Abstract
microRNAs (mirnas) er små ikke-kodende RNA med regulatoriske roller, som er involvert i et bredt spekter av fysiologiske og patologiske prosesser, inkludert kreft. En vanlig strategi for identifisering av mirnas som er involvert i celle-transformasjon er å sammenligne maligne celler til normale celler. Her har vi fokus på identifisering av miRNAs som regulerer aggressive fenotype av melanom celler. For å unngå forskjeller på grunn av genetisk bakgrunn, ble en komparativ høy gjennomstrømming miRNA profilering utføres på to isogene humane melanoma cellelinjer som viser store forskjeller i netto spredning, invasjon og tube dannelse aktiviteter. Dette screening avdekket to store årskull av forskjellig uttrykt miRNAs. Vi spekulert i at mirnas oppregulert i mer aggressive cellelinje bidra onkogene egenskaper, mens nedregulert mirnas er svulst undertrykkende. Denne antakelsen ble videre testet eksperimentelt på fem kandidat kreft undertrykkende mirnas (MIR-31, -34a, -184, -185 og -204) og på en kandidat onkogene miRNA (MIR-17-5p), som alle har aldri blitt rapportert før i kutant melanom. Bemerkelsesverdig, alt kandidat undertrykkende-mirnas hemmet netto spredning, invasjon eller tube-formasjonen, mens MIR-17-5p forbedret celleproliferasjon. MIR-34a og MIR-185 ble videre vist å hemme veksten av melanoma-xenografter når implantert i SCID-NOD-mus. Til slutt ble alle seks kandidat mirnas påvist i 15 ulike metastatisk melanom prøver, attesterer for fysiologiske betydningen av våre funn. Samlet kan disse funnene bevise instrumental for å forstå mekanismer for sykdom og for utvikling av nye terapeutiske og staging teknologier for melanom
Citation. Greenberg E, Hershkovitz L, Itzhaki O, Hajdu S, Nemlich Y, Ortenberg R, et al. (2011) Regulering av Kreft Aggressive funksjoner i melanomceller ved microRNAs. PLoS ONE 6 (4): e18936. doi: 10,1371 /journal.pone.0018936
Redaktør: Donald Gullberg, Universitetet i Bergen, Norge
mottatt: 6 desember 2010; Godkjent: 13 mars 2011; Publisert: 25 april 2011
Copyright: © 2011 Greenberg et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Gal Markel er støttet av Recanati Foundation for medisinsk forskningsetikk (# 6713). Noam Shomron støttes av Chief Scientist kontor, Helsedepartementet, Israel (# 3-4876); Den Kurz-Lion Foundation; Tel-Aviv University, Det medisinske fakultet, Schreiber Foundation; og The Wolfson Family Charitable Fund. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
melanom, en aggressiv kreft som oppstår fra melanocytter, er en av de viktigste livstruende kreftsykdom som i vår tid. Selv om det står for nesten 4% av alle tilfeller av hudkreft, fører det til 75% av hud kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis, og regnes for å være den vanligste dødelige malignitet av unge voksne [1]. Transformasjon og utvikling av metastaser krever trinnvis oppkjøp av aggressive egenskaper. Disse inkluderer, for eksempel, ukontrollert vekst, resistens mot apoptose, motilitet, proteolytisk kapasitet og adhesjon (oversikt i [2], [3]). I tillegg er plastisitet melanomceller tydelig ved deres evne til å danne rørlign [4]. Disse funksjonelle vaskulære-lignende strukturer består av tumorceller [5], og deres tilstedeværelse er assosiert med dårlig prognose [6], [7]. Siste utvikling av målrettet terapi for melanom understreker viktigheten av molekylær avbildning av de underliggende mekanismene for patogenesen [8].
