasienter [9].
Gitt tidligere etablerte sammenhenger mellom brystkreft biomarkører og metastatisk progresjon, samt nåværende kunnskap substrat avhengig cellemotilitet og celle-matrise interaksjoner, følgende grunnleggende spørsmål er fortsatt ubesvart for individuelle mecs med hensyn til matrisemekanikk: (1) Er MEC motilitet lydhør overfor 3D matrix stivhet? (2) Er dette reaksjonsevne relatert til trans potensial? Og (3), er det en sammenheng mellom celle motilitet og trans potensial, gitt en bestemt matrisearkitektur? I denne studien har vi kvantitativt undersøkt disse spørsmålene ved å bruke tidsbortfalt konfokalmikroskopi å undersøke effekten av matrisen stivhet og arkitektur på migrasjon hastighet og utholdenhet av individuelle mecs som er dyrket på toppen av 2D matriser og de som er innebygd i 3D-matriser av ulik elastisk moduler. Vi undersøkte human-deriverte mecs av variert transformerende potensial med hensyn til matriser formulert fra naturlig type I kollagen, som er den viktigste strukturelle komponenten i melke stroma. Våre undersøkelser gir ny innsikt i brystkreft mechanobiology ved å vise at matrisen stivhet og arkitektur par med trans potensial til å styre de trekkende mulighetene mecs.
Resultater
For å utforske forholdet mellom brystkreft formerer potensial og celle motilitet i forhold til matrise mekanikk, analyserte vi et godt karakterisert kreft progresjon serie etablert fra den ikke-transformert human-avledede MCF10A cellelinje. Vi undersøkte fire MCF10A underlinjer, hvis omfanget av trans potensialet er karakterisert i henhold til deres vekst egenskaper og morfologiske egenskaper når forming acinar strukturer i 3D kultur [9]. Som tidligere beskrevet [9], [17], de underlinjer (fig. 1
A
) besto av [1] 10A.vec-en ikke-transformert kontrollcellelinje, [2] 10A.ErbB2-en hyperplastiske, apoptose-resistente partielt transformerte cellelinje som overuttrykker ErbB2, [3] 10A.14-3-3ζ-en depolarisert, apoptose-resistente, og morfologisk unormal delvis omdannet cellelinje som overuttrykker 14-3-3ζ, og [4] 10A.ErbB2.ζ-en invasiv, fullt transformert cellelinje som overepxresses både ErbB2 og 14-3-3ζ.
(
A
) Ductal /enkel lapp tverrsnitts skildring av MCF10A bryst kreft progresjon serie: 10A.vec (ikke-transformert), 10A.ErbB2 (delvis omgjort), 10A.14-3-3ζ (delvis forvandlet), og 10A.ErbB2.ζ (fullt transformert). (
B
) Mean cellemigrasjon hastighet
S
oppå 2D matriser; p-verdier er med hensyn til
S
av 10A.vec celler. (
C
) Cell befolkningen utholdenhet tid
P
oppå 2D matriser (gjennomsnittlig
R
= 0,87). Alle p-verdier. (*, P≤0.05; **, p≤0.01; ***, p≤0.001) bestemmes fra
t
-UNDERSØKELSER for uparede prøver
effekten av å transformere potensialet på cellemotilitet oppå 2D matriser
Cell motilitet ble først undersøkt med hensyn til 2D matrise arkitektur, som er analog med MEC lag som dekker den indre overflate av den ductal basalmembranen ved den innledende fasen av invasjon inn i det underliggende kollagen-rik stroma in vivo (fig. 1
A
). I dette miljøet, mecs overuttrykke ErbB2 alene migrert med den raskeste gjennomsnitts migrasjon hastighet
S
(Fig. 1
B
). Ikke-transformerte celler viste den nest høyeste grad av bevegelighet, etterfulgt av underlinjer overekspresjon 14-3-3ζ (Fig. 1
B
). Todimensjonale motilitet mønstre av partielt transformert og fullt ut transformerte cellene også er i samsvar med transwell motilitet oppførsel som er blitt rapportert tidligere: 10A.ErbB2 celler beveget med de høyeste hastigheter, etterfulgt av 10A.ErbB2.ζ og deretter ved 10A.14-3 -3ζ [9]. Bestandighet tid
P
(oppnådd fra kurvetilpasning til den vedvarende random walk modell [18], se Materialer og Metoder) av ikke-transformerte celler som var større enn den for alle underlinjer som besitter formerer potensial (fig. 1
C
).
