Abstract
Det er velkjent at hypoksi-induserbar faktor en alfa (HIF-1α) er involvert i kreftmetastaser, kjemoterapi og dårlig prognose. Vi har tidligere funnet at deferoxamine, en hypoksi-mimetiske middel, induserer epitelial-mesenchymale overgang (EMT) i tykktarmskreft. Derfor, her vi utforsket en ny molekylære mekanismen for HIF-1α bidra til EMT og kreft metastasering gjennom binding til ZEB1. I denne studien viste vi at overekspresjon av HIF-1α med adenovirus infeksjon fremmet EMT, celle invasjon og migrasjon
in vitro Hotell og
in vivo
. På et molekylært nivå, HIF-1α direkte binding til den proksimale formidler av ZEB1 via hypoksi responselement (HRE) nettsteder og dermed øke transactivity og uttrykk for ZEB1. I tillegg kan inhibering av ZEB1 var i stand til å oppheve den HIF-1α-indusert EMT og celle invasjon. HIF-1α uttrykk var sterkt korrelert med uttrykk for ZEB1 i normal kolorektal epitel, grunnskoler og metastatisk CRC vev. Interessant, både HIF-1α og ZEB1 ble positivt assosiert med vimentin, en viktig mesenchymale markør for EMT, mens negativt assosiert med E-cadherin uttrykk. Disse funnene tyder på at HIF-1α forbedrer EMT og kreft metastase ved å binde seg til ZEB1 promoter i CRC. HIF-1α og ZEB1 er begge ansett som tumor-initiere faktorer, men våre resultater viser at ZEB1 er en direkte nedstrøms HIF-1α, noe som tyder på en roman molekylære mekanismen for HIF-1α-induserende EMT og kreft metastasering.
Citation: Zhang W, Shi X, Peng Y, Wu M, Zhang P, Xie R, et al. (2015) HIF-1α Fremmer Epitelial-Mesenchymale Overgang og metastasering gjennom direkte regulering av ZEB1 i tykktarmskreft. PLoS ONE 10 (6): e0129603. doi: 10,1371 /journal.pone.0129603
Academic Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, JAPAN
mottatt: 03.02.2015; Godkjent: 11 mai 2015; Publisert: 09.06.2015
Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er tilgjengelig i papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (81172057, 81302159), president Foundation of Nanfang Hospital, Southern Medical University (2012C003, 2012B009), og høyt nivå temaet matchende midler fra Nanfang Hospital (G201227)
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Epitelial-mesenchymale overgang (EMT) er en viktig hendelse i kreftmetastase, i løpet av hvilken polariserte epitelceller er tilbøyelig til å oppnå visse tegn av mesenchymale celler, så vel som mer migrasjon og invasive egenskaper [1]. De molekylære hallmarkers under EMT inkluderer nedregulert epiteliale markører (for eksempel E-cadherin, plakoglobin og desmoplakin), oppregulert mesenchymale markører (f.eks vimentin, N-cadherin og α-glatt muskulatur aktin) og økt uttrykk av transkripsjonsfaktorer slike som sneglen, Slug, Twist, sink finger E-box binding homeobox 1 (ZEB1), ZEB2, og /eller E47, som kan binde seg til E-cadherin promoter og hemme transkripsjon aktivitet og uttrykk [2]. Spesielt blir tap eller nedregulering av E-cadherin anses å være den primære og viktigste steget av EMT. E-cadherin kan avstilles ved ulike mekanismer, inkludert avvik metylering og transkripsjonen undertrykkelse. Blant dem er dens transkripsjon regulering mye studert i en rekke av ondartede svulster [3].
hypoksi-induserbare faktor 1 alfa (HIF-1α) har blitt rapportert å fremme EMT i flere typer tumorer via modulering av en eller flere EMT-forbundet gener [4]. Som en transkripsjonsfaktor, regulerer HIF-1α aktivitetene til nedstrømsgener gjennom binding av hypoksi responselement (HRE) i sine promotorområdene. For eksempel, er HIF-1α i stand til transactivate matrise metallopeptidase 9 (MMP9) i brystkreft [5]. I leverkreft, aktiverer den Snail dermed undertrykker E-cadherin uttrykk [6]. Videre konkurrerer HIF-1α med transkripsjonsfaktor 4 (TCF4) for direkte binding til p-catenin dermed styrke EMT i tykk- og endetarmskreft [7]. Derfor eksisterer det en nær sammenheng mellom EMT og HIF-1α uttrykk i kreft med mekanismene ukjente.
