Abstract
Hovedmålet med dette arbeidet var å undersøke den potensielle effekten av aceton ekstrakt av
Ficus religosa
blad (FAE) i flere apoptose signalering i humane brystkreftceller. FAE behandling signifikant induserte dose og tidsavhengig, irreversibel hemming av brystcancer-cellevekst med moderate toksisitet overfor normale bryst epitelceller. Denne observasjonen ble validert ved hjelp Sulforhodamine B analysen. Cellesyklus analyse av Flow viste cytometri cellesyklus arrest i G1 fasen og induksjon av sub-G0 topp. FAE indusert kromatin kondens og vises en økning i apoptotisk befolkningen Annexin V-FITC /PI (fluoresceinisotiocyanat /Propidium iodide) dobbel farging. FAE stimulert tap av mitokondriemembranpotensialet i flere brystkreftcellelinjer i forhold til normale diploide celler. For å forstå hvilken rolle Bax i FAE indusert apoptose, ansatt vi en sensitiv celle basert plattform av MCF-7 celler som uttrykker Bax-EGFP. Bax trans til mitokondriene ble ledsaget av forstyrrelser i mitokondriemembranen potensial og markert høyde i LEHDase aktivitet (caspase 9). I samsvar med disse dataene, FAE indusert caspaseaktivering som gjenspeiles av forholdet endring i FRET caspase sensor uttrykker MCF-7 cellelinje og spalting av fremtredende Kaspaser og PARP. Interessant, FAE akselerert celledød i en mitokondrieavhengig måte i kontinuerlig levende celle bildemodusen som angir mulig fotosensibiliserende effekt. Intracellulær generering av reaktive oksygenarter (ROS) ved FAE spilt en viktig rolle ved formidling av apoptotisk celledød og fotosensibiliserende aktivitet. FAE indusert dose- og tidsavhengig inhibering av kreftcellevekst som var forbundet med Bax translokasjon og mitokondrier mediert apoptose med aktiveringen av caspase 9 avhengig caspase kaskade. FAE besatt også sterk fotosensibiliserende effekt på kreftcellelinje som ble formidlet gjennom rask mitokondrie trans potensielle tap og delvis caspaseaktivering involverer generasjonen av intracellulær ROS
Citation. Haneef J, MP, Thankayyan R SK, Sithul H, Sreeharshan S (2012) Bax Trans mediert mitokondrie apoptose og caspase Avhengig fotosensibiliserende Effekt av
Ficus religiosa
på kreftceller. PLoS ONE syv (7): e40055. doi: 10,1371 /journal.pone.0040055
Redaktør: Venugopalan Cheriyath, Texas A M University, USA
mottatt: 02.11.2011; Godkjent: 04.06.2012; Publisert: 06.07.2012
Copyright: © 2012 Haneef et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Universitetet Grants Commission (UGC) og Rådet for industriell og teknisk forskning (CSIR), Government of India, som Senior Stipend til henholdsvis Dr. Haneef og Dr. parvathy M. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Herbal planter og plantebaserte legemidler er blitt mye brukt i tradisjonelle kulturer over hele verden og har vunnet popularitet i det moderne samfunn som naturlige alternativer til å produsere nye potensielle terapeutiske forbindelser for å bekjempe sykdommer [1]. Den helsefremmende effekter av anlegget bestanddeler og ekstrakter blir stadig studert og deres forbruk er på vei oppover [2]. Mange urter har blitt evaluert i kliniske studier, og er for tiden under etterforskning phytochemically å forstå deres tumorici-dal aksjoner mot ulike kreftformer. Dessverre ble flertallet av studiene utført på enkeltmolekyler som ble funnet å være mindre effektive som chemopreventive midler i forhold til phytochemical cocktails som kan indusere sin aktivitet ved synergi [3].