Effekt av trans potensialet på cellemotilitet innen 3D matriser
Deretter cellemotilitet ble vurdert med hensyn til 3D matrise arkitektur, som er analog til in vivo miljø hvor genetisk endret (delvis eller fullstendig forvandlet) celler har invadert deres lokale basalmembran og trengt inn i underliggende stroma (fig. 1
A
). Cellemotilitet analyser viste at trans potensial hatt en merkbar effekt på migrasjon hastighet
S
innen relativt kompatible 3D-matriser (fig. 2
A, etter stivhet
G
«
c
= 104 Pa). Ikke-transform mecs (10A.vec) viste den tregeste gjennomsnittshastighet, mens fullt forvandlet mecs (10A.ErbB2.ζ) migrert med den raskeste hastigheten (fig. 2
B
). MECS overekspresjon ErbB2 eller 14-3-3ζ alene, selv om delvis omgjort, ikke viser en merkbar endring i bevegeligheten i forhold til 10A.vec celler (fig. 2
B
) i kompatible 3D-matriser. Videre migrasjon hastighet
S
i overensstemmelse matriser negativt korrelert med sphericity cellemorfologi index
Ψ
som vi tidligere har rapportert for disse underlinjer når de dyrkes under de samme 3D matrisene [17]. Som vist på fig. 2
B product: (innfelt) [17],
Ψ
avtar som
S
øker, ifølge MEC transformasjon profil. I kompatible matriser, cellepopulasjon utholdenhet tid
P
var lavest for fullt invasive celler (fig. 2
E
).
(
A
) Skanning elektronmikroskopi av kompatible (104 Pa) og stive (391 Pa) 3D-matriser; skala bar er 2 mikrometer. (
B
) Mean cellemigrasjon hastighet
S
i kompatible 3D-matriser. (Innfelt) celle sphericity
Ψ
som tas fra Baker et al. [17]; p-verdier er med hensyn til
S
(Og
Ψ
) av 10A.vec celler. (
C
) Mean cellemigrasjon hastighet
S
i stiv 3D-matriser; p-verdier er med hensyn til
S
av 10A.vec celler. (
D
) prosent nedgang i
S
av celler i løpet kompatible matriser i forhold til cellene i stive matriser. P-verdiene i svart reflektere forskjellen i
S
mellom cellene i kompatible matriser og de samme cellene i stiv matriser; p-verdiene som vises i rødt reflektere forskjellen i% reduksjon i
S
blant de underlinjer. (
E
) Cell befolkningen utholdenhet tid
P
i kompatible og stive 3D-matriser (gjennomsnittlig
R
= 0,87). (
F
) prosent nedgang i
S
celler oppå 2D matriser i forhold til celler i løpet av kompatible 3D-matriser. P-verdiene i svart reflektere forskjellen i
S
mellom celler oppå 2D matriser og de samme cellene i kompatible 3D-matriser; p-verdiene som vises i rødt reflektere forskjellen i% reduksjon i
S
blant de underlinjer. Alle p-verdier. (*, P≤0.05; **, p≤0.01; ***, p≤0.001) bestemmes fra
t
-UNDERSØKELSER for uparede prøver
effekt av 3D matrix stivhet på cellemotilitet
i relativt stivere 3D-matriser (fig. 2
En
, stivhet
G
«
c
= 391 Pa ), cellemotilitet analyser viste en oppførsel signifikant forskjellig fra det som ble observert i overensstemmelse matriser. I stivere matrise miljø, fullt forvandlet mecs migrert raskere enn alle andre underlinjer (fig. 2
C
). Men delvis transformerte celler (10A.ErbB2 og 10A.14-3-3ζ) migrerte betydelig tregere enn både ikke-transformerte og fullt transformerte celler. Skiftet i cellemotilitet mellom kompatible og stive matriser er videre vist som en prosent nedgang i migrasjon hastighet, ifølge transformasjon profil (fig 2
D
.); denne avbildningen viser at blant de underlinjer som migreringshastigheten var følsom for 3D-matrise stivhet, ble motiliteten fullstendig transformerte celler minst påvirket av økningen i matrisen stivhet. I forhold til celler i kompatible 3D-matriser, celle utholdenhet tid
P
i stiv 3D-matriser (fig. 2
E
) var lavere for celler som delvis eller full transformerende potensial, men betydelig høyere for ikke-transformerte celler (10A.vec).