ZEB1 er en avgjørende transcriptional faktor på EMT [8-10]. Imidlertid er sammenhengen mellom HIF-1α og ZEB1 lite kjent. I denne studien viste vi at HIF-1α overekspresjon indusert EMT og metastatisk fenotyper i CRC. HIF-1α direkte regulert ZEB1 uttrykk gjennom den hypoksi responselementet 3 (HRE-3) som ligger i den proksimale ZEB1 promoteren. Undertrykkelse av ZEB1 reversert disse effektene indusert av HIF-1α overexpresssion. Uttrykket profiler av HIF-1α, ZEB1 og vimentin var mye likt i CRC pasienter, som var motsatt av E-cadherin uttrykk. Disse resultatene indikerer at CRC progresjon og metastase, indusert av HIF-1α, er formidlet ved direkte regulering av ZEB1.
Materialer og metoder
Cells og kliniske prøver
CRC HT29-cellelinjer og HCT116 ble opprettholdt i vårt laboratorium, under betingelsen med RPMI 1640 (GIBCO) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) som tidligere beskrevet [26]. Menneskelig CRC og ifølge tilstøtende normalt vev ble oppnådd fra ti pasienter med CRC som gjennomgikk koloskopi; menneskelig CRC og de matchet metastatisk lymfeknute vev ble oppnådd fra trettito CRC pasienter som gjennomgikk hemicolectomy i Nanfang Hospital (Guangzhou, Kina). Disse personene ga oss sin skriftlig informert samtykke (som beskrevet i PLoS samtykkeskjema) for å delta i denne studien og publisere disse tilfelle detaljer. Studiene ved hjelp av menneskelig vev ble gjennomgått og godkjent av komiteene for etisk vurdering av forskning som omfatter mennesker i Nanfang Hospital, Southern Medical University (Permit Number: NFYY-2012-75).
produksjon og konstruksjon av rekombinant adenovirus
HIF-1α-uttrykkende plasmid, pDC316-HIF-1α-EGFP, ble konstruert ved innsetting av full-lengde HIF-1α cDNA inn i restriksjonsseter mellom NheI og Notl endonukleaser i pDC316-ekspresjonsvektoren som inneholdt EGFP (pDC316-EGFP). For stabil knockdown av ZEB1 ble følgende sekvenser klonet inn pDC316-HIF-1α-EGFP. shZEB1 fremover: 5′-GATCCCCAGATGATGAATGCGAGTCGttcaagagaTGACTCGCATTCATCATCTTTTTTGGAAA-3 «og shZEB1 omvendt: 5′-AGCTTTTCCAAAAAAGATGATGAATGCGAGTCAtctcttgaaCGACTCGCATTCATCATCTGGG-3», som beskrevet tidligere [8]. Begge plasmider ble bekreftet ved DNA-sekvensering.
Alle adenovirus, inkludert adenovirus 5 uttrykker HIF-1α (Ad5-HIF-1α), HIF-1α overekspresjon og ZEB1 knockdown (Ad5-HIF-1α-shZEB1) og kontroll, Ad5-EGFP ble generert ved hjelp AdMax adenovirus pakkesystem (Microbix Biosystems Inc., Ontario, Canada) i henhold til produsentens instruksjoner. Storskala forsterkning av de ovennevnte adenovirus vektorer ble gjennomført i HEK293T celler ved homolog rekombinasjon mellom buss plasmid (pDC316) og en ryggrad plasmid (pBHGlox_E1, 3Cre). Titre av de rensede virus ble bestemt ved standard plakk dannende analysen i henhold til produsentens instruksjoner (Virapur, San Diego, California).
adenovirus infeksjoner in vitro
HT29 og HCT116-celler ble dyrket til 80% sammenflytning. Etter vasking med fosfatbufret saltvann (PBS) ble cellene inkubert med Ad5-EGFP og Ad5-HIF-1α ved MOI på 0.1, 1, 10, 100 og 1000, henholdsvis. Nitti minutter etter infeksjon, ble virus erstattet med faste vekstmedium. 24 eller 48 timer etter infeksjon, effektiviteten av transduksjon av EGFP som uttrykker konstrukter ble observert i henhold til immunfluorescens-mikroskopi og HIF-1α-ekspresjon ble analysert ved hjelp av PCR eller Western blot.
revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) , kvantitativ real-time PCR (qPCR) og Western blotting analyse
Disse analysene ble utført i hovedsak som beskrevet tidligere [27-29]. Primerne anvendt for RT-PCR var som følger: HIF-1α sense: 5′-TCCATGTGACCATGAGGAAA-3 «og antisense: 5′- CCAAGCAGGTCATAGGTGGT-3»; primerne anvendt for qPCR var som følger: HIF-1α: 5’TTTTTCAAGCAGTAGGAATTGGA -3 «(sense) og 5′-GTGATGTAGTAGCTGCATGATCG -3′ (antisense); ZEB1: 5»-CCTGTCCATATTGTGATAGAGGC-3 «(sense) og 5′-ACCCAGACTGCGTCACATGT-3′ (antisense); glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH): 5»-GTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3 «(sense) og 5′- CTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3» (antisens). De primære antistoffer, HIF-1α (Novus Biologicals, Littleton, CO), ZEB1 (Santa Cruz), E-cadherin (Santa Cruz), vimentin (prediluted, Abcam), Plakoglobin (Abcam), N-cadherin (Santa Cruz) og GAPDH (Abcam) var alle kommersielle produkter.
Migrasjon, invasjon og sårtilheling analyser
Ubestrøket Costar transwells (Corning Costar Co, Corning, New York) ble brukt for migrasjon analyser og Matrigel-belagte transwells (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) som brukes for invasjon analyser. Celler ble serum sultet over natten og deretter sådd ut i det øvre kammer med serumfritt RPMI 1640 medium. RPMI 1640 supplert med 10% FBS ble tilsatt i det nedre kammeret. Celler som hadde migrert over transwell membranen ble farget og kvantifisert. For sårtilheling analysen ble scratch gjort over cellen monolayer med en steril tips. Evnen til cellene til å migrere ble overvåket ved ulike tidspunkt ved hjelp av en lysmikroskopi
Histologisk og immunhistokjemisk analyse
Hematoxylin og eosin (H E). Og immunhistokjemi (IHC) ble utført som tidligere beskrevet [28]. I korte trekk, ble prøvene fiksert i 4% paraformaldehyd i PBS over natten og deretter innstøpt i parafin voks. Seksjoner ble kuttet en tykkelse på 5 mikrometer og farget med H E for histologisk analyse. IHC-analyse ble utført for ekspresjon av HIF-1α, ZEB1, E-cadherin og vimentin. Vevet hvori 10% av kreftceller blir positivt fargede ble ansett som positiv. For kvantitativ analyse, ble forholdet mellom positivt fargede celler til alle tumorceller i fem tilfeldige områder ved 200 gangers forstørrelse beregnet. Alle histologiske evalueringer inkludert prosentandelen av positive celler ble utført på en dobbel-blind måte ved to patologer for å minimere observasjon skjevhet.
Skift elektroforetiske mobilitet analyse (EMSA)
EMSA ble utført ved anvendelse av en dobbeltkjedet oligonukleotid som inneholdt en konsensus-sekvens for binding HIF-1α som tidligere beskrevet [27, 28]. Følgende sekvenser av fornuft tråder ble brukt til bindende og konkurranseanalyser: sekvenser som inneholder hvete HRE (P1: 5’GAGGCGTGGGACTGATGGTAGCC -3 «, -521 ~ -517 nt P2: 5’GGGGGCGGACACGCGAGG -3′ -529 ~ – 525 nt; P3: 5»-CCGGTCGCCGCGTGTCCTCGCC -3 «, -634 ~ -630 nt, P4: 5′-ATACTCCGGTCACGTTTCAGTTTTCTC -3», -1347 ~ -1342 nt) og i henhold muterte HRE sekvenser (P1-mut: 5 « – GAGGCACAGGACTGATGGTAGCC -3 «; P2-mut: 5′-GGGGGCGGATGTGCGAGG -3»; P3-mut: 5’CCGGTCGCCGCACATCCTCGCC -3 «og P4-mut: 5’ATACTCCGGTTGTGTTTCAGTTTTCTC -3). Nukleotidene ble endemerket med [γ-32P] ATP (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Fremont, CA) og T4 polynukleotidkinase (Promega). Nukleære ekstrakter fra celler infisert med Ad5-HIF-1α-EGFP og kontrollen ble fremstilt og anvendt i emts som vi tidligere beskrevet [28]. Og ble inkubert i 1 x bindingsbuffer inneholdende 2,5% glycerol, 50 ng /ul poly (di-dC), 5 mm MgCl2, 0,05% Nonidet P-40 og 4 pmol av biotin-merket oligonukleotid i et totalvolum på 20 ul ved romtemperatur i 20 min. De bundne blandinger ble størrelses-fraksjonert på en nondenaturing 6% polyakrylamidgel ved 180 V i 0,5 x TBE-buffer. Gelen ble deretter tørket og autoradiografert.