Farmakologiske studier utført på friske plantemateriale av
F.religiosa
gi en pragmatisk støtte for sine mange tradisjonelle bruksområder. Dens bark, frukt, blader, adventivskudd røtter, latex og frø er medisinsk brukes i ulike former, noen ganger i kombinasjon med andre urter [4]. Fytokjemisk forskning utført på
F.religiosa
hadde ført til isoleringen av fytosteroler, aminosyrer, furanocoumarins, flavonoider, fenoliske komponenter, hydrokarboner, alifatiske alkoholer, flyktige komponenter og noen få andre klasser av sekundære metabolitter, tanniner, steroider , alkaloider og β-sitosteryl-D-glukosid, vitamin K, n-octacosanol, metyl oleanolate, lanosterol, stigmasterol, Lupen-3-on [5], [6]. Singh
et al product: [7] hadde foreslått en detaljert undersøkelse for dens potensial mot kreft, hjerte-, nevro provoserende, nevropsykiatriske, oksidativt stress relaterte lidelser og parasittinfeksjoner. De fleste av de farmakologiske undersøkelser ble rettet på å validere de tradisjonelle bruk for sårheling [8], [9], anti-bakterielle [10], anti-konvulsiv [11], anti-diabetiske [12], anti-oksidanter [13] , anti-inflammatorisk [14], acetyl- cholinesterase-hemmende aktivitet [15] og anti-angst aktivitet [16]. Den metanolekstrakt av
F.religiosa
blad utøver sterk nervecellene effekt mot betennelser forårsaket av mediatorer som nitrogenoksid og cytokiner i LPS (lipopolysakkarid) stimulert microglia via MAPK (Mitogen Aktivert Protein Kinase) pathway [17] .
Ficus arter
ble vist å ha anti-proliferativ aktivitet i tumorcellelinjer og de forskjellige deler har vist apoptotiske effekter, for derved å tilveiebringe en preliminær farmakologisk støtte for deres anvendelse som anticancer stoff [18] . Inntil nå ingen litteratur og eksperimentelle bevis er tilgjengelig for fyllestgjørende anti-kreft og apoptotiske virkning av
F.religiosa
blad ekstrakter på flere brystkreftceller. Dette fikk oss til å undersøke mulig mekanisme for sin apoptose fremme aktivitet og til å identifisere ytterligere biologisk aktivitet, hvis noen.
Cell syklus er en prosess som fungerer som en nøkkel til å styre vekst og spredning av en celle. Forstyrrelser i cellesyklusen prosessen vil føre til en ubalanse mellom celleproliferasjon og celledød, deretter fører til kreftutvikling. Således kunne cellesyklus tjene som mål for anticancermidler for å stanse ukontrollert proliferasjon av tumorceller, og for å igangsette dem til å gjennomgå apoptose [19]. Den apoptotiske prosess (eller programmert celledød) er en viktig mekanisme i respons til cytotoksisk behandling og dens induksjon er en meget ønskelig
modus operandi
for et anticancermiddel [20]. En av utfordringene i kreftbehandling er at ondartede celler har evnen til å unngå apoptose, som er den viktigste årsaken til ineffektivitet av noen cytotoksiske narkotika for å drepe slike celler. Den foreliggende undersøkelse viser effekten av acetonekstrakt av
F.religiosa
bladene på dose- og tidsavhengig inhibering av vekst av flere brystkreftcellelinjer som var forbundet med Bax translokasjon og mitokondrier mediert apoptose med aktiveringen av caspase 9 avhengige veien. Selv om FAE induserte signifikant caspaseaktivering både i enzymatisk analyse, så vel som i levende celle caspase sensor cellemodeller, kontinuerlig eksponering av de behandlede celler viste en uventet fotosensibiliserende aktivitet. Denne studien er viktig fordi det er den første rapporten som gir bevis for at bio-tilgjengelig bestanddeler av
F.religiosa
blad ekstrakt utøver fotosensibiliserende og apoptose induserende evne gjennom generering av intracellulære ROS.
resultater
Phytochemical Analyse
den nylagde rå aceton ekstrakt av
Ficus
blader (FAE) ble kvalitativt undersøkt for tilstedeværelse av alkaloider, flavonoider, fenoler, saponiner og tanniner ( tabell 1) ved anvendelse av standard prosedyrer for analyse [21]. Aluminiumklorid kolorimetrisk metode ble anvendt for flavonoider estimering [22]. Den flavonoid innhold av ekstraktet i form av quercetin tilsvarende var 79 ± 4 mg /g tørr FAE pulver. De totale fenoler anslått av Folin Ciocalteu metoden [23] i form av gallisk syre tilsvarende 110 ± 2,18 mg /g i pakke pulver.
