Abstract
epitel mesenchymale overgang (EMT) er en viktig prosess i svulst utvikling. Til tross for tidligere undersøkelser, er det fortsatt uklart hvordan P120-catenin (p120ctn) isoformene 1A og 3A påvirke EMT tumorceller. Her undersøkte vi uttrykk for p120ctn, E-cadherin og vimentin i 78 human ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) prøver av immunhistokjemi og funnet ut at p120ctn membran uttrykk positivt korrelert med E-cadherin uttrykk (
P
0,001) og negativt korrelert med vimentin uttrykk og lymfeknutemetastase (
P
0,05). I mellomtiden, p120ctn cytoplasma uttrykk negativt korrelert med E-cadherin uttrykk (
P
0,001) og positivt korrelert med vimentin uttrykk og lymfeknutemetastase (
P
0,05). Celler som uttrykker høye (H460 og SPC) og lave (H1299 og LK2) nivåer av p120ctn var skjermen for å undersøke dens innvirkning på EMT. E-cadherin var begrenset til cellemembranen i H460 og H1299 celler, mens det ble uttrykt i cytoplasma av SPC og LK2 celler. Ablasjon av endogent p120ctn isoform 1A i celler som uttrykker høye nivåer av proteinet førte til nedsatt E-cadherin uttrykk, økt N-cadherin, vimentin og snegle ekspresjon og forbedret invasivitet i H460-celler. I mellomtiden, helt motsatte resultater ble observert i SPC celler. Videre transfeksjon av i H1299 celler som uttrykker lave p120ctn nivåer med p120ctn isoform 1A plasmid resultert i økt E-cadherin uttrykk, redusert N-cadherin, vimentin og sneglen uttrykk og svekket invasivitet, mens LK2 celler viste helt motsatte resultater. Begge cellelinjer som uttrykker lave p120ctn nivåer og transfektert med p120ctn isoform 3A plasmid syntes å ha økt E-cadherin uttrykk, redusert N-cadherin, vimentin og sneglen uttrykk og svekket invasivitet. I konklusjonen, i celler med membran E-cadherin, isoformene både p120ctn 1A og 3A hemmet EMT og redusert celle invasivitet. I celler med cytoplasmatiske E-cadherin, p120ctn isoformen 1A fremmet EMT og økt celle invasivitet, mens p120ctn isoformen 3A hemmet EMT og redusert celle invasivitet
Citation. Zhang Y, Zhao Y, Jiang G, Zhang X, Zhao H, Wu J et al. (2014) Effekt av P120-catenin isoformer 1A og 3A på epithelial Mesenchymale Overgang av lungekreft celler uttrykker E-cadherin i ulike subcellulære Steder. PLoS ONE 9 (2): e88064. doi: 10,1371 /journal.pone.0088064
Redaktør: Frédéric André, Aix-Marseille Universitet, Frankrike
mottatt: 21 november 2013; Godkjent: 06.01.2014; Publisert: 04.02.2014
Copyright: © 2014 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation of China National (tilskudd 81071905 og 81272606 til E.-HW, gir 81.101.780 til YZ). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epitel mesenchymale overgang (EMT) er en rask og ofte reversibel endring av celle fenotype og spiller en spesielt viktig rolle i tumorutvikling. I prosessen med EMT, epitelceller gjennomgå en fenotypisk bryter for dannelse av mesenchymale celler som ligner på fibroblaster [1], [2]. Slike fenotypiske forandringer føre til epitelceller til å miste sine karakteristiske celle-celle adhesjon strukturer, endre sin polaritet, modulere organiseringen av deres cytoskeletal systemer, slår ekspresjon fra keratin- til vimentin-type mellomliggende filamenter, samt bli isolert, bevegelig og motstandsdyktig overfor anoikis [3], [4]. Typisk celler som gjennomgår EMT viser redusert E-cadherin uttrykk [5], [6] og redusert ekspresjon av mesenchymale biomarkører, slik som N-cadherin, vimentin, snegl, slug og vri [7], [8].