Integrerte effekter av matrix arkitektur, matrix stivhet, og transformere potensialet på cellemotilitet
Sammenligning vandringshastigheter på celler oppå 2D matriser til de innebygd i lignende 3D-matriser viser at matrise arkitektur har en betydelig effekt på cellemotilitet. Figur 2
F
skildrer dette skiftet i motilitet som en prosent nedgang i hastighet av celler oppå 2D matriser i forhold til de som er innenfor kompatible (104 Pa) 3D-matriser. Faktisk er bevegeligheten i 3D-matriser betydelig redusert for alle celleunderlinjer undersøkt; imidlertid, av de underlinjer som innehar delvis eller fullstendig transformerende potensial, celler som overuttrykker ErbB2 alene (10A.ErbB2) viste den største følsomhet for matrisearkitektur. Den 10A.ErbB2 underlinjen opplevd en betydelig 94% reduksjon (15 ganger reduksjon) i celle migrasjon hastighet når i 3D-matriser i forhold til at når disse cellene ble festet til 2D matriser.
Undersøkelse av 3D Windrose tomter ( fig. 3) gir en bred, sammendrag av den vandrende karakter utstilt ved denne MCF10A progresjon serien (radene representerer matrisen tilstand, mens søylene representerer underlinjen).
XY
-planet confocal bilder (Fig. 4) viser også typiske representative celler og morfologiske egenskaper utstilt ved hver av de fire underlinjer, noe som kan bære noen tilknytning til trekk data som presenteres her, samt celle stivhet funn som vi har rapportert tidligere [17]. MECS overekspresjon 14-3-3ζ alene utstilt rørformede formede fremspring (fig. 4, grønne piler) [19] på tvers av alle matrix forhold, mens de co-overekspresjon både ErbB2 og 14-3-3ζ utstilt tynne, stavlignende utvidelser ( fig. 4, gule karat) for alle matriseforhold. Celler som overuttrykker ErbB2 alene viste minimale stavlignende forlengelser og bare når det er innebygd i relativt stive (391 Pa) matriser, mens de resterende MEC underlinjer viste liknende grad av fremspring på begge kompatible og stive matriser.
øverste raden lister cellelinje de raskeste migrerende cellene på 2D matriser (10A.vec og 10A.ErbB2) utstilt arklignende cellulære prosesser i dette miljøet (fig 4, blå parentes.).; venstre kolonnen viser matrix tilstand. Celler i 2D matriser utstilt den høyeste grad av bevegelighet, etterfulgt av celler i kompatibel (104 Pa) 3D-matriser og deretter av celler i stiv (391 Pa) 3D-matriser
øverste raden lister celle linjer. venstre kolonnen viser matrix tilstand. Gule karat indikere tynne, stavlignende cellulære prosesser. Grønne piler indikerer rørformede formede cellulære fremspring. Blå parentes angir arklignende cellulære fremspring.
Diskusjoner
Cell motilitet kan bli påvirket av en rekke parametere, inkludert ekstracellulære kjemiske gradienter [20], matrise mekaniske egenskaper [4] , matriksdegradering [21], intracellulær kontraktilitet [5], og celle adhesivitet [22]. I økende grad har kreftceller blitt fokus for studier som utforsker effekten av den ekstracellulære miljøet på mobil homeostase [4], [23], cellular viskoelastisitet [24], [25], og cellemotilitet. Mens betydelige fremskritt er oppnådd i avdekke noen av de molekylære mekanismer og signalveier som ligger til grunn brystkreft og andre kreftformer [8], [14], mye mindre er kjent om de tilhørende mobil biofysiske attributter. Det har lenge vært etablert at brystkreft metastase er fundamentalt utføres av cellemigrasjon fra en primær tumormasse gjennom det underliggende stroma og det bryst kollagen tetthet er korrelert med brystkreft progresjon [26]. Videre kan kreftcellen vandringsevne påvirkes av stivheten av ECM [5]. Imidlertid er forholdet mellom den ytre celle mekaniske miljø og motiliteten av brystkreftceller ikke forstått. Samspillet mellom disse parametrene er ytterligere forvirret av scenen av brystkreft progresjon og kan også bære forhold til intracellulære mekaniske egenskaper [17]. For å undersøke samspillet mellom matrise mekanikk, cellemotilitet, og transformere potensialet i brystkreft, har vi benyttet tidsbortfalt konfokalmikroskopi å måle migrering fart og utholdenhet av mecs som er festet til 2D matriser og de som er innebygd i 3D matriser, som begge består av naturlig type i kollagen. Ved å undersøke en brystkreft progresjon rekke underlinjer som stammer fra en enkelt MEC forelder linje, er vi i stand til å direkte sammenligne kinesis av celler som besitter varierende trans potensial.