FAE hemmet spredning av brystkreft cellelinjer
den anti-proliferative effekt av FAE på veksten av Bryst epitelceller, MCF-10A, MCF-7, MDAMB231, T47D og SKBR3 celler ble først bestemt ved MTT (3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid) analyse og cytotoksisitet ved trypan blå eksklusjon fargestoff assay. Celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av FAE (20-320 ug /ml) i 24, 48 og 72 timer. FAE hemmet veksten av brystkreftceller i en dose- og tidsavhengig måte (figur 1A). IC
50 verdi for hver cellelinjer bestemmes fra MTT-data – 363.6 ug /ml (Bryst epitelceller), 800 ug /ml (MCF10A), 83,3 ug /ml (MCF-7), 121,2 ug /ml ( MDAMB231), 81,6 ug /ml (T47D) og 75,47 ug /ml (SKBR3). I de to ikke-tumorigene mammary epitelceller, FAE viste moderat cytotoksisitet enn kreftceller. Et protein basert Sulforhodamine B analysen ble også utført som underbygget MTT resultater (figur 1B). Disse resultatene antydet at FAE viste stor selektivitet mot kreftceller enn normale celler. I tillegg mikroskopisk observasjon på cellemorfologi avslørte at FAE behandling indusert merk morfologi endringer slik som blebbing av membranen og krymping av celler bortsett fra reduksjon i celletetthet i en tidsavhengig måte (figur 1E) som var i overensstemmelse med trypanblått-farvestoff eksklusjonsdata ( figur 1C). Vi har utført klonogene celleoverlevelse analyse for å vurdere effekten av FAE på kolonidannelse. FAE behandling signifikant redusert antall kolonier på en doseavhengig måte i MCF-7-celler (figur 1D).
(A) MCF-7 celleproliferasjon ble bedømt ved MTT-assay- Celler ble behandlet med 20, 40 , 80, 160 og 320 ug /ml FAE i 48 timer. IC
50 verdi for hver cellelinjer bestemmes fra MTT-data er-363.6 ug /ml (Bryst epitelceller), 800 ug /ml (MCF10A), 83,3 ug /ml (MCF-7), 121,2 ug /ml ( MDAMB231), 81,6 ug /ml (T47D) og 75,47 ug /ml (SKBR3). (B) Cytotoksisitet ble bestemt ved anvendelse av en proteinbasert levedyktighet test Sulforhodamin B analyse (C) Celleviabilitet ved trypan blått fargestoff utelukkelse analysen ble MCF-7-celler behandlet med IC
50 av FAE for 24, 48 og 72 timer. Dataene som vises representerer gjennomsnittlig ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. (D) FAE hemmer kolonidannelse av brystkreftceller. MCF-7-celler ble sådd ut i seks brønners plater på 500 celler /brønn i fenol rød fri DMEM inneholdende 10% FBS. Etter 12 timer ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av FAE. Mediet med FAE ble endret etter hver 4. dag. Etter 14 dagers inkubering, ble kolonier farget med 0,3% krystallfiolett oppløsning i 2 minutter, vasket med PBS, luft-tørket og tellet. Hvert forsøk ble utført i tre paralleller. (E) Vekst inhibering og morfologiske forandringer i MCF-7-celler behandlet på IC
50 verdi av FAE for 24, 48 og 72 timer, sammenlignet med ubehandlede celler. Celler ble fotografert med en Leica DMIL invertert mikroskop (200 ×).