Tidligere studier om forholdet mellom P120-catenin (p120ctn) og EMT har vært begrenset til overgangen fra korte til lange p120ctn isoformene under EMT indusert av uttrykk for SIP1 /ZEB2 [9], vri [10] eller Zeppo1 [11 ]. Imidlertid er mekanismen ved hvilken P120-catenin isoformer 1A og 3A påvirke EMT av tumorceller er ukjent. Den p120ctn protein har fire isoformene (1 til 4) som følge av fire transkripsjonsstartsider, og hver isoform har en full sentral Armadillo gjenta domene som kan samhandle med juxtamembrane domenet av E-cadherin for å delta i dannelsen av en vedheft kompleks på cellemembranen [12]. Disse observasjoner tyder på at den subcellulære lokalisering og funksjon av p120ctn kan påvirkes ved lokalisering av E-cadherin. Tidligere studier har vist at p120ctn kan spille motsatte roller, avhengig av om det er plassert på membranen eller i cytoplasma av celler [13], [14]. Andre har også funnet at p120ctn isoformer 1A og 3A har forskjellige regulatoriske funksjoner på tumorcellevekst, invasjon og metastase [15], [16],. Disse studiene viser at hvis p120ctn har en innvirkning på EMT, er det sannsynlig å være forskjellig mellom p120ctn isoformene 1A og 3A.
Noen studier har vist at p120ctn kan fremme eller hemme tumorvekst og invasivitet avhengig av om E -cadherin uttrykt eller ikke [18], [19]. Yu og kolleger fant også ulike effekter av p120ctn isoformer 1A og 3A på spredning og invasjon i tumorceller som viser ulike lokaliseringer av E-cadherin [20]. Så om vi p120ctn isoformene 1A og 3A også spille ulike roller i regulering av EMT i tumorceller med E-cadherin på forskjellige steder er fortsatt ukjent.
Formålet med denne studien var å fastslå de potensielle effekter og reguleringsmekanismer p120ctn isoformene 1A og 3A på EMT i lungekreftceller. Vi først viste at membranen eller cytoplasmisk ekspresjon av p120ctn korrelert med ekspresjon av E-cadherin og vimentin eller lymfeknutemetastase ved immunohistokjemi. Vi videre oppdaget uttrykket nivåer av p120ctn, E-cadherin og vimentin i lungekreft celler ved Western blot og skjermet cellelinjer som uttrykker både lave og høye nivåer av p120ctn og med E-cadherin i membranen eller cytoplasma. Endringer i uttrykket av EMT-relaterte molekyler og celle invasjon ble også undersøkt av knockdown av endogen p120ctn-1A eller overekspresjon av transfeksjon av p120ctn-1A og 3A plasmider inn i cellene.
Materialer og metoder
materialer
Denne studien ble gjennomført med godkjenning av Institutional Review board i Kina Medical University. Skriftlig samtykke ble gitt av deltakerne for informasjon som skal lagres i databasen sykehus og for deres prøver å bli brukt i denne studien. Alle kliniske undersøkelser ble gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Prøvene ble samlet inn fra 78 tilfeller av plateepitelkreft lungekreft og lunge adenokarsinom diagnostisert ved First Affiliated Hospital of China Medical University (Sheny-ang, Kina). Prøvene var fra 46 mannlige og 32 kvinnelige pasienter med en gjennomsnittsalder på 57 år. Prøvene ble klassifisert i henhold til lunge svulst histologiske kriterier (2004) av Verdens helseorganisasjon (WHO) [21] som plateepitelkarsinom lungekarsinom (32 tilfeller) eller lunge adeno-karsinom (46 tilfeller). Tretti tilfeller ble svært differensiert, og førtiåtte var moderat eller dårlig differensiert. Lymfeknutemetastaser var til stede i 43 tilfeller, men ikke i den andre 35. Vi valgte tilfeller med lymfeknutemetastaser for å sammenligne de metastatiske noduler med den primære tumor. Tumor iscenesettelse ble utført i henhold til svulsten-node-metastaser (TNM) staging system av International Union mot Kreft (UICC) [22]. Det var 39 tilfeller ved stadium I-II, og 39 tilfeller på scenen IIIa-IIIb. Ingen av pasientene hadde fått strålebehandling eller kjemoterapi før operasjonen og fikk standard behandling etter operasjonen. Alle prøvene ble fiksert i formalin, innstøpt i parafin og farget med hematoxylin og eosin for patologisk analyse og diagnose.