in vivo ekstracellulære mikromiljøet er en heterogen medium som består av flere komponenter, med den relative balanse og betydningen av disse komponenter avhengig av graden av progresjon av kreft. I denne studien har vi undersøkt motiliteten mecs som har kapasitet til å fritt navigere deres ECM. For tilfelle av 3D-matriser, er dette fysiologisk mest sammenlignbare med individuelle mecs som har invadert den lokale ductal basalmembran og kan migrere innenfor den underliggende stroma (figur 1
A
.); for tilfellet av 2D-matriser, er dette mest analog med tidlig fase kreft celler som kan framviser forbedret bevegelighet langs den indre duktalt basalmembranen ved den innledende fasen av invasjon i det underliggende kollagen-rik stoma (Fig. 1
A
). Vi undersøkte enkeltceller som er helt i inngrep med matrisen (men ikke knyttet til andre celler) for å eksperimentelt kontrollere graden og typen av celleoverflateutstyret; dermed er mecs undersøkt her skjema celle-matrise vedlegg via ß1 inte [27].
Undersøke cellevandring med hensyn til både 2D og 3D-matriser tilbyr et bredt perspektiv på MEC motilitet (Fig. 3). Overekspresjon av ErbB2 har blitt vist tidligere for å skjenke mecs med øket proliferativ kapasitet [10], og det har også vært assosiert med klinisk tidlig stadium brystkreft (DCIS) [9]. Faktisk matrisen miljøet i tidlig stadium brystkreft (DCIS) mer ligner det av en 2D matrise arkitektur enn det gjør en 3D-matrise miljøet (fig. 1
A
). Når kultivert oppå 2D matriser, mecs overuttrykke ErbB2 alene migrert med den raskeste hastigheten (fig 1
B
.); ikke-transformerte celler viste den nest høyeste grad av bevegelighet, etterfulgt av underlinjer overekspresjon 14-3-3ζ (Fig. 1
B
). Den betydelig redusert migrering hastighet på 14-3-3ζ-overuttrykkende underlinjer i forhold til de resterende to underlinjer antyder at 14-3-3ζ-mediert nedregulering av E-cadherin [9], [15] kan gi en mindre virkning på celle motilitet oppå 2D matriser enn på mecs som er i oppdrag med å navigere i et 3D-matrise miljø. Dette understreker igjen det komplekse samspillet mellom trans potensielle og matrise mekanikere i styrende cellemotilitet. Høy persistens av ikke-transformerte celler i forhold til de resterende genetisk endrede underlinjer (Fig. 1
C
) indikerer at trans potensiell kan gi mecs med en økt følsomhet for 2D matrise topografi, noe som ville bli reflektert i tilfeldig endring av celle baner som sammenlignet med mer rettet celle bevegelser av ikke-transformerte celler. En økt følsomhet til matrise topografiske signaler bør være en fordel til celler som prøver å invadere deres lokale basalmembran.