FAE forårsaket Mild cellesyklus arrest og Sub-Go Induksjon
Cell levedyktighet analyser bekreftet evne FAE å hemme MCF-7 cellevekst. Cellesyklusanalyse ved hjelp av strømningscytometri ble utført for å bestemme hvorvidt den FAE induserte inhibering av MCF-7 cellevekst var resultatet av induksjon av apoptose eller cellesyklus-stans eller den samtidige aktivering av disse to modusene. En representant histogram sammen med vedlagte data er gitt (figur 2 A og B). Resultatene viste at FAE behandling ved 100 ug /ml for 24, 48 og 72 timer induserte en dose- og tidsavhengig økning i prosentandelen av celler i sub- G
0-fase, som ble ledsaget av en tilsvarende reduksjon i den prosentvise celler i S og G
2 /M fase. Ved 24 timers eksponering, var det ingen betydelig endring i cellesyklusen fasefordelingen. Behandling med FAE i 48 og 72 timer økte cellepopulasjonen av G
1 fase til 60,4% og 58,3% henholdsvis sammenlignet med kontroll 56,6% (figurene 2 A og B). Alle disse funnene indikerte at FAE indusert mild G
1 fase arrest og induksjon av sub-Go befolkningen. Alle verdier ble oppnådd fra tre uavhengige eksperimenter. Signifikante forskjeller fra kontrollverdi ble indikert ved * (p 0,05) ** (p 0,01) eller *** (p 0,001).
MCF-7-celler ble dyrket med FAE ved 100 ug /ml verdi for 24, 48 og 72 timer og cellesyklusen fasefordelingen ble bestemt ved PI farging og analysert ved hjelp av BD diva programvare (A). Prosentandelen av cellesyklus faser er vist i histogrammet (B).
FAE Induced Chromatin Kondens og apoptose
Hoechst 33342 farging av MCF-7 celler behandlet med FAE på IC
50 til 24, 36 og 48 timer viste også utseendet av karakteristiske apoptotiske endringer som for eksempel kondensering av kjernefysiske kromatin (figur 3A). FAE apoptose ble ytterligere bekreftet ved Annexin V-FITC /PI dobbel farging. De cellulære forandringer som er involvert i prosessen med apoptose inkludert tap av fosfolipid asymmetri. Ved begynnelsen av apoptose, fosfatidylserin, som normalt finnes på det indre lag av plasmamembranen, blir translokert til utsiden. Den Annexin V-FITC kan binde seg til det eksponerte fosfatidylserin på overflaten av plasmamembranen [24]. Annexin-V-positive /PI-negative celler ble vurdert tidlig apoptotisk, Annexin V-positive og PI-positive celler ble sent apoptotiske eller nekrotiske. Det var ingen vesentlig økning i tidlig eller sen apoptotisk cellepopulasjon på 24 timers behandling med FAE (figur 3B). Men etter 36 timer behandling, prosentandelen av tidlige apoptotiske celler øket til 16,85% sammenlignet med kontroll 3,15%. Etter 48 timer med behandling, økte den totale apoptotiske befolkningen opp til 53,4% (41,4% tidlig apoptotisk og 12% sent apoptotisk, p 0,05; Figur 3C).
(A) Atom endringer knyttet til MCF-7 celler behandlet med IC
50 verdien av FAE etter Hoechst 33342 flekker etter Eclipse E-600 fluorescens mikroskop (400 ×). Antall celler som viser karakteristiske apoptotisk morfologi mitterende lys fluorescens økte på en tidsavhengig måte. (B) FACS-analyse via Annexin V-FITC /PI farging ble anvendt for å observere induksjon av apoptose. Celler i den nedre høyre kvadrant indikere Annexin-positiv /negativ PI, tidlige apoptotiske celler. Cellene i øvre høyre kvadrant indikerer Annexin-positive /PI positiv, sene apoptotiske eller nekrotiske celler. (C) Den prosentandelen av celler som gjennomgår apoptose tidlig og sen sammenlignet med den respektive styre på behandling med FAE i 48 timer, på IC
50 verdi. Hver verdi representerer gjennomsnittet ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. Signifikant forskjell fra kontrollverdi ble angitt med * (p 0,05).