microRNAs (mirnas) er små, ikke-koding, 19-22 nukleotid lange RNA-molekyler, som funksjon som spesifikke epigenetiske regulatorer av genekspresjon ved å hemme protein translasjon, som fører til mRNA degradering, eller begge deler [9], [10]. Etter behandling fra sine særegne hårnål transkripsjoner og lastet inn i argonaute protein av taushet komplekse, til mirnas par med cytoplasmatiske mRNA direkte posttranskripsjonelt undertrykkelse. Den «seed» region, som er funnet mellom nukleotidene 2 og 8 i det modne miRNA, bindes til komplementære regioner i den 3 «un-translatert region (3»-UTR) av mål-mRNA. Til dags dato, i nærheten av 1000 humane mirnas er blitt identifisert [11], som er tenkt å regulere på mer enn 50% av humane gener [12].
mirnas er involvert i reguleringen av mange biologiske prosesser, f.eks som embryoutvikling, celledifferensiering, cellesyklus, apoptose og angiogenese (oversikt i [13]). De er også direkte involvert i kreftutvikling, progresjon og metastaser
in vitro
,
in vivo Hotell og rapportert selv hos pasienter [10], [14]. I noen tilfeller er kreft tilrettelagt av tap av visse mirnas som MIR-15/16 klyngen i kronisk lymfatisk leukemi [15], MIR-34a i uveal melanom [16] og Mir-31 i mesothelioma [17]. Tapet av disse miRNAs forbedrer invasivitet, migrasjon og spredning av kreftceller. I andre tilfeller blir kreft tilrettelagt av over-ekspresjon av andre mirnas, slik som MIR-17-92 klynge [13], [18], som fremmer migrering og invasjon i flere ondartede sykdommer.
For tiden er vår kunnskap om rollene til mirnas i melanom utvikling og progresjon er fortsatt begrenset. Nylig har flere komparative miRNA profilering studier av normale melanocytter og melanomceller avslørt: 1) Grupper av mirnas assosiert med malign transformasjon, progresjon og metastatisk potensial [19]; 2) Konkrete uttrykk profiler som var knyttet til mutasjonsstatus og overlevelse [20]; 3) Differensial miRNA mønstre i melanom av unge voksne og eldre voksne [21]; og 4) Prediksjon av post-gjentakelse overlevelse [22]. Men ingen av disse studiene beskrevet mirnas som direkte bestemmer aggressive trekk av kutan melanom, som forbedret spredning, motilitet og invasjon. Få hemmende mirnas ble identifisert i melanom, inkludert MIR-34a (uveal melanom) [16], MIR-193b [23], la-7a [24], og MIR-211 [25], [26], mens MIR-182 [27] og MIR-221/222 [28] ble vist å stimulere metastatisk potensial på melanomceller. Gitt kritisk vurdering av aggressive versus ikke aggressiv melanom, og potensialet for legemiddelselskap, finner vi det viktig å lære de molekylære hendelsene aggressiv melanom.
Her har vi fokus på high-throughput identifikasjon av miRNAs som er direkte involvert i fastsettelse av en aggressiv melanom celle fenotype. To isogene melanomcellelinjer med en annen aggressiv mønster, de svært aggressive C8161 celler og dårlig aggressive C81-61 celler, ble utsatt for forskjells high-throughput screening av miRNAs. Vi antok at på grunn av isogene bakgrunn av cellene, vil de differensielt uttrykte miRNA grupper bli anriket for mirnas med en direkte effekt på aggressive melanom egenskaper. Faktisk gir vi eksperimentelle bevis
in vitro
,
in vivo Hotell og i kliniske melanom prøver som tidligere kjente tumor-undertrykkende og tumor-fremme mirnas passer denne hypotesen. Bemerkelsesverdig, beskriver vi nye mirnas med lite informasjon om deres rolle i kreft, for eksempel MIR-185. De vitenskapelige og translasjonsforskning implikasjonene av denne studien blir diskutert.