Cell kultur
Normal menneskelig bronkial epitelceller (HBE) celler og A549, H1299, H460 og H157-cellelinjer ble erholdt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). SPC-A-1, ble LTEP-A-2 og LK2 cellelinjer som er kjøpt fra Shanghai Cell Bank of Chinese Academy of Science. De menneskelige lunge ADC Anip973 og AGZY83a cellelinjer ble kjøpt fra Shanghai Bioleaf Biotech Co., Ltd (https://www.bioleaf.com) og lagret i Avdeling for patologi, Harbin Medical University. Celler ble dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) inneholdende 10% føtalt kalveserum (Invitrogen), 100 IU /ml penicillin (Sigma, St. Louis, MO, USA) og 100 mg /ml streptomycin (Sigma) .
Plasmid konstruksjon og transfeksjon
Expression plasmider for p120ctn isoformene 1A og 3A (donert av Dr. Albert B. Reynolds Department of Cancer Biology, Vanderbilt University School of Medicine, TN, USA) har blitt tidligere beskrevet [16]. Sekvenser av p120ctn-1A-siRNA (Guangzhou Ruibo Co Ltd, Guangzhou) anvendt i forsøkene var som følger: si-h-CTNND1: 5′-CACAAGAUGCCAACCCACU dTdT-3 «, 3′-dTdT GUGUUCUACGGUUGGGUGA-5». Cellene ble transient transfektert med p120ctn-1A-siRNA og plasmider uttrykker p120ctn isoformene 1A og 3A ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California) eller Attractene Transfeksjon Reagens (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner.
Immunohistochemistry
parafin innebygd prøver ble kuttet serielt inn 4-mikrometer tykke seksjoner. Normal bronkialepitelet til stede i tumor slides ble anvendt som en intern positiv kontroll. Immunfarging ble utført med streptavidin-peroksidase (S-P) -metoden. De vevssnitt ble inkubert med en p120ctn mus monoklonalt antistoff (1:100, katt 610134, BD Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA.), E-cadherin kanin monoklonalt antistoff (1:100, katt SC-7870,. Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, CA, USA) eller vimentin kanin monoklonalt antistoff (klar til bruk, kat. RMA-0547, MaiXin Bio, Fuzhou, Kina) ved 4 ° C over natten. PBS ble anvendt som en negativ kontroll. Biotinylert geite-anti-mus-serum-IgG eller biotinylert geite-anti-kanin-serum IgG (klar-til-bruk, kat. KIT-9922, MaiXin Bio) ble anvendt som det sekundære antistoff. Etter vasking, ble seksjonene inkubert med streptavidin-biotin konjugert med pepperrotperoksidase (Ultra, MaiXin Bio), og deretter peroksydasereaksjonen ble utviklet med 3,3-diaminobenzidin tetrahydroklorid (MaiXin Bio). Lys kontra ble utført med hematoksylin, og deretter seksjonene var dehydrert i alkohol før de blir montert.
To etterforskere uavhengig undersøkt alle kreft lysbilder. Fem tilfeldige felt ble undersøkt per lysbilde, og 100 celler ble observert per høy forstørrelse feltet (400 ×). Prosentandelen av positive celler ble bedømt som følger: 0 = ingen flekker; 1+ = 0-25%; 2+ = 26-50%; 3+ = 51-75%; og 4+ = 76-100%. Den fargeintensitet ble scoret som følger: 0 = ingen flekker; 1 = lys gul granulat; 2 = mørk gul eller brun granulat. Merkingen poengsum definert ved å multiplisere andelen positive celler av fargeintensitet var sluttresultatet for seksjonen. Når den totale poengsummen var ≥3 ble saken definert som positiv. Når den totale poengsummen var 3, ble saken definert som negative. For skårer større enn 3 poeng, når mer enn 30% av tumorcellene farget sterkt og kontinuerlig i p120ctn signal på cellemembranen, ble prøven definert som positiv membran. Når færre enn 30% av tumorcellene vist membranen uttrykk men flekker sterkt og kontinuerlig for p120ctn i cytoplasma ble prøven definert som positiv cytoplasmaet.