Generering av rapporten plasmider, Transient transfeksjon og luciferase assay
Produksjon av villtype og mutant reporter konstruksjoner ble utført som vi tidligere beskrevet [29]. En 567 bp av ZEB1 promoter fragmentet inneholder HRE-tre element ble klonet inn pGL3 vektor for å generere villtype reporter konstruere, navngitt som pluc-567. Mutasjon på HRE-3 motiver (pluc-567-mut) ble innført i pluc-567 luciferase konstruere med QuikChange seterettet mutagenese Kit (Stratagene, La Jalla, CA, USA). Begge konstruksjoner ble verifisert ved sekvensering. Celler ble infisert med Ad5-EGFP eller Ad5-HIF-1α i 48 timer fulgt av transfeksjon med pluc-567 eller pluc-567-mut og PRL-CMV (
Renilla
luciferase). Den trans potensiale ble testet med Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA) ved å måle luciferase aktivitet etter 48t.
Nude mus og metastase analysen
Dette dyreforsøk var utføres i henhold til anbefalingene i guide for IACUC (Institutional Animal Care og bruk Committee), og protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk av Nanfang Hospital (Permit Number: NFYY-2013-56) . Alle operasjoner ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. Etter operasjonen ble alle nakne mus avlivet av natrium pentobarbital anestesi. Seks ukers gamle BALB /c nakne mus ble kjøpt fra Guangdong Provincial Experimental Animal senter (Guangzhou, Kina) og tilfeldig delt inn i fire grupper (Ad5-EGFP: N = 8; Ad5-HIF-1α: N = 12; Ad5- HIF-1α-shRNA: N = 5; Ad5-HIF-1α-shZEB1: N = 5) før injeksjon. Dyrene ble utsatt til intraperitoneal anestesi med 40 mg /kg amobarbital natrium løsning. Etter at musene var dypt bedøvet, ble en liten langsgående øvre venstre flanke snitt gjort og milt ble forsiktig eksponert. Enkelt suspenderte celler (1,5 x 106 celler /mus) ble injisert i 70 mL PBS under milt kapsel. Etter fjerning av nålen, ble injeksjonsstedet presses med en aseptisk bomull svamp for å forhindre lekkasje. Etter dette ble returnert milten inn i bukhulen og periotneium og bukveggen ble sydd med silke [30-32]. Mus ble avlivet etter 5 uker, ble muligheten for metastasering analysert og metastaser oppsamlet for H . E farging og qPCR-analyse
Statistisk analyse
Analysen ble utført ved bruk av GraphPad Prism programvare 6. Alle verdier ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Den statistiske signifikans av forskjeller ble bestemt av Student
t
-test. Alle analysene var tosidig, sammen (for IHC resultater i kliniske prøver) eller uparede og en
P
verdien av 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
HIF-1α overekspresjon indusert EMT in vitro
For å få en bedre smitte effekt av adenoviruses i CRC kreftcellelinjer, HT29 og HCT116 cellene ble først transdusert med adenovirus 5 uttrykker økede grønt fluorescerende protein (Ad5-EGFP) eller Ad5-HIF-1α-EGFP ved multiplisitet av infeksjon (MOI) på 10, 100 og 1000, henholdsvis, med effekter som er tatt opp ved mikroskopi på 48 timer (fig 1a). Nesten 100% av cellene uttrykte EGFP med en MOI på 100, som var mye lik en MOI på 1000. RT-PCR (figur 1B til venstre) og western blot (Fig 1B høyre) Resultatene bekreftet den dramatiske økningen av HIF-1α ekspresjon . Samme effekt ble funnet i HCT116-celler (data ikke vist). Derfor ble MOI på 100 innført i alle av de følgende eksperimenter.