Resultater
Differensial aggressivitet melanom isogen cellelinjer
Den svært aggressive (HAG) C8161 og dårlig aggressiv (PAG) C81-61 kutane melanomcellelinjer ble avledet fra forskjellige metastaser fra samme pasient [29]. Differensial aggressive fenotype av HÅG og PAG celler ble bekreftet av fire ulike funksjonelle analyser: spredning, invasjon gjennom Matrigel, tube-formasjonen i matrigel og dannelse av svulster i xenopodet mus. Faktisk HAG celler viste betydelig høyere spredning, invasjon og tube dannelse evner
in vitro
, enn PAG celler (figur 1, A-C). Videre subkutan injeksjon av 1 x 10
6 HAG celler dannet tumorer i SCID-NOD-mus i løpet av fem dager etter injeksjon, med en gjennomsnittlig xenograft størrelse på 780 mm
3 etter dag 30. I motsetning til dette injeksjon av 1 x 10
6 PAG celler ikke utvikle seg til målbare svulster innen 30 dager (figur 1D). Små svulster PAG (rundt 200 mm
3) ble observert 90 dager etter injeksjon av PAG-celler (data ikke vist)
(A) Proliferasjon ble bestemt med standardisert XTT-kolorimetrisk analyse 24 timer etter såing. . Antallet HAG-celler ble bestemt som 100%. Figuren viser et representativt eksperiment av tre utført; (B) Den prosentandelen av invaderende celler ble testet i en 20 timers matrigel invasjon assay. Resultatene ble korrigert for spredning rate. Figuren viser et representativt eksperiment av tre utført; (C) HAG celler eller PAG-celler ble testet for rør formasjon aktivitet. Representative mikrofotografier hele feltet er vist fra et representativt eksperiment, av tre utførte; (D) De gjennomsnittlige tumormasser dannet i SCID-NOD-mus 30 dager etter injeksjon av 1 x 10
6 celler i HÅG eller PAG cellelinjer. Hver gruppe inkluderte minst seks mus.
Differensial uttrykk profilen til mirnas blant HAG og PAG celler
Den bemerkelsesverdige fenotypiske forskjellen mellom de to isogene melanom linjer omfattet plattform for å studere epigenetisk regulering av aggressive trekk av miRNAs. En sammenlignende high-throughput profilering av miRNAs ble utført. Viktigere, ble et sett av 81 mirnas uttrykt ved høyere nivåer i HAG i forhold til PAG-celler (HAG
høy). Et annet sett av 69 miRNAs ble uttrykt på lavere nivåer i HAG i forhold til PAG-celler (HAG
lav). En gruppe på 48 mirnas ut av de 81 HAG
høye mirnas ble ikke uttrykt i det hele tatt i PAG celler (Figur 2A), mens 56 mirnas av de 69 HAG
lave mirnas ikke ble påvist i HAG celler (Figur 2B). Resten av forskjellig uttrykt mirnas ble funnet i begge cellelinjer på ulike, målbare, mengder (Figur 2C). Vi antok at disse miRNA klyngene ville bli anriket for mirnas som er involvert i direkte regulering av distinkte fenotypiske forskjeller. Mer spesifikt spekulert vi at HÅG
lave mirnas vil bli beriket i mirnas regnskap for undertrykkende effekter på ulike cellefunksjoner f.eks spredning (Undertrykkende mirnas), mens HÅG
høye mirnas vil bli beriket i mirnas med onkogene eller kreftfremmende effekter (onkogene mirnas) (figur 2).
(A) Listen over miRNAs som er uttrykt i HAG celler, men ikke i PAG celler; (B) Listen over mirnas som kommer til uttrykk i PAG celler, men ikke i HÅG celler; (C) Relativ ekspresjon av mirnas som er uttrykt i både HAG og PAG-celler. Uttrykk for HAG-til-PAG ratio (Y-aksen) er vist som 2∧-ΔΔCt. HAG
lav representerer mirnas med lav HAG til PAG-forhold. HAG
høy representerer mirnas med høy HAG til PAG-forhold.
Valg av miRNAs for spesifikke funksjonelle analyser
Vi fokuserer hovedsaklig på HAG
lave miRNAs, som er antagelig tumor-undertrykkende og kan gi grunnlag for nye linjer av terapi for melanom. mirnas med tumor-undertrykkende potensial ble analysert for forventede mål med TargetScan algoritme [30] og for de berørte biologiske prosesser med Miranda (miRpath) algoritme [31]. Alle de potensielt berørte biologiske prosesser ble rangert i forhold til den totale P-verdi, med en cut-off på 0,01. Videre fokus på robuste prosesser ble aktivert ved å velge biologiske prosesser som inkluderte minst 30 kandidat målgener. Bemerkelsesverdig, disse beregningsmåten fremhevet fire biologiske prosesser som er svært involvert i kreft, inkludert Wnt pathway (82 gener, P = 1,7 × 10
-9), brennvidde heft (100 gener, P = 8,6 × 10
– 9), MAPK pathway (120 gener, P = 2 × 10
-7) og fosfatidylinositol pathway (35 gener, P = 7,2 × 10
-3). Tjueni av miRNAs ble spådd å målrette alle fire prosesser, med bare 12 som har blitt rapportert å eksperimentelt utøve en undertrykkende effekt på noen kreft.