FAE stimulert Translokasjon av Bax-GFP til Mitokondrier og tap av mitokondrie transmembranpotensiale i en tid avhengig måte
Bax er en sterk multi-domene pro-apoptotiske proteiner som finnes i cytoplasma som inaktive monomer i friske celler. Ved apoptotiske stimuli, gjennomgår Bax konformasjonell aktivering som fører til translokasjon til mitokondriene. Flere studier har tidligere innblandet rolle Bax og dens conformational aktivering som tidlig hendelser som bidrar til frigjøring av cytokrom c fra mitokondriene og påfølgende caspaseaktivering i legemiddelindusert iboende apoptose signaliserer [25]. Vi har ansatt en sensitiv celle basert plattform, MCF-7 celler som uttrykker Bax-EGFP (Enhanced grønt fluorescerende protein) og Mito DsRed å oppdage Bax trans til mitokondriene i FAE indusert celledød. For å score aktivitet i stort antall levende celler, ble Pathway Bio kamera brukes med 2 × 2 montasjer som beskrevet [26]. Den representative bilde av MCF-7 Bax EGFP-celler etter behandling med 100 ug /ml FAE ble vist i Figur 4A. Som vist i figur 4B, så tidlig som tre timer ved medikamentell behandling nesten 33,3% celler som viste granulære mitokondrielle mønster i de behandlede celler sammenlignet med ubehandlede celler. Før FAE behandling, Bax-EGFP viste diffust cytosolic mønster indikerer deres monomere status. I senere timer, flertallet av celler viste kornet mønster med massive store Bax oligomerer på mitokondriene (figur 4B). En høy forstørrelse bilde av Bax aggregater i mitokondriene er også vist i figur 4B. Vi har observert en tidlig økt Bax trans i Bax over-uttrykke celler som var i tråd med forrige rapport at over-uttrykk for Bax sensibiliserte celler til døden på grunn av sin iboende pro-apoptotiske aktivitet [27]. Resultatet klart sannsynliggjort at tidlig Bax aktivering spilte en avgjørende rolle i FAE indusert apoptose signalering. Stanse av Bax hjelp siRNA redusert kromatin kondens i FAE behandlede celler i forhold til egge sekvens transfektert celler (figur 4 II og III). Videre hadde vi brukt flere tre brystkreftcellelinjer, MDAMB 231, SKBR3, T47D og to normale diploide celler til å profilere apoptotiske aktivitet av FAE. For å visualisere mitokondriemembranpotensialet og kromatin kondens samtidig,-celler etter behandling med 100 ug /ml FAE i 36 timer ble farget med mitokondriemembranpotensialet spesifikk fargestoff TMRM og nukleær flekk Hoechst 33342 som beskrevet [28]. Som vist i figur 5A har de fleste av de behandlede brystcancerceller viste nedgang i TMRM intensitet som indikerer at mitokondriemembranpotensialet var tapt som godt korrelert med kondensert kromatin. Interessant både humane endotelceller samt menneskelige mammary epitelceller viste mindre TMRM intensitet tap og mindre kromatin kondens enn kreftcellene. Resultatene antydet at FAE indusert celledød i de fleste brystkreftceller med tap av mitokondriemembranpotensialet og kromatin kondens. De normale prolifererende diploide celler var relativt motstandsdyktig mot apoptotisk celledød indusert av FAE. Imidlertid viste de også en forskjell i TMRM fluorescens sammenlignet med ubehandlede celler, noe som indikerer at mitokondriemembranen permeabilitet forandres.
(A) MCF-7-celler som uttrykker EGFP Bax og Mito DsRed ble sådd ut i 96 brønn glassbunn plate (BD, USA) med lav tetthet, og etter 48 timer, behandlet med FAE ved 100 ug /ml. Bildet ble tatt med BD Pathway Bioimager 435 (Becton Dickinson, USA) ved 3, 18 og 27 timer ved å sette Montage (2 x 2) og spesifikk Macro bruker AttoVision ™ programvare. Den grønne granulært aggregat indikerer translokasjon av Bax til mitokondrier, som indikert med pilene. De representative bilder fanget opp ved angitte tidspunkter ble anvendt for å analysere de prosentvise positive celler med Bax EGFP på mitokondrier i forhold til total på feltet. (B) graf som viser prosentandelen av celler som gjennomgår Bax translokasjon inn i mitokondria ved FAE behandling. (C) Den MCF-Bax-DS Røde celler ble behandlet som angitt ovenfor. Bax-EGFP opphopning i mitokondriene er angitt i høye forstørrelse bilder med piler. En forstørret fusjonerte bildet av de behandlede celler er også vist. (D) MCF-7-celler ble transfektert med kontroll (SCR) siRNA eller Bax siRNA. Etter 48 timer med transfeksjon, ble hel-celleekstrakt fremstilt og immunoblottet for Bax og aktin. De samme cellene ble også farget med Hoechst 33342 etter 48 timer med FAE behandling for å visualisere kromatin kondens (venstre panel). Grafen er kvantitativ representasjon av prosentandelen av celler med kondensert kromatin i egge-transfektert og Bax-transfekterte celler etter FAE behandling.