Western blot-analyse
Femti mikrogram proteiner ble separert ved SDS-PAGE (10%). Etter overføring til et polyvinylidenfluorid (PVDF) membran (Millipore, Billerica, MA, USA), ble proteinene inkubert over natten ved 4 ° C med antistoffer mot det følgende: p120ctn (1:500, katt 610134.), E-cadherin ( 1:300, katt. 610181), N-cadherin (1:1000, katt. 610920) (BD Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA), vimentin (1:1000, katt. 5741), snegl (1:500, katt. 3879) (Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA) og vri (1:200, katt. sc-15193, Santa Cruz Biotechnology). Etter inkubasjon med anti-mus (1:2000, E030110-01) eller anti-kanin (1:2000, E030120-01) IgG (EarthOx LLC, San Francisco, CA, USA) ved 37 ° C i 2 timer, proteinet bånd ble visualisert ved hjelp av forbedret chemiluminescence (ECL, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) og kvantifisert ved hjelp Bioimaging Systems (UVP, Upland, CA, USA). Relative proteinnivåer ble beregnet med referanse til GAPDH som laste kontroll.
Immunofluorescent farging
Celler dyrket på dekkglass ble fiksert med iskald 4% paraformaldehyd i 15 minutter, fulgt av permeabiliseringen med 0,2% Triton X-100 og inkubasjon med normalt geiteserum i 30 minutter ved 37 ° C. Cellene ble deretter inkubert over natten med p120ctn mus monoklonalt antistoff (1:200, katt 610134;. BD Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA) og E-cadherin kanin polyklonale antistoff (1:100, SC-7870, Santa Cruz Biotechnology). Primære antistoffer ble påført over natten ved 4 ° C, etterfulgt av inkubasjon med et rhodamin /fluorescein-5-isotiocyanat (FITC) -merket sekundært antistoff geit-anti-mus eller TRITC-merket geit-anti-kanin IgG (1:100, kat. E031210 -01 og E031320-01, EarthOx, San Francisco, CA, USA). Kjernene ble kontra med propidiumjodid /4, 6 diamidino-to-phenylin-dole. Epifluorescent mikroskopi ble utført ved hjelp av en invertert Nikon TE300 mikroskop (Melville, NY, USA), og konfokalmikroskopi ble utført ved hjelp av en Radiance 2000 laser scanning confocal mikroskop (Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA).
Matrigel celle invasjon analysen
Matrigel celle invasjon analyser ble utført i henhold til produsentens instruksjoner (Corning, Acton, MA, USA). En 100 pl cellesuspensjon (5 x 10
5-celler) ble tilsatt til det øvre kammer, mens det nedre kammer ble fylt med RPMI 1640 medium inneholdende 10% føtalt kalveserum. Hver øvre og nedre kammer er atskilt med en 8-um porøs polykarbonatmembran. Cellene ble inkubert i 24 timer ved 37 ° C i en fuktig atmosfære med 5% CO
2. Etter at mediet var kassert, ble cellene fiksert med metanol i 30 minutter og farget med hematoksylin (Sigma). For hvert filter ble antall celler som invaderte til den nedre overflaten av den porøse membran i fem forskjellige feltene i 400 x forstørrelse talt vilkårlig ved hjelp av et Nikon E200 mikroskop. Det ble beregnet ut fra data innhentet fra hvert forsøk gjennomsnittlig gjentatt tre ganger.
Statistisk analyse
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) for Windows-programvare . Chi-kvadrat test ble brukt for å analysere immunhistokjemi data. Den uavhengige prøver T-testen ble anvendt for å undersøke Transwell eksperimentelle data.