(A) HT29-celler ble transdusert med Ad5-HIF-1α ved den angitte MOI-verdiene for 48 timer. Fluorescensintensitet og lyse felt i samme område ble registrert ved opprinnelig forstørrelse som 100X. (B) mRNA (til venstre) og protein (høyre) uttrykk for HIF-1α ble oppdaget ved hjelp av RT-PCR og Western blot, henholdsvis. GAPDH ble brukt som kontroll lasting. (C) Cell morfologi av hvete HT29 eller HT29 celler transduced med de angitte adenovirus (Original forstørrelse = 400X). (D) Western blot-analyse av HIF-1α, E-cadherin, Plakoglobin, vimentin og N-cadherin i adenovirus-infiserte HT29 og HCT116-celler. GAPDH ble benyttet som intern kontroll. (E) Brett endring av invasjonen og migrasjon i de indikerte cellene. Kvantifisering av resultatene ble vist i søylediagrammet med middelverdier ± SD. *
P
0,05. (F) sårtilheling analysen. Cellemonolag ble ripet med en pipettespiss og bilder ble tatt 0, 24 og 48 timer etter sår formasjon. *
P
0,05.
Interessant, da observere adenovirus-infiserte celler, fant vi HT29-Ad5-HIF-1a celler var mye mer spindel-formet, som fibrobalsts, sammenlignet med villtype HT29 celler som var runde med godt celle-celle-adhesjon (figur 1C). Den ovenfor overgangen til cellemorfologi faktisk var da samme som endringen i EMT prosess. Derfor vi neste oppdaget uttrykk for EMT markører og funnet ut at E-cadherin og Plakoglobin, to viktige epiteliale markører for EMT, var signifikant nedregulert i Ad5-HIF-1α-infisert HT29 og HCT116 cellene sammenlignet med sine kontrollceller. Tvert imot ble mesenchymale molekyler, vimentin og N-cadherin kraftig økt etter Ad5-HIF-1α-EGFP-infeksjon (Fig 1 D). Videre er en økning i invasjon og migrasjon (avgjørende trekk ved EMT fenotype) av begge cellelinjer med HIF-1α overekspresjon ble også påvist (figur 1E). Konsekvent, den sårheling analysen viste at bredden i HT29-Ad5-HIF-1a celler var mye smalere enn i HT29-Ad5-EGFP celler ved de angitte tids tomter, henholdsvis (figur 1F). Ovennevnte funn tyder på at HIF-1α overekspresjon induserer EMT og fremmer invasjon og migrasjon i CRC cellelinjer.
HIF-1α overekspresjon fremmet metastaser in vivo
For å evaluere effekten av HIF-1α overekspresjon på kreft metastaser
in vivo
, HT29 celler ble transduced med Ad5-HIF-1α-EGFP eller Ad5-EGFP, henholdsvis på MOI på 100. Førti-åtte timer senere ble enkeltcellesuspensjoner høstet og injiseres BALB /c nakne mus via en subsplenic metode. Som vist i figur 2A, ble flere intrahepatisk tumorknuter lett inspiseres grovt i Ad5-HIF-1α-EGFP-injisert gruppe, mens mindre eller ingen knuter ble funnet i kontrollmusene. For å bekrefte den ovenfor angitte forskjell, undersøkte vi H E farging og funnet mye mer utviklede basofile tumor regioner i lever fra mus injisert med HT29-Ad5-HIF-1a-celler sammenlignet med kontrollgruppen, som vist i figur 2B. Mengde analyse viste at en signifikant økning (5,3 ganger) av levermetastaser ble notert i den Ad5-HIF-1α-injisert gruppe sammenlignet med kontrollgruppen (figur 2C). Real-time PCR resultater bekreftet at nivået av HIF-1α i leverlesjoner av mus injisert med HT29-Ad5-HIF-1α var mye høyere enn det som injisert med HT29-Ad5-EGFP (figur 2D). Disse resultater antyder at overekspresjon av HIF-1α fremmer levermetastaser av CRC i dyremodell
Representative fotografiske bilder (A) og H . E-farging (B) i leveren hos BALB /c-mus fem uker etter subsplenic injeksjonen av HT29 celler transduced med Ad5-HIF-1a eller kontroll virus. Hvite piler indikert metastatiske knuter. (C) sammenligning av levermetastaser mellom HT29-Ad5-HIF-1α mus (N = 12) og kontrollmus (n = 8). *
P
0,05. (D) Bekreftelse av overekspresjon av HIF-1α fra metastatiske knuter i mus injisert med Ad5-HIF-1α ved qPCR, sammenlignet med de injisert med kontroll virus.