(a) brystkreftceller, MDAMB231, T47D, SKBR3 og normale celler som human bryst Epitelceller og humane endotelceller etter behandling med FAE på 100 ug /ml i 24 timer ble farget med 50 nM av TMRM og 0,5 ug /ml av Hoechst 33342 i 15 minutter. Deretter ble cellene fotografert under fluorescerende mikroskop ved hjelp av DAPI og rhodamin filter sett bruker 40 × objektiv. Bildene ble tatt med Retiga Exi kameraet ved hjelp av NIS element programvare (Nikon). (B) Ac-LEHD-AFC cleavage (caspase 9 aktivitet) (C) Ac-DEVD-AMC cleavage (caspase 3/7 aktivitet). MCF-7-celler ble behandlet ved IC
50 verdi av FAE for 24, 36 og 48 timer. Resultatene ble målt fluorometrisk. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SD av triplikate prøver. Signifikant forskjell fra kontrollverdi ble angitt med * (p 0,05), ** (p 0,01) eller *** (p 0,001). FAE behandling resulterte i en tidsavhengig økning i spalting av Ac-LEHD-AFC (Acetyl-Leu-Glu-His-Asp-7-amino-4-trifluormetyl kumarin) antyder økt aktivitet av Caspase 9 (figur 5B). På 24 h behandling, ingen fremtredende spalting av Ac-DEVD-AMC (substrat for Kaspaser 3/7; Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-metylkumarin) ble observert. Merkbar DEVDase aktivitet skjedde bare på 36 h behandling med FAE. Scale bar representerer 50 mikrometer.
FAE triggerd Aktivering av caspase 9
For å undersøke involvering av Kaspaser i FAE indusert apoptose, aktivitetene til initiator Caspase 9 som (LEHDase) og effektor caspase 7/3 som (DEVDase) aktiviteter ble undersøkt ved fluorometrisk protease analysen. MCF-7-celler ble behandlet med FAE ved IC
50 verdi for 24, 36 og 48 h og kaspase-aktivitet ble bestemt. FAE behandling resulterte i en tidsavhengig økning i spalting av Ac-LEHD-AFC (Acetyl-Leu-Glu-His-Asp-7-amino-4-trifluormetyl kumarin) antyder økt aktivitet av Caspase 9 (figur 5B). På 24 h behandling, ingen fremtredende spalting av Ac-DEVD-AMC (substrat for Kaspaser 3/7; Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-metylkumarin) ble observert. Merkbar DEVDase aktivitet skjedde bare på 36 h behandling med FAE (figur 5C).
FAE Induced caspaseaktivering Live Cell Model of caspaseaktivering
Over Resultatene indikerte at FAE indusert apoptose primært gjennom mitokondriene mediert indre vei involverer Bax mediert mitokondriell permeabilization fulgt av caspase 9 og caspase 3/7 aktivering. Videre, for å underbygge den rollen Kaspaser i FAE indusert celledød, har vi brukt en FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) basert live celle modell som beskrevet tidligere [28] på å overvåke aktivert Kaspaser i levende celler. I korte trekk ble den brystkreftcellelinje som uttrykker den FRET sonden ECFP-DEVD-EYFP (Enhanced cyan Fluorescent Protein- Caspase 3 spalting sekvens Forbedret gul fluorescerende protein) som utsettes for FAE ved 100 ug /ml og avbildes i forholdet modus. Ved Caspase-aktivering, ble det FRET fra donor fluoroforen til akseptor tapt med økning i ECFP og reduksjon i EYFP fluorescens. Som vist i figur 6A, de ubehandlede kontrollcellene, viste en økt akseptor fluorescens enn donor fluorescens som ble reflektert som reduksjon i ECFP /EYFP-forhold (0,04) på grunn av økt energioverføring formidlet akseptor-fluorescens. Imidlertid, i de behandlede brønnene, de fleste cellene viste en øket forhold til 1,005 som indikerer tapet av FRET grunn av caspase-formidlet kløyving av linkeren DEVD plassert mellom donor og akseptor med økning i ECFP og reduksjon i EYFP fluorescens. På slutten av apoptotiske celler med celle merkbar krymping ble betraktet som sterke legemer i bildet med tilstrekkelig ratio endring i forholdet bilde (figur 6A).