Til sammen fem kandidat undertrykkende mirnas, som aldri har blitt studert i melanom, ble valgt ut for kloning og eksperimentelle prøver. Tre mirnas var innenfor uttrykk rekkevidde (MIR-34a, MIR-185 og MIR-204, figur 2C) og to som ble brakt til taushet (MIR-31 og MIR-184, figur 2B) i HÅG celler. MIR-17 ble valgt som et eksempel for kandidat onkogene miRNA (figur 2C). Den differensielle ekspresjonen av hver av disse mirnas ble validert i to uavhengige preparater RNA (data ikke vist). Ulike roller MIR-17, MIR-31 og MIR-34a i kreft har blitt rapportert før, men aldri i kutant melanom. I kontrast, er det knappe bevis på rollene til mirnas -184, -185 og -204 i kreft. Forbilde spådd roller i biologiske og molekylære funksjoner vedrørende disse mirnas er oppsummert i Tilleggs Tabell S1 [32].
Expression profil av utvalgte miRNAs i kliniske melanom prøver
Femten pasient avledet primærkulturer av melanom ble analysert for uttrykket nivået av de valgte miRNAs. Alle melanom kulturer ble etablert fra fjernmetastaser. Ytterligere data om pasientene er gitt i Utfyllende Tabell S2. Som forventet ble det en betydelig variasjon i miRNA uttrykket observert blant de individuelle prøver, hovedsakelig av MIR-31 (figur 3). Gjennomsnittlig uttrykk nivået mest kandidat Undertrykkende mirnas i kliniske prøver var mellom de tilsvarende miRNA verdiene i PAG og HÅG celler, med unntak av MIR-185 og MIR-31. Mens den gjennomsnittlige nivået av MIR-185 var svært nær PAG celler, MIR-31 nivåene var klart høyere enn selv PAG celler (figur 3). I motsetning til dette, var gjennomsnittlig ekspresjon av kandidaten onkogene MIR-17 blant de kliniske prøver var enda høyere enn i HAG-celler (figur 3). De miRNA uttrykk mønstre i kliniske prøver direkte viser at de fleste kandidat undertrykkende mirnas, med unntak av MIR-31, kommer til uttrykk på betydelig lavere nivåer enn kandidaten onkogene MIR-17 (figur 3). Disse resultatene stemmer overens med vår hypotese og foreslå at tilnærmingen brukes til å identifisere funksjonelle undertrykkende og onkogene mirnas har fysiologisk-relevante grunner.
uttrykk for kandidaten undertrykkende eller onkogene mirnas, som indikert i HAG (stripete barer), PAG (grå søyler) og 15 lav-passasje primærkulturer av metastatisk melanom (svarte søyler). Horisontal linje viser gjennomsnittet uttrykk. Y-aksen angir absolutte uttrykk for hver miRNA etter normalisering til U6 endogen kontroll i hver prøve, og presenteres som en /ΔCt.
Regulering av aggressiv fenotype av melanomceller ved kandidat undertrykkende mirnas
Fastsettelse av miRNAs som hemmer aggressive fenotype av melanom kan bli et grunnlag for utvikling av nye plattformer for kreftbehandling. For å evaluere den funksjonelle virkningen av kandidaten undertrykkende mirnas på de aggressive trekk ved melanom, vi klonet og stabilt over-uttrykt dem i HAG celler for å evaluere deres effekt in-vitro og in-vivo. En tom vektor tjente som kontroll. En over-ekspresjon av minst 50 ganger ble bekreftet ved sanntids-PCR (figur 4A). Fenotypen av de omsatte cellene ble testet
in vitro
for spredning, invasjon og tube dannelse aktiviteter. Bemerkelsesverdig, ble en betydelig og konsistent inhibering i netto proliferasjon gitt av MIR-31, MIR-34a, MIR-184 og MIR-185 sammenlignet med kontrollcellen (figur 4B). MIR-204 inhiberte ikke proliferasjonen av HAG-celler (Figur 4B). I kontrast, MIR-204 markert hemmet invasjonen aktiviteten HAG celler (Figur 4C). Invasjonen ble tilsvarende hemmet av MIR-184, men ikke av den andre undertrykkende mirnas (Figur 4C).