P
verdier. 0,05 ble betraktet som statistisk signifikant
Resultater
Membran uttrykk for p120ctn positivt korrelerer med E-cadherin uttrykk og negativt korrelert med vimentin uttrykk og lymfeknutemetastaser
Normale bronkial epitelvev viste p120ctn i membranen (figur 1A), mens andelen av lungekreft vev som uttrykker p120ctn i membranen var signifikant lavere (35%, 27/78) enn med p120ctn cytoplasmatisk ekspresjon (65 %, 51/78). E-cadherin ble uttrykt i membranen i normale bronkialepitelet vev (figur 1A), mens frekvensen av positive ekspresjon ble redusert (28%, 22/78), og at negativ ekspresjon ble betydelig økt (72%, 56/78) for E-cadherin i lungekreft vev. Vimentin var negativt uttrykt i normale bronkial epitelvev (figur 1A), mens frekvensen av positive ekspresjon ble økt til 32% (25/78) i den lungekreft vevet. Det ser ut til lungekreft vev med cytoplasma /kjernefysiske lokalisering av p120ctn tendens til å uttrykke vimentin sammenlignet med de med membran lokalisering (41,2% [21/51] versus 14,8 [4/27]) .. Cytoplasmatiske /kjernefysiske lokalisering av p120ctn viste økt lymfeknutemetastaser (29/51) sammenlignet med membran lokalisering (8/27). Statistisk analyse viste at lokaliseringen av p120ctn var nært beslektet med E-cadherin uttrykk, vimentin uttrykk og lymfeknutemetastase (
P
0,05) (tabell 1). Med andre ord, ble p120ctn membran uttrykk positivt korrelert med E-cadherin ekspresjon og negativt korrelert med vimentin uttrykk og lymfeknutemetastase (figur 1B); i mellomtiden, p120ctn cytoplasma uttrykk var negativt korrelert med E-cadherin uttrykk og positivt korrelert med vimentin uttrykk og lymfeknutemetastase (figur 1C).
(A) E-cadherin og p120ctn ble membran positive, og vimentin var negativ i normale bronkial epitelceller. (B) E-cadherin var membran positiv, og vimentin var negativ i p120ctn membran positiv lungekreftceller. (C) E-cadherin var negativ, og vimentin var positiv i p120ctn cytoplasmatiske-positive lunge kreftceller.
Lokalisering av p120ctn er forenlig med E-cadherin i lungekreftceller
Vi undersøkte protein uttrykk nivåer av p120ctn og E-cadherin i normale HBE celler og ni lunge kreft cellelinjer ved Western blot og funnet ut at de alle uttrykt isoformer hovedsakelig 1A (120 kDa) og 3A (100 kDa) av p120ctn ( Figur 2A). Selv om protein uttrykk nivåer av p120ctn ikke var relatert til E-cadherin, lokalisering (membran eller cytoplasma) av p120ctn var alltid konsekvent med at av E-cadherin. Vi deretter screenet celler som uttrykker høye nivåer av p120ctn og E-cadherin i membranen (H460-celler) eller cytoplasma (SPC-celler), så vel som de som uttrykker lave nivåer av p120ctn og E-cadherin i membranen (H4299 celler) eller cytoplasma ( LK2 celler) for videre studier (figur 2B).
(A) Western blot analyser viste uttrykk for p120ctn og E-cadherin i ni lunge kreft cellelinjer og HBE. (B) Ved immunfluorescens analyse, uttrykket av E-cadherin og p120ctn ble observert begrenset til cellemembranen ved celle-celle adherens veikryss i H460 og H1299 celler, mens de begge var begrenset til cytoplasma i SPC og LK2 celler.
Ulike funksjoner av p120ctn isoform 1A i EMT er avhengig av E-cadherin subcellulære lokalisering
knockdown av endogen p120ctn isoform 1A av siRNA-p120ctn-1A resulterte i redusert E-cadherin uttrykk og økt N-cadherin, snegl og vimentin uttrykk i H460-celler (figur 3A). Men knockdown av endogen p120ctn-1A av siRNA-p120ctn-1A viste motsatte resultater i SPC celler, der vi fant økt E-cadherin uttrykk og redusert N-cadherin, snegl og vimentin uttrykk (Figur 3B). Sammenlignet med kontrollgruppen, ablasjon av p120ctn isoform 1A også forbedret H460 celler invasivitet (17,33 ± 1,25 vs. 36,33 ± 1,70,
P
0,01) (figur 3C), mens redusert SPC celler invasive (23,0 ± 0,82 vs. 13,0 ± 0,82,
P
0,01) (Figur 3D). Resultatene viste at p120ctn isoform 1A spiller en annen rolle i EMT og celle invasivitet i ulike E-cadherin subcellulære steder.