(A) MCF-7-celler som uttrykker Caspase FRET prober ble eksponert for 100 ug /ml FAE i 24 timer og 48 timer. De ECFP, EYFP-FRET kanaler og fusjonert bilder for DMSO behandlet og FAE behandlede celler vises. Den ECFP /EYFP forholdet Bildet vises også. Grafen som vises er den kvantitative forholdet endring i DMSO og FAE behandlet døende celler som analyseres i NIS elementer programvare (n = 4). (B) De samme celler som ble farget med TMRM og utsatt for 100 ug /ml FAE og avbildes for TMRM, ECFP, EYFP-FRET i en tidsintervallmodus ved et intervall på 5 minutter som beskrevet. Det fusjonerte bildet av TMRM, ECFP, EYFP-FRET fra tiden lapse bilder for de angitte tidspunkter vises. Den ECFP /EYFP forholdet endring i DMSO og FAE behandlede celler er vist som graf. Grafen viser den kvantitative forholdet mellom endringen i DMSO og FAE-behandlede døende celler (Complete ramme er vist som video S1). (C) Et FRET uttrykkende celler ble behandlet som ovenfor, og avbildnings ble gjennomført som beskrevet i forbindelse med intervaller på 2 minutter. En representant bilde for den angitte tiden vises (Complete ramme er vist som Video S2). (D) De samme celler behandlet med DMSO og avbildes som beskrevet for C. En representant bilde for den angitte tiden vises (Complete ramme er vist som Video S3).
FAE Possessed Sterk fotosensibiliserende Effect
for analyse av fotosensibiliserende effekt av FAE, caspase sensoren uttrykkende celler ble sådd på 8- vel kammer glassbunnplater og farget med mitokondriemembranpotensialet spesifikk fluorescerende fargestoff TMRM (tetrametvl rhodamin metylester), som beskrevet tidligere [28 ]. Cellene ble behandlet med 100 ug /ml FAE og utsatt for kontinuerlig avbildning for TMRM samt donor og akseptor fluorescens ved hjelp av skåret (BD Biosciences) konfokalt mikroskop i 24 timer ved jevne intervall på 5 min. Som vist i figur 6B og video S1, i løpet av 30 minutter av avbildning, cellene mistet TMRM fluorescens indikerer tap av mitokondriemembranpotensialet. Merkbar celletap var tydelig så tidlig som 60 minutter som hurtig fortsatte til fullstendig tap av celler i avbildningsplanet ved 7 timer. Bare en mild endring i ECFP /EYFP forholdet ble lagt merke til i disse cellene indikerer delvis caspaseaktivering (figur 6B). Videre, for å underbygge det fotosensibiliserende rollen FAE har vi redusert eksponeringen intervallet til 2 minutter med kontinuerlig bilde opptil 200 rammer. Interessant, celletap korrelerte godt med rammenummer snarere enn tidspunktet for FAE behandling som underbygger at den sensibiliserende virkning ble sterkt påvirket av eksitasjonslys eksponering i stedet for FAE behandlingsvarighet. De ubehandlede celler eksponert for samme bildeforhold klarte ikke å vise noen endring i forholdet eller celle tap i opptil 24 timer av bilde validere at effekten observert ble forårsaket av FAE (figurene 6B, C, D og videoer S2, S3). Cellene også beholdt TMRM fluorescens indikerer vedlikehold av mitokondriemembranen potensialet i hele bildebehandling perioden. Totalt sett, bekreftet resultatene at FAE besatt fotosensibiliserende effekt som var assosiert med rask tap av mitokondrie transmembrane potensial og delvis caspaseaktivering.