HIF-1α regulert ZEB1 uttrykk
Både HIF-1α og ZEB1 har vært innblandet i kreft metastase og EMT [4, 9, 11]. Deretter undersøkte vi om HIF-1α overekspresjon hadde effekt på uttrykk for ZEB1. Faktisk, oppregulering av mRNA og proteinnivåene av ZEB1 ble funnet sammen med overekspresjon av HIF-1α i HT29-celler som vist i figur 3A 3E). Vi har også funnet at nivåene av begge proteiner var mye høyere i tumoren enn det i tilstøtende normale vev. På cellenivå, ble begge HIF-1α og ZEB1 hovedsakelig uttrykkes i cellekjernen og cytoplasma, spesielt i nucleus, som var teoretisk i overensstemmelse med plasseringen området av transkripsjonsfaktor. Og også, observasjoner av deres samlokalisering viser at HIF-1α kan samhandle med ZEB1 fysisk.
(A) Endogene uttrykk nivåer av HIF-1α og ZEB1 i de angitte fem cellelinjer ble oppdaget av qPCR med GAPDH brukt som intern kontroll. (B T: svulst. Nivået av hvert protein ble normalisert mot GAPDH. (E) Representative bilder av IHC flekker på menneske CRC formalinfiksert parafin-embedded prøver for HIF-1α og ZEB1. Venstre panel viste de tilstøtende normale kolorektal vev. Høyre panel viste CRC prøver. Original forstørrelse, 200X.
Regulering av ZEB1 av HIF-1α gjennom HRE-3
For å vurdere om ZEB1 reguleres direkte av HIF-1α, promotor sekvenser av ZEB1 ble analysert med bioinformatikk metoder. Vi fant ut at det var fire potensielle HRE steder i proksimale promoter (~ 3500 nt oppstrøms, startkodonet ATG definert som 0) av ZEB1 genet (fig 4A). Det var HRE-en på -517 ~ -521 nt; HRE-2 på -525 ~ -529 nt; HRE-3 på -630 ~ -634 nt og HRE-4 -1342 ~ -1347 nt. Basert på disse, ble prober P1, P2, P3 og P4 med villtype og mutant HRE sider utformet, henholdsvis, som beskrevet i fremgangsmåter og materialer. Resultatene av EMSA-analysen viste at HIF-1α-binding ble signifikant økt etter inkubasjon av nukleære ekstrakter fra HT29-Ad5-HIF-1α celler med HRE-3-inneholdende oligonukleotidet fra ZEB1 promotoren (fig 4B). Men det var bare svært uken band eller til og med ingen band som presenteres i HT29-Ad5-HIF-1a celler eller andre kontrollceller med HRE-1, 2 eller 4-holdig oligonukleotid (data ikke vist). Videre konkurranse for HIF-1α-binding med umerkede oligonukleotider inneholdende HRE-3 og prober inneholdende muterte HRE-3 viste ikke noen HIF-1a-bindende bånd (figur 4B). Disse resultatene antydet at HIF-1α var i stand til å binde ZEB1 promoter via HRE-3 område.
(A) Skjematisk representasjon av den proksimale promoter (~ 3500 nt oppstrøms) av ZEB1 genet. HRE: hypoksi respons element. (B) Oligonukleotider for EMSA var villtype (kolonne 1-3) og mutant (kolonne 4-5) sonde 3 fra ZEB1 arrangøren, som inneholdt en konsensus HRE-3. Nukleære ekstrakter fremstilt fra HT29-Ad5-HIF-1α (felt 3 og 5) eller kontrollceller (kolonne 2 og 4) ble inkubert med [γ-32P] ATP-merket probe før elektroforese. Negativ kontroll ble utført med villtype-proben uten kjerneekstrakt (spor 1). (C) Skjematisk representasjon av promotorområdet av ZEB1 og rapport konstruksjoner som brukes i adenovirus-infiserte eksperimenter. Konstruksjonene inneholdt hvete (pluc567-wt) eller mutant (pluc567-mut) HRE-3 ligger -634 ~ -630 nt oppstrøms for transkripsjon start stedet for ZEB1. (D) Aktivering av plu567 eller pluc567-Mut i Ad5-HIF-1α- eller Ad5-EGFP-infiserte HT29 celler (N = 3 replikere eksperimenter). *,
#
P
0,05.