(A) Verifikasjon av over-uttrykk for miRNAs i HAG Transduktantene, sammenlignet med mock-transduced celler. Y-aksen betegner ganger endring ovenfor Mock-transduced celler. (B) Netto spredning av Transduktantene ble kvantifisert med standardisert XTT test. Antallet celler ble bestemt 48 timer etter utsåing. Antallet Mock-Transduktantene ble bestemt som 100%. Figuren viser et representativt eksperiment av tre utført. (C) invasjon aktivitet av transduktanter ble kvantifisert med 20 h-matrigel invasjon assay, med korreksjon for spredning. Invasjonen frekvensen av Mock-transduserte celler ble bestemt som 100%. Figuren viser et representativt eksperiment ut av tre utført. * Angir P 0,05, ** betegner P 0,01 (2-tailed
t-test
)
Tube formasjon aktivitet ble betydelig hemmet av MIR-34a og MIR-185. , og mer mildt ved MIR-31 og MIR-184, men ikke ved MIR-204, sammenlignet med kontroll (figur 5, A-F). Kvantifisering av total rørlengde ble utført ved anvendelse ImageJ. Viktigere, kvalitativ vurdering av hhv fanger (Figur 5, A-F) enig med den kvantitative total lengde analyse (Figur 5G). De differensielle effekter av mirnas kan ikke bare tilskrives deres differensielle over-ekspresjon intensiteter (Figur 4A). Nesten alle celler var levedyktige ved måling, slik det fremgår av mindre enn 5% positive trypanblått-farving (data ikke vist)
Tube dannelsen evne transduktanter ble testet i 3D-kultur, 24 timer etter såing.. Hvert eksperiment ble utført på triplikate brønner. (A) Et representativt mikrofotografi av en 3D-kultur av Mock-transduserte HAG celler; (B-F) Representative mikrofotografier av miRNA-transduced HAG celler, som vist på bildene. Alle bildene ble tatt i henhold × 40 forstørrelse. Alle bilder (A-F) ble avledet fra den samme representativt eksperiment er vist, ut av tre utført. (G) Tube formasjonen ble kvantifisert ved hjelp av ImageJ analysere skjelettet plugin. Figuren viser den midlere lengde beregnet for hver transductant ut av alle mikrofotografier tatt i alle tre eksperimenter utført. * Angir P 0,05, ** betegner P 0,01 (2-tailed
t-test
)
Til sammen alle fem kandidat undertrykkende mirnas faktisk utøves betydelig hemmende effekt på. forskjellige aggressive trekk ved melanom celler. Dette samsvarer med deres betydelig nedregulering i HÅG celler (figur 2) og deres generelle lave uttrykk i kliniske prøver (figur 3). Dette styrker også vår høy gjennomstrømming miRNA screening og understreker sin pålitelighet.
Tilrettelegging av aggressiv fenotype av melanomceller ved kandidat onkogene miRNA
Siden miRNA 17-92 klynger «funksjonell rolle i kreft er godt etablert, men aldri har det blitt testet i kutant melanom, evaluert vi MIR-17 for dens effekt på aggressivitet PAG celler. MIR-17 ble klonet og stabilt over-uttrykt i PAG cellene. En tom vektor tjente som kontroll. En 25-fold over-uttrykk for MIR-17 ble bekreftet av Real Time PCR (figur 6A). Viktigere, MIR-17-transduserte PAG-celler viste en betydelig forbedret proliferativ aktivitet (figur 6B), men ikke invasiv evne (figur 6C) eller rør dannelse aktivitet (data ikke vist). Disse resultatene støtter de potensielt onkogene effekter av MIR-17 i melanoma.