FAE Mediert Uttrykk av apoptotisk Regulators
Inorder å underbygge viktigheten av caspase kaskade bak induksjon av apoptose, analyserte vi spaltingen av viktige Kaspaser som Caspase 8, Caspase 7, caspase 9 og også PARP (Poly (ADP-ribose) polymerase) i MCF-7, T47D og MCF10A. Som vist i figur 7A, FAE behandling på 80 og 160 ug /ml indusert spaltning av caspase 8, Caspase 7 og caspase 9 i MCF-7, så vel som i T47D. Spalting av PARP ble også observert i disse cellene. Men i MCF10A, bare en mild spaltning var tydelig både for Kaspaser og PARP.
(A) MCF-7-celler ble behandlet med FAE (80, 160 ug /ml) i 48 timer og høstet. Immunoblot ble utført i hel celleekstrakt ved hjelp av de angitte antistoffer. Den tilsvarende full-lengde og spaltede fragmenter er angitt. For PARP blot ble celler behandlet med 160 ug /ml FAE i 48 timer. (B) MCF-7 og T47D-celler ble behandlet med 100 ug /ml FAE i 24 timer. FAE indusert ROS generasjon i MCF-7 samt T47D celler enn DMSO-kontroll som indikert ved økningen i DCF-DA fluorescens i behandlede celler. (C) MCF-7 og T47D-celler ble behandlet med 100 ug /ml FAE alene og etter forbehandling med NAC i et tidsrom på 24 timer. Som vist, forbehandling av celler med antioksidanten NAC reduserte celledød indusert av FAE. Andel av celler med kondensert kromatin for hver gruppe er vist som graf (N = 3)
FAE -. Celledød Involvert Generering av ROS
De tidligere resultatene indikerte at i de fleste av cellelinjene som ble brukt, kunne FAE utløse tap av mitokondriemembranintegritet og kondensering av kromatin eventuelt gjennom Bax avhengig måte. Videre på levende celle bildebehandling vi har uhell observert fotosensibiliserende effekt for FAE trekke i MCF-7 celle uttrykker caspase sensor sonde med akselerert tap av mitokondriemembranen potensial. Tidligere ble det rapportert at de fleste fotosensibiliserende indusert celledød gjennom generering av ROS [29], en av de fremste triggere for Bax conformational aktivering. Derfor hadde vi analyserte ROS etter behandling av cellene med 100 ug /ml FAE i 24 timer ved FACS. Som vist i figur 7 B, FAE indusert ROS generasjon i MCF-7 samt T47D celler som indikert ved økningen i 2 «, 7»-dichlorodihydrofluorescein diacetat (H
2-DCF-DA) fluorescens i behandlede celler enn kontroll . Forbehandling av celler med antioksidanten N-acetylcystein (NAC) reduserte celledød indusert av FAE som vist i resultatene av kromatin kondensasjonsproduktene (figur 7 C). Det igjen validert den generasjonen av ROS i cellene ble den primære trigger for apoptotisk celledød, og som kan bidra for sin fotosensibiliserende aktivitet.
Diskusjoner
naturprodukt ekstrakter har vært mye testet i den farmasøytiske bransjen og har vært ansett som en verdifull kilde til nye legemidler [30]. Som et middel til å identifisere kreftlegemidler, har det motsatte farmakologi, eller den «sengen» til «benk» tilnærming blitt utforsket som innebærer å studere medisinplanter som har vært tradisjonelt brukt til å behandle ulike plager. Ulike studier viser at
Ficus
arter er mye brukt i behandling av ulike typer sykdommer som luftveislidelser, seksuelle forstyrrelser, forstyrrelser i sentralnervesystemet (CNS), hjerte- og karsykdommer (CVS), mageproblemer, hudinfeksjoner og diabetes osv [31], [6]. De fleste av de farmakologiske studier ble rettet på å validere sin tradisjonelle bruk [32]. Selv om moderne drug design vektlegger utvikling av enkle midler med spesifikke mål, til det faktum at hele ekstrakt har vist seg å være mer effektiv enn de enkelte komponenter (et konsept som kalles urte synergi) tyder på begrensningene ved denne tilnærmingen [3]. Drap av kreftceller gjennom induksjon av apoptose er nå anerkjent som en strategi for å identifisere kreftmedisiner [33]. I den foreliggende rapporten, søkte vi å finne mekanismer som aceton brøkdel av
F.religiosa
blad ekstrakt utøver sin anti-proliferativ effekt i flere brystkreftceller.
Anti-proliferativ effekt