Deretter fant vi ut effekten av HIF-1α overekspresjon på transkripsjonen aktivitet av ZEB1. Basert på resultatene av EMSA, en promoter inneholdende plasmid HRE1-3 (pluc567) og seterettet mutagenese av HRE-3-plasmid (pluc567-mut) ble samlet og transient transfektert inn i HT29-celler som var preinkubert med Ad5-HIF -1α eller Ad5-EGFP i 24 timer, Dual-luciferase-analysen viste at aktiviteten av pluc567 i HT29-Ad5-HIF-1a-celler økte mer enn 5 ganger sammenlignet med kontrollceller, mens forstørrelsen ble betydelig redusert med pluc567-mut transfeksjon (fig 4C 4D). Resultatene viste at HIF-1α aktivert ZEB1 direkte ved binding til HRE-3 område i ZEB1 proksimale promoter.
ZEB1 er kritisk for HIF-1α-indusert EMT og metastase
For å oppdage enten ZEB1 er nødvendig for HIF-1α-indusert EMT og metastatisk fenotype, genererte vi et plasmid med HIF-1α uttrykke og ZEB1 knockdown, og deretter pakket inn adenovirus (Ad5-HIF-1α-shZEB1). Fordi det endogene nivå av ZEB1 i HT29-celler var mye lavere enn i HCT116-celler (figur 3C, til høyre), som var i samsvar med deres proteininnhold i våre tidligere data [12]. Derfor ble HCT116 cellene utnevnt til å utføre alle de ZEB1 knockdown eksperimenter.
In vitro
ble HCT116-celler transduced med henholdsvis Ad5-HIF-1α-shZEB1 og Ad5-HIF-1α, . Western blot, invasjon og migrasjons analyser ble utført etter 48 timer. Som vist i figur 5A, ble E-cadherin uttrykk upregualted og vimentin uttrykk ble nedregulert akkompagnert med knockdown av ZEB1. Konsekvent, ble invasjonen og migrasjon kapasitet redusert med henholdsvis 34% og 45%,.
In vivo
, observerte vi flere tumorknuter på overflaten av lever og H E farging viste basofile tumor regioner i lever fra mus injisert med HCT116-Ad5-HIF-1α celler. I motsetning til dette dyr injisert med HCT116-Ad5-HIF-1α-shZEB1 cellene var dramatisk redusert tumorbelastninger med en reduksjon i antallet og størrelsen av gjenværende tumor reir, sammen med mer massiv nekrose med betennelse regionen (Fig 5 D 0,05. (D) Representative fotografiske bilder og H E farging av leveren hos BALB /c-mus 5 uker etter injeksjon av subsplenic HCT116-Ad5-HIF-1α eller HCT116-HIF-1α-shZEB1 celler. (E) Kvantifisering av den gjennomsnittlige antall metastaser i leveren hos mus (N = 5). *
P
0,05.
Uttrykk av HIF-1α, ZEB1, E-cadherin og vimentin i grunnskolen og metastatisk CRC prøver
For å evaluere forholdet mellom HIF-1α, ZEB1 og EMT viktige markører i kliniske vev, ble IHC farging utført i 32 par av primære CRC prøver og metastatisk lymfeknute (fig 6A). Den gjennomsnittlige prosentandelen av positivt fargede celler til alle tumorceller i hvert vev ble bedømt uavhengig av to forskere som beskrevet i materiale og fremgangsmåte. Vi fant at prosentandelene av både HIF-1α- og ZEB1-positive CRC-celler var mer enn 65%, mens andelen i metastatiske lymfeknuter ble øket til ca. 86% for HIF-1α og 78% for ZEB1 (figur 6B). På samme tid, nivået av vimentin var også ganske høy i både primære og metastatiske vev; Selv om det ikke var noen signifikant forskjell mellom de to gruppene. For E-cadherin, andelen av E-cadherin-positive tumorceller i primære CRC vev var omtrent 29%, mens signifikant redusert til 12,7% i metastaserende gruppe (figur 6B). Disse resultatene støtter våre observasjoner med CRC cellelinjer som HIF-1α uttrykk var positivt assosiert med ZEB1 og vimentin, og negativt assosiert med E-cadherin, og HIF-1α og ZEB1 kan bidra forskjellig til EMT og metastasering.