(A) ablasjon av p120ctn isoform 1A redusert E-cadherin uttrykk og økt N-cadherin, sneglen og vimentin uttrykk i H460 celler. (B) SPC-celler ble behandlet som i (A) og de motstående resultater ble oppnådd. (C) ablasjon av p120ctn isoform 1A forbedret invasivitet av H460 celler (**
P
0,01). (D) ablasjon av p120ctn isoform 1A redusert invasivitet av SPC celler (**
P
0,01).
hemmende funksjon av p120ctn isoform 3A på EMT påvirkes ikke av forskjeller i E-cadherin subcellulære lokalisering
for å verifisere om p120ctn isoformene 1A og 3A spille ulike roller i å regulere EMT, deres uttrykk plasmider ble transient transfektert i lungekreftceller med lavt uttrykk for p120ctn (H1299 med membran E-cadherin uttrykk og LK2 med cytoplasmatiske E-cadherin uttrykk). Den vestlige-blot analyse viste at overekspresjon av p120ctn isoformen 1A ført til økt E-cadherin uttrykk og redusert N-cadherin, vimentin og sneglen uttrykk (figur 4A); tvert imot, den nedsatte E-cadherin ekspresjon og økt N-cadherin, vimentin og snegle ekspresjon ble observert i LK2 celler (figur 4B). Overekspresjon av p120ctn isoformen 1A også redusert H1299 celle invasivitet (52,0 ± 2,65 vs. 33,33 ± 2,64,
P
0,01) (figur 4C), mens forbedret LK2 cellen invasivitet (18,0 ± 0,82 vs. 39.66 ± 2.05,
P
0,01) (figur 4D) .. Overuttrykte p120ctn isoform 3A ført til økt E-cadherin uttrykk, redusert N-cadherin, vimentin og sneglen uttrykk (Figur 4A, 4B) og redusert celle invasivitet (52,0 ± 2,65 vs. 29,66 ± 1,53,
P
0,01; 18,0 ± 0,82 vs. 8,33 ± uttrykk 0,47,
P
0,01) (figur 4C, 4D ) i begge disse cellelinjer. Disse resultatene ytterligere bekreftet at p120ctn isoform 1A hadde en annen effekt på EMT avhengig av subcellulære lokalisering av E-cadherin. De viser også at den p120ctn isoformen 3A opprettholdt en hemmende rolle i den EMT av lungekreftceller hvorvidt E-cadherin ble lokalisert til membranen eller cytoplasma.
(A, B) Både H1299 (E-cadherin membranen lokalisering) og LK2 celler (E-cadherin cytoplasma lokalisering) transient transfektert med p120ctn isoform 3A plasmid viste økt E-cadherin uttrykk og redusert N-cadherin, vimentin og snegl uttrykk. (C, D) Transient transfeksjon av p120ctn isoform 3A plasmider inn H1299 og LK2 celler resulterte i redusert celle invasivitet (**
P
0,01). (E) E-cadherin forble lokalisert på membranen i H1299 celler og i cytoplasma av LK2 celler etter transfeksjon av p120ctn isoformen 3A plasmid.
Diskusjoner
Fenomenet EMT i tumorceller fører ofte til redusert celleadhesjon og økt mobilitet, og denne overgang er ledsaget av redusert E-cadherin ekspresjon og økt ekspresjon av N-cadherin, vimentin og andre mesenchymale biomarkører [3], [4], [5], [ ,,,0],6], [7]. Som en viktig faktor for stabilisering av E-cadherin, spiller p120ctn en rolle i å hemme eller fremme tumorcelleformering og invasjon som er avhengig av hvorvidt E-cadherin er uttrykt eller ikke, [16], [17]. Videre isoformer p120ctn 1A og 3A har vist ulike effekter på E-cadherin ekspresjon og tumorcelle invasivitet som er basert på forskjeller i lokalisering av E-cadherin [18]. Disse resultatene antyder sterkt at p120ctn mest sannsynlig regulerer EMT av kreftceller ved å påvirke E-cadherin uttrykk og at p120ctn isoformene 1A og 3A spille ulike roller i EMT uttrykke E-cadherin i ulike subcellulære steder.