Våre resultater tyder på at innen relativt kompatible 3D-matriser (104 Pa), som skaper potensial i forbindelse med morfologiske funksjoner er dominere faktorer som påvirker cellemotilitet. Som vist på fig. 2
B
, fullt transformerte celler (10A.ErbB2.ζ) migrert med den raskeste hastigheten
S
i dette miljøet, etterfulgt av morfologisk endrede 14-3-3ζ-overekspresjon celler, og deretter
Sammenligning MEC bevegelighet i kompatible matriser som for mecs i stivere matriser tyder på at celle trekkfugl evne er ikke bare en effekt av trans potensial; snarere er det styrt av en balanse av indre celle biofysiske egenskaper sammen med matrise mekanikk. Den liten forbedring av tynne, stavlignende utvidelser som oppvises av 10A.ErbB2 celler i stivere matriser (fig. 4), selv om subtil, kan bære tilknytning til den høye stivhet føleevne som vi tidligere har rapportert for denne sublinje [17]. Men selv om morfologiske trekk ved en gitt underlinjen var lik i 3D-matriser med forskjellig stivhet (Fig. 4), systemomfattende migreringshastighetsprofiler viser tydelige mønstre i forhold til matrise stivhet (fig. 2
B Hotell og
C Hotell og fig. 3). I begge matrix miljøer, ikke-transform mecs migrert saktere enn fullt forvandlet mecs, som migrerte med de raskeste hastighetene. Men i de stivere matriser (391 Pa), delvis transformerte celler (10A.ErbB2 og 10A.14-3-3ζ) migrerte betydelig tregere enn ikke-transformerte celler. Økt matrise stivhet resulterte i en redusert trekkende evne til fullt ut transformerte celler, men denne effekten var enda mer uttalt for partielt transformerte celler (Fig. 2
D
). Disse resultater antyder at tilstrekkelig tetthet avhengig 3D matrise stivhet kan spille en rolle i betydelig grad hindrer den vandrende evnen til partielt transformerte celler; Imidlertid kan denne økningen i 3D matrix stivhet ikke være nok til å overvinne den aggressive atferd utstilt ved fullt invasive celler, som dokumentert av bare moderat reduksjon i migrasjon hastighet 10A.ErbB2.ζ celler (fig. 2
D
). Resultater fra vårt tidligere studium av disse underlinjer viste at de stivere matriser, 10A.ErbB2 celler oppviser den høyeste intracellulære stivhet, mens den samtidig transformerte celler 10A.ErbB2.ζ oppvise en moderat stivhet, og 10A.14-3-3ζ celler oppviser en forholdsvis lav stivhet [17]. Totalt vurderer dagens motilitet data i forbindelse med resultatene av våre tidligere undersøkelser tyder på at MEC migrasjon i 3D-miljøer proveny på en optimal balanse mellom genetisk transformasjon profil, intracellulær stivhet, fordelaktige morfologiske egenskaper, og matrise stivhet. Dermed kan en økning i celle trekkfugl hastighet som ellers måtte følge av delvis eller full transformasjon reduseres delvis av tetthetsavhengige matrise stivhet.
Den endelige analysen av denne studien (fig. 2
F
) presenterer en svært provoserende resultat, gitt at ErbB2 onkogen oppdages med lavere frekvens i invasive og metastatisk brystkreft enn det er i tidlig stadium brystkreft. Faktisk er utbredelsen av ErbB2 overekspresjon i invasiv og metastatisk brystkreft bare
halvdel Hotell som fra tidlig stadium kreft [9], som har vært en forvirrende fenomen. Resultatene fra våre motilitet analyser tyder på at et skifte i matrisearkitektur kan være forbundet med denne virkemåten. Når mecs overgang fra en ikke-invasiv tidlig fase kreft til en invasiv og deretter metastatisk kreft, de migrerer fra toppen et 2D-basalmembran overflate til innenfor et området 3D stroma og dermed opplever en endring i matrisearkitektur (fig. 1
A
). I denne studien bevegeligheten av 10A.ErbB2 celler har størst følsomhet til et skifte i matrise arkitektur, sammenlignet med de andre underlinjer som besitter delvis eller full transformerende potensial (fig. 2
F
). Det følger at celler som utviser et betydelig redusert stromal vandrende evne kan være mindre sannsynlighet for å helt invadere deres lokale grenser og videre traversere rundt stroma til senere manifest som metastatisk brystkreft. Det bør også bemerkes at overekspresjon av 14-3-3ζ undertrykte betydelig 2D migrasjon (fig. 1
B
), samtidig som synergistisk forbedrer 3D-migrasjon når ErbB2 ble også overuttrykt (fig. 2
B
og
C
). Således motiliteten av celler som overuttrykker 14-3-3ζ alene oppviste den minste følsomhet for matrisearkitektur, sammenlignet med 10A.ErbB2 og 10A. ErbB2.ζ celler (fig. 2
F
).