Representative bilder av IHC (A) og kvantifisering av positive tumorceller (B) i både primær CRC legemer og en i henhold metastatisk lymfeknute. Original forstørrelse, 200X. *
P
0,05 og
#
P
0,05.
Diskusjoner
En av de grunnleggende måter for kreftbehandling er forståelsen av molekylære mekanismer for tumordannelse og kreft metastasering. I denne studien har vi avdekket at ZEB1 er et nedstrøms mål for HIF-1α og har en avgjørende rolle i EMT og metastatisk fenotyper indusert ved overekspresjon av HIF-1α. Vi foreslår at HIF-1α binder direkte til arrangøren av ZEB1 og fungerer som den kritiske positiv regulator, og dermed fremme EMT og kreft metastasering. Våre funn avdekker en ny mekanisme som HIF-1α regulerer tumorprogresjon og invasjon.
HIF-1α uttrykk er ofte oppregulert i en rekke av ondartede svulster, og mange publikasjoner har rapportert den nære sammenhengen mellom HIF-1α uttrykk og økt aggressivitet og høyere metastatisk kapasitet i eggstokkene, brystkreft, lungekreft, prostata, tykktarm og bukspyttkjertel carcinoma [11-14]. For molekylært nivå, utøver HIF-1α sin biologiske funksjon gjennom aktive målgener som sneglen, Twist og TCF3, som alle er forbundet med EMT og metastase [15-18]. Det er imidlertid viktig å identitets flere ukjente mål og for å vise sammenhengen mellom HIF-1α aktivering og andre onkogene eller tumor-suppressorer.
ZEB1, et pro-metastatisk transkripsjonsfaktor, er involvert i kreftutvikling og metastase [ ,,,0],19, 20]. Mekanistisk er tilstrekkelig til å nedregulere E-cadherin og å indusere EMT i brystkreft ved å binde til de konserverte E-bokser i E-cadherin promoter ektopisk ekspresjon av ZEB1. Inhiberingen funksjon av ZEB1 på E-cadherin og dermed fremme EMT er også observert i xenograft-modeller av CRC [8]. Videre medierer ZEB1 claudin-1-regulerte forandringer i celle invasjon og anoikis i CRC [21]. I likhet med ZEB1, Snail og Twist er også viktige EMT transkripsjonsfaktorer ved å kneble E-cadherin gjennom binding til E-boksen element i E-cadherin promoter [22]. Snail er identifisert som en HIF-1α target genet i mus [23]; Twist er direkte regulert av HIF-1α i hode og nakke plateepitelkarsinom (HNSCC) [18, 24]. Med andre ord, de mener også at HIF-1α veien kan regulere E-cadherin undertrykkelse, antagelig via Snail eller Twist. Derfor, på grunn av de tilsvarende evner av HIF-1α og ZEB1 å indusere EMT og de overlappende fenotyper av HIF-1α og ZEB1 i null-mus, er det sannsynlig at disse to genene er lokalisert i det samme reaksjonsvei for å regulere kreft metastasering. Derfor hypotese vi at det kan være en sterk interaktivt bindeledd mellom ZEB1 og HIF-1α. Faktisk fant vi at HIF-1α var i stand til å binde ZEB1 promoter gjennom HRE-3 og positivt regulert ZEB1 transactivity. Disse funnene tyder også på at sneglen, Twist og ZEB1, kan de tre store EMT regulatorer regulere EMT og metastase med noen svært liknende mekanismer. Interessant, Peinado et al rapporterte at sneglen, Slug, ZEB1 og ZEB2 rekruttere bestemte kromatin-remodeling komplekser støtter en dynamisk kobling mellom transkripsjon undertrykkelse og epigenetiske gener stanse av E-cadherin under tumorprogresjon og EMT [25].