Vi først funnet at p120ctn membran uttrykk var positivt korrelert med E-cadherin uttrykk og negativt korrelert med vimentin uttrykk og lymfeknutemetastaser, mens cytoplasma uttrykk for p120ctn var negativt korrelert med E-cadherin uttrykk og positivt korrelert med vimentin uttrykk og lymfeknutemetastase ved immunhistokjemi . Selv om disse resultatene var i overensstemmelse med tidligere studier [13], [14], de videre foreslått at p120ctn sannsynlig påvirker EMT ved å påvirke ekspresjon av E-cadherin og vimentin og derved celleinvasjon og metastase i ikke-småcellet lungekreft ( NSCLC).
for å bekrefte de ulike konsekvensene av p120ctn isoformer 1A og 3A på EMT i celler som uttrykker E-cadherin på forskjellige steder, valgte vi H460 og H1299 celler med E-cadherin membran uttrykk og SPC og LK2 celler med E-cadherin cytoplasma uttrykk for videre analyse. Plasmider som uttrykker p120ctn isoformer 1A og 3A ble konstruert, og full-lengde p120ctn siRNA ble syntetisert for disse eksperimentene. Siden sekvensen utover aminosyrene 1-101 av p120ctn isoform 1A er lik den for p120ctn isoform 3A [24], [25], kunne vi ikke utforme et interferens sekvens spesifikt for p120ctn isoform 3A. Derfor hadde vi for å studere virkningen av de to isoformer på EMT og celle invasivitet i lungekreftceller med forskjellige E-cadherin steder spesielt ved å banke ned p120ctn isoform 1A i H460 og SPC celler med høy p120ctn uttrykk og trans cDNA plasmider for eksogene p120ctn isoformene 1A og 3A i H1299 og LK2 celler med lav uttrykk for p120ctn.
knockdown av p120ctn isoform 1A i H460 celler ødelagt epithelial celle adhesjon komplekser. E-cadherin-ekspresjon ble også nedregulert på grunn av tap av dens viktig stabiliserende faktor, p120ctn isoform 1A, som var i overensstemmelse med tidligere studier [20], [26]. Redusert E-cadherin ekspresjon og opprevne celle-celle adhesjon kan indusere EMT [27], [28], [43], [44], noe som resulterer i økt N-cadherin, vimentin og snegle ekspresjon og forbedret celle invasivitet. På den annen side, isoformer overuttrykt p120ctn 1A og 3A ble vist å binde E-cadherin plassert på membranen proaktivt i tumorceller [29], og deretter inhibere nedbrytning av E-cadherin og stabilisere dets ekspresjon, noe som bidrar til dannelsen av effektiv epitelial celle adhesjons komplekser [30], [31], [32]. Ettersom disse rekke fremgangsmåter opprettholdes den normale celle-celle adhesjon forbindelse og hemmet EMT, ble det øket E-cadherin ekspresjon og reduserte N-cadherin, vimentin og snegle ekspresjon, så vel som hemmet celle invasivitet på H1299-celler.