(A) Verifikasjon av MIR-17-5p over-uttrykk i PAG Transduktantene, sammenlignet med mock-transduced celler. Y-aksen betegner ganger endring ovenfor Mock-transduced celler. (B) Netto spredning av PAG Transduktantene ble kvantifisert med standardisert XTT test. Antallet celler ble bestemt 48 timer etter utsåing. Antallet Mock-Transduktantene ble bestemt som 100%. Figuren viser et representativt eksperiment ut av tre utført. (C) Invasion aktivitet av PAG Transduktantene ble kvantifisert med 20 h-matrigel invasjon analysen, med korreksjon for spredning. Y-aksen angir den prosentandel av invaderte celler. Figuren viser et representativt eksperiment av tre utført. ** Betegner P. 0,01 (2-tailed
t-test
)
miRNA-mediert regulering av aggressive melanom funksjoner
in vivo
i kreft biologi,
in vitro
resultatene ofte reflekterer ikke nødvendigvis
in vivo
atferd. For å oppnå dette, ble effekten av utvalgte undertrykkende mirnas videre vurderes
in vivo
i melanom xenograft modeller. Effekten av undertrykkende miRNAs, MIR-34a og MIR-185 på tumorvekst ble målt etter subkutan injeksjon av 3 × 10
5 HAG Transduktantene. Tumormasser ble overvåket i 28 dager etter injeksjon. Over-ekspresjon av spesifikke mirnas ble bekreftet pre-injeksjon (data ikke vist). Viktigere var det en statistisk signifikant hemming i tumorvekst observert i både MIR-34a og MIR-185 transducatnts, sammenlignet med kontroll tumorer (figur 7A). Slutter seg til disse resultatene,
ex-vivo
veiing av tumor explants ved avslutning av eksperimentene bekreftet at den gjennomsnittlige tumormasse av både MIR-34a og MIR-185 transducatnts var lavere enn Mock-transduced tumorer (figur 7B) .
in vivo
over-uttrykk for de omsatte miRNAs ble bekreftet i tumor explants (figur 7C). Disse resultatene underbygge med uttrykket resultater og funksjonelle undertrykkende effekter demonstrerte
in vitro plakater (Figur 4-5).
(A) Overvåking av tumorvekst i SCID-NOD mus. Hver gruppe besto av syv mus. En representant eksperiment av fire utført vises. Statistisk signifikans ble testet med to-tailed-paret
t-test
; (B) Gjennomsnittlig vekt av svulster eksplanterte ved avslutning av forsøket. Statistisk signifikans ble testet med to-tailed
t-test
; (C) Over uttrykk for omsatte miRNAs ble bekreftet ved avslutning av forsøket i alle svulster med qPCR. * Angir P. 0,05
Diskusjoner
Opp til nå, de fleste forsøk på karakter roller mirnas i kreft generelt eller melanom i særdeleshet, har fokusert på differensial profilering av normal celler sammenlignet med deres motstykke maligne celler [19], [20]. Denne tilnærmingen gjorde det mulig å identifisere mirnas som deltar i prosessen med malign transformasjon. Her fokuserer vi på identifisering av miRNAs som direkte regulerer kreft aggressive trekk melanomceller. Målet med denne tilnærmingen var å kartlegge mirnas som kan være involvert mekanistisk i ulike sykdoms fenotyper og til slutt avgrense sin regulerende rolle av aggressive kreft funksjoner. Vi brukte to isogene passet melanomcellelinjer som var avledet fra to forskjellige metastaser fra den samme pasient. Disse cellelinjene signifikant forskjellige i sine invasive, proliferative og tumorigene egenskaper (figur 1). På grunn av den felles genetisk bakgrunn av cellene, vår begrunnelsen var at differensial uttrykk for miRNAs ville korrelerer godt med sine differensial aggressive fenotype.