I sammendraget, denne studien gir ny innsikt i brystkreft motilitet ved å vise at trans potensielle par med matrise stivhet og arkitektur til å påvirke migrasjon hastighet og utholdenhet av MECS. Mange tidligere undersøkelser har bidratt vesentlig til den nåværende forståelse ved å undersøke ErbB2 og 14-3-3ζ-mediert effekt på intracellulær stivhet [17], MEC bevegelighet i løselige kjemiske gradienter [20], kreft celle migrasjon med hensyn til ligand tilgjengelighet [5] og motilitet-induserte matrise remodellering [28]. Ved å ansette tidsbortfalt imaging, har vi lagt til denne kunnskapen ved å måle migrering hastighet mecs både dyrkede oppå 2D matriser og innebygd i 3D-matriser. Forholdet mellom brystkreftcelle motilitet og substratets egenskaper er sammensatt; nærmere avklaring av disse forbindelsene kan oppstå fra flere fremtidige studier som undersøker effekten av 2D matrise stivhet og matrix protein grunnlov på motilitet av underlinjer undersøkt her. En klarere forståelse av MEC-matrix interaksjoner har bred løftet som kan til slutt lede utviklingen av målrettet terapi og kreft-fokusert translasjonell forskning.
Materialer og metoder
Cell kultur
motilitet analyser ble utført på stabile underlinjer som ble etablert som tidligere beskrevet [9] fra ikke-kreft, human-avledede MCF10A MEC linje (gitt av Dr. Robert Pauley av Karmonos Cancer Institute, Detroit, MI). Cellelinjene ble opprettholdt i 2D monolagskultur i DMEM /F12 vekstmedier [29] i en fuktet inkubator ved 37 ° C, 5% CO
2 til tidspunktet for eksperimentering.
kollagen matriks Fremstillingen og karakter
To-dimensjonale matriser laget ved fortynning av høy konsentrasjon type 1 kollagen til 2 mg /ml ved anvendelse av 20 ul etanol-dialized 2,0 um karboksylerte, gul-grønn fluorescerende tracer polystyren kuler (Molecular Probes, Carlsbad, CA) (ca. 2% faststoff), og en balanse av 0,01 M HCl; 1,5 ml av oppløsningen ble deretter satt inn i brønnen på en 35 mm glassbunn skål og inkubert ved romtemperatur i 1 time. Etter denne perioden, ble oppløsningen suget av, slik at bare vulsten impregnerte kollagenbelegg som hadde klebet til glassbunn (se fig. S1
A
). Skålene ble deretter renset to ganger med PBS og lagret ved 37 ° C, 5% CO
2 i 45 minutter inntil fluorescerende merkede celler ble deponert i formen.
Tre-dimensjonale matriser ble formulert fra høy konsentrasjon Type i kollagen (BD Biosciences, San Jose, CA), som ble fortynnet til to konsentrasjoner på 2 og 4 mg /ml. Like deler kollagen og nøytraliserende oppløsning (100 mM Hepes i 2 x PBS ved pH 7,3) ble blandet med 20 ul av den perlesuspensjon og en balanse mellom 5 x 10
5 fluorescerende merkede celler suspendert i vekstmedium for å oppnå den endelige konsentrasjonen [ ,,,0],30] (se fig. S1
B
). Hver matrise-løsning (1 ml) ble deretter avsatt over overflaten av et 35 mm glassbunn tallerken (Mattek, Ashland, MA). Matriks-løsninger ble tillatt å gelere i 90 min ved 37 ° C, 5% CO
2, hvorpå 1,5 ml av dyrkningsmedier ble avsatt på toppen av 3D-matrisene for å gi celler med tilstrekkelig næringsstoffer i løpet av et påfølgende 4,5 timers inkubasjonstid ved 37 ° C, 5% CO
2. Matrise stivhet ble målt ved hjelp av konus og plate rheometri og kvantifisert i forhold til hoveddelen skjærelastisitetsmodulen til kollagen gel
G
«
c
, som angis som 104 og 391 Pa for 3D type i kollagen geler av konsentrasjon 2 og 4 mg /ml, respektivt, som tidligere beskrevet [17]. I dette manuskriptet, blir matriser av modulus 104 Pa referert til som forholdsvis kompatibel, mens de av modulus 391 Pa beskrives som forholdsvis stiv.