Tidligere studier har vist at selv om p120ctn isoform 1A kunne binde E-cadherin i cytoplasma, kan de ikke danne effektive adhesjons komplekser på membranen mellom epitelceller [33]. Videre er sannsynligvis ikke til å være i full lengde E-cadherin men i stedet spaltede E-cadherin fragmenter, for eksempel E-cad /SE-cad (80 kDa) og E-cad /ctf2 (33 kDa) cytoplasmatiske E-cadherin [34]. E-cad /ctf2 fragment kan binde seg til P120 i cytoplasma og deretter translocate inn i kjernen og binder transkripsjonen undertrykker av Kaiso å aktivere Wnt /b-catenin vei [35], [36], endelig fremme EMT svulst celler og styrke celle invasjon og metastasering [37]. Videre, andre har vist at p120ctn-1A er relatert til unormal ekspresjon av E-cadherin og dårlig prognose [38]. Disse studiene viste at cytoplasma p120ctn isoform 1A kan spille en rolle i å fremme tumorcelle EMT, invasjon og metastasering. Basert på ovennevnte, vi observerte på den ene siden at effekten av p120ctn isoform 1A å fremme tumorcelle EMT, invasjon og metastasering, ville bli løftet av sin ablasjon, noe som resulterer i økt E-cadherin uttrykk, redusert N-cadherin, vimentin og sneglen uttrykk og hemmet invasivitet i SPC celler. På den annen side, transfeksjon av p120ctn isoformen 1A plasmidet inn i LK2 celler som uttrykker cytoplasmiske E-cadherin resulterte i redusert E-cadherin uttrykk, økt N-cadherin, vimentin og snegle ekspresjon og forbedret celle invasivitet. Selv om den nøyaktige rollen til p120ctn under EMT induksjon er fremdeles uavklart, tidligere studier antydet at knockdown av alle isoformer av p120ctn kan indusere EMT indirekte [27], [28], [43], [44]. Alle induksjoner var basert på redusert E-cadherin uttrykk og inter heft i tidligere studier, som også ble bekreftet av vår studie i H460 celler med E-cadherin membran lokalisering. I motsetning til de H460 celler, kunne knockdown av p120ctn isoformen 1A i SPC celler med E-cadherin cytoplasma uttrykk reduseres ikke E-cadherin uttrykk og inter vedheft. I stedet har vi funnet øket E-cadherin ekspresjon og nedsatt celle invasivitet, noe som indikerer at EMT ikke kan bli indusert av denne reaksjonsveien i SPC-celler.
Det var verdt å merke seg at det samme resultat ble observert i LK2 og H1299 cellene transfektert med p120ctn isoform 3A plasmid, både som viser økt E-cadherin uttrykk, redusert N-cadherin, vimentin og sneglen uttrykk og hemmet celle invasivitet. Disse resultatene antydet at p120ctn isoform 3A har den funksjon å inhibere EMT av lungekreftceller, og denne funksjon er uavhengig av den cellulære E-cadherin lokalisering. Tidligere forskning har også bekreftet en overgang fra p120ctn isoform 3A til p120ctn isoform 1A uttrykk etter induksjon av EMT [9], [10], [11], som indirekte indikerer at p120ctn isoform 3A kan hemme EMT mens p120ctn isoform 1A fremmer EMT. I tillegg har vi også lagt merke til at p120ctn og E-cadherin protein uttrykk nivåer var signifikant økt etter transfeksjon av p120ctn-3A plasmid inn LK2 og H1299 celler, men p120ctn og E-cadherin var fortsatt i hovedsak begrenset til cellemembranen ved celle-celle adherens veikryss i H1299 celler. I motsetning til dette, ble E-cadherin og p120ctn nesten utelukkende lokalisert i cytoplasma i LK2 celler (figur 4E). Som et celleadhesjonsmolekyl, er E-cadherin kjent for å være bare plassert på cellemembran med potensiale til å hemme EMT, mens i cytoplasma, er det ofte spaltet til fragmenter og derfor fungerer forskjellig fra molekylene ligger på cellemembranen [ ,,,0],34]. Dermed vil den cytoplasmatiske E-cadherin teoretisk ikke spiller en rolle ved inhibering av EMT. Basert på ovennevnte analyse, spekulerte vi at det kan være noen interaksjon mellom p120ctn isoform 3A og snegl som spiller en rolle i å undertrykke EMT i lungekreftceller uttrykker cytoplasma E-cadherin, men denne hypotesen må undersøkes nærmere.
viktigere, også fant vi ut at knockdown av p120ctn-1A i SPC celler med cytoplasmatiske E-cadherin resulterte i redusert vri uttrykk (Figur 3B). I mellomtiden, transfeksjon av celler LK2, som også viste cytoplasmisk lokalisering av E-cadherin, med den p120ctn isoformen 1A plasmid resulterte i økt ekspresjon vri (figur 4B). Imidlertid ble det ikke observert endringer i vri uttrykk i resten av forsøkene (figur 3A, 4A). Som en transkripsjonsfaktor og master genet regulator av EMT [39], [40], kan vri downregulate E-cadherin uttrykk [41] og oppregulere N-cadherin og andre mesenchymale biomarkører [42].