High-throughput screening avdekket en stor kohort av forskjellig uttrykt mirnas mellom høyt (HAG ) og dårlig (PAG) -aggressive melanomcellelinjer (figur 2). Vi antok at HÅG
lave mirnas er undertrykkende og at HAG
høye mirnas er onkogene. Faktisk, vi gir betydelige bevis som støtter vår hypotese, ved ektopisk uttrykk for fem utvalgte HAG
lave mirnas i HAG celler (figurene 4, 5, 7) og en HAG
høy miRNA i PAG-celler, som en representant for denne gruppe (figur 6). Dette er den første rapporten for å kunne demonstrere en systematisk tilnærming for en metodisk identifisering av miRNAs som direkte regulerer aggressiv kreft egenskaper. Det vell av identifiserte mirnas som regulerer funksjonene melanoma celle aggressivitet støtter bruken av isogene cellelinjer med differensial fenotype som en screening plattform.
uttrykk for disse miRNAs ble validert i 15 lav-passasje primærkulturer, med bety nivå av MIR-17 som er høyere enn den til den undertrykkende Mirs, noe som bekrefter den fysiologiske relevansen (figur 3). Uttrykket av disse miRNAs bør videre studert i fremtiden i progresjon microarray, og deres prognostiske verdi testet tilsvarende.
I dette arbeidet har vi fokusert på en gruppe enten godt karakteriserte mirnas kjent for å ha en rolle i andre kreftformer (MIR-17, MIR-31 og MIR-34a), og på en annen gruppe av relativt unstudied mirnas med hensyn til deres rolle i maligne prosesser (MIR-184, MIR-185, MIR-204). Bemerkelsesverdig, rollene til alle disse miRNAs har aldri blitt beskrevet i kutant melanom.
MIR-31 ble rapportert å utøve hemmende effekt på metastaser ved brystkreft [33], [34] og i mesothelioma [17] , mens den har et potensial onkogen rolle i som hode og nakke plateepitelkarsinom og lungekreft [35], [36]. MIR-34a ble konsekvent rapportert som en undertrykkende miRNA i mange kreftformer [37]. Våre resultater stemmer overens med det foreslåtte hemmende rolle for MIR-34a og MIR-31. Dessuten har MIR-34a er tidligere blitt rapportert å målrette c-Met [16]. Siden c-Met har blitt rapportert til å delta i tubulogenesis prosesser gjennom c-Met /HGF system [38], er det fristende å spekulere i at den mekanismen som MIR-34a hemmer tube formasjonen er via dette genet. De onkogene egenskaper MIR-17-5p ble diskutert i tidligere publikasjoner i andre kreftformer [13]. Etter avtale med disse rapportene, ektopisk uttrykk for MIR-17-5p i PAG celler forbedret spredning rate (Figur 6B).
I kontrast, er svært lite kjent om MIR-184, MIR-185 og speil 204 i kreft. De fleste aktuelle studier på MIR-184 og MIR-204 fokus på sine roller i utvikling og morphogenesis, som kan forutsies beregnings (Supplementary Tabell S1). De få publikasjoner om MIR-184 i kreft viste motstridende effekter, enten undertrykkende [39] eller onkogene [40]. En enkelt rapport viste at MIR-204 hemmet metastaser i hode og nakke plateepitelkarsinom [41]. En annen rapport beskrevet nedregulering av MIR-204 i meget inngripende melanom sub-line i forhold til sin ikke-invasiv isogen motstykke [19], og støtter våre funn om invasjonen-hemmende aktivitet av MIR-204 (fig. 4C). MIR-185 er fortsatt hovedsakelig unstudied, men nylig ble det vist å utøve undertrykkende effekt i flere kreftformer gjennom målretting Six1 onkogen [42], [43]. Fremtiden Utfordringen vil være å avgrense målet genet nettverk av disse mirnas og forstå det molekylære grunnlaget for deres tumor-undertrykkende rolle.
Effekten av hver enkelt miRNA kan ikke tilsynelatende identiske mellom
in-vitro Hotell og
in vivo
oppsett. For eksempel, mens mirnas-34a og -185 utstilt sterke anti-proliferative effekter
in vitro plakater (figur 4B), de påvirkes mye mer moderat tumorvekst
in vivo plakater (Figur 7A ). Dette kan tilskrives en stor forskjell i uttrykk intensitet mellom
in vitro Hotell og
in vivo
innstillinger (Figur 4A og 7C). Likevel er
in vivo
eksperimenter tyder på at selv om over-uttrykk nivået er relativt svak (figur 7C), en eksperimentell utfall som tar hensyn til flere biologiske prosesser, slik som tumorvekst, fortsatt kan gjenspeile undertrykkende effekt av over-uttrykte miRNA (figur 7). Videre disse eksperimentene forenkle muligheten for kombinatoriske regulatoriske virkningene av ulike mirnas, som kan arbeide enten på konsert eller forstyrrelser [44]. Således kan en koordinert nedregulering og oppregulering av mirnas forme en bestemt fenotype, selv når de endringer i hvert miRNA ekspresjonsnivået ikke er ekstreme. Faktisk har vi observert flere direkte og inverse statistiske sammenhenger mellom testet undertrykkende mirnas i de kliniske melanom prøver, noe som kan tyde på synergi eller antagonistisk effekt blant dem (data ikke vist). Utfallet av samspillet mellom de ulike undertrykkende mirnas bør undersøkes nærmere for å utdype vår forståelse av fenotype utformingen av kombinatoriske miRNA mønstre, og siden synergis hemmende kombinasjoner kan gi en solid ledelse for innovativ behandling.
I konklusjonen, dette er den første rapporten som demonstrert en systematisk tilnærming for identifikasjon av miRNAs som direkte regulerer aggressiv kreft egenskaper. Vi beskrev seks mirnas bidrar til aggressiv fenotype av kutan melanom både
in vitro Hotell og
in vivo
, og knyttet disse observasjonene til kliniske prøver. Identifisering av mirnas som former aggressiv fenotype av sykdommen kan føre til utvikling av innovative fremtidig behandling og molekylstillaskonstruksjoner. Nyere publikasjoner viste muligheten for målretting eksperimentelle melanom metastaser ved hjelp av nanopartikler som frakter MIR-34a [45] eller et syntetisk miRNA agonist [46].
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle dyr arbeid i mus ble utført etter godkjenning av en Institutional Review Board of Sheba Medical Center (562/2010). Alle kliniske prøver fra pasienter, som melanom kulturer var etablere, ble oppnådd etter godkjennelsen av den etiske komiteen av Israel Ministry of Health (IMoH godkjenning nr 3518/2004). Alle pasienter har frivillig undertegnet på et informert samtykkeskjema
Cells
De to isogene menneskelige kutane melanomcellelinjer C8161 celler. (Meget aggressiv – HAG) og dårlig aggressiv C81-61 (Dårlig aggressiv – PAG) [29] ble vennlig levert av Dr Mary Hendrix (Barnas Memorial Research Center, Chicago, USA). Disse cellelinjer ble avledet fra to forskjellige metastaser fra den samme pasient. Primære melanom kulturer ble utviklet fra kirurgisk fjernet metastatisk melanom lesjoner (IMoH Godkjenning nr 3518/2004) og ble dyrket som beskrevet tidligere [47]. PAG-celler ble dyrket i Hams F10 medium supplement med 15% FBS, Pen /Strep og 1 x MITO + (BD Biosciences). Normal human epidermal Melanocytter ble opprettholdt i et serumfritt unikt medium (PromoCell). 293T celler (ATCC) ble opprettholdt i DMEM (Gibco /Invitrogen) inneholder 10% FBS (DMEM /FBS).
miRNA uttrykket analyse
Total RNA ble isolert ved hjelp av Mirvana miRNA Isolation Kit ( Ambion). Høy throughput screening av miRNA ble utført av real time PCR ved hjelp TLDA format TaqMan mikroRNA kits (Applied Biosystems). Uttrykket av spesifikke miRNAs og U6 RNA (som endogen kontroll) ble utført etter revers transkripsjon fra 200 nt RNA fraksjoner, ved hjelp av TaqMan mikroRNA kits (Applied Biosystems). Stenge nivåer for betydning ble bestemt som minst fire ganger forholdet mellom testede prøver og syklus 36 som grense for uttrykket rekkevidde, basert på vår forrige evaluering av denne teknologien.
