Abstract
dødelighet av prostatakreft (PCA) er på grunn av dannelsen av metastatisk sykdom. Forstå hvordan denne prosessen er regulert er derfor avgjørende. Vi har tidligere vist at endoglin, en type III transformerende vekstfaktor β (TGFB) super reseptoren, undertrykker menneske PCa celle invasjon og metastasering. Endoglin-mediert undertrykkelse av invasjon ble også vist av oss å være avhengig av type I TGFfi reseptor, aktivin reseptor-lignende kinase 2 (alk2), og den nedstrøms effektor, Smad1. I denne studien viser vi for første gang at to type II TGFp-reseptorer er nødvendig for endoglin-mediert undertrykkelse av invasjon: aktivin En reseptortype IIA (ActRIIA) og benmorfogenetisk protein reseptor type II (BMPRII). Nedstrøms signalering gjennom disse reseptorene hovedsakelig skjer ved Smad1. ActRIIA stimulerer Smad1 aktivering i en kinase-avhengig måte, og dette er nødvendig for undertrykkelse av invasjon. I motsetning BMPRII regulerer Smad1 på en bifasisk måte, fremme Smad1 signaliserer gjennom sin kinase domene men undertrykke det gjennom sin cytoplasmatiske hale. BMPRII er Smad1 regulerende effekten er avhengig av sitt uttrykk nivå. Videre, dens evne til å undertrykke invasjon er uavhengig av enten kinase-funksjon eller haledomene. Vi viser at ActRIIA og BMPRII fysisk samhandle, og at hver samhandler også med endoglin. Den nåværende funn viser at både BMPRII og ActRIIA er nødvendige for endoglin-formidlet hemming av human PCa celle invasjon, at de har forskjellige effekter på Smad1 signalering, at de gjør separate bidrag til regulering av invasjon, og at de funksjonelt og fysisk samvirke.
Citation: Breen MJ, Moran DM, Liu W, Huang X, Vary CPH, Bergan RC (2013) Endoglin-mediert Undertrykkelse av prostatakreft Invasion er regulert av activin og Benmorfogenetiske Protein Type II-reseptorer. PLoS ONE åtte (8): e72407. doi: 10,1371 /journal.pone.0072407
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 17 september 2012; Godkjent: 15 juli 2013; Publisert: 13 august 2013
Copyright: © 2013 Breen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health til RCB, CA122985. Dette arbeidet støttes delvis av de Malkin Scholars Programmer fra Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center of Northwestern University via en pris til MB. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den vanligste kreftformen og den nest største årsaken til kreftdødelighet for amerikanske menn [1], med i hovedsak alle dødsfall som følge av metastatisk sykdom [2]. Metastase er en svært ineffektiv prosess der cellene må overvinne mange hindringer, er en innledende hvorav flykte fra stedet av opprinnelse gjennom oppkjøpet av en invasiv fenotype [3]. Signalisering gjennom de TGFp superfamilien og dens assosierte reseptorer er en viktig regulator av denne prosess i en rekke krefttyper [4], inkludert PCa [5]
TGFp er det prototypiske medlemmer av en familie av ekstracellulære ligander -. Av hvilken det er 33 i pattedyr – som regulerer en rekke utviklings- og homeostatiske prosesser, og gjøre det gjennom en relativt bevart signalmekanisme [6]. Med kanonisk TGFfi signalisering, ligandbinding induserer oligomerisering av dimerer av serin /treonin kinase type I og type II-reseptorer (RIS og Riis, henholdsvis), karakterisert ved at konstitutivt aktiv Riis deretter fosforylere RIs. Disse aktiverte RIs deretter fosforylere nedstrøms reseptor-forbundet Smads (R-Smads). Det fosforylerte R-Smad bindes deretter til den felles mellem, Smad4, og de resulterende kompleksene påvirker gentranskripsjon. Grovt sett kan signaleringen gjennom denne superfamilien kan deles inn i TGFp-lignende ligander som har beslektet RIs tendens til å være aktivin reseptor-lignende kinase (ALK) 4, 5, eller 7, tenderer til å aktivere R-Smads Smad2 eller 3, og benmorfogenetisk protein (BMP) -lignende ligander signalisering gjennom beslektet RIs alk 1, 2, 3, eller 6, og R-Smads Smad1, 5 eller 8.
Endoglin (også referert til som CD105) er et homodimert transmembranprotein som fungerer som en hjelpe TGFfi superfamilie-reseptor, og er ansett som en type III reseptor [7] – [9]. Endoglin modulerer signale nedstrøms TGFB og BMP ligander, tenderer til å fremme signaliserer fortrinnsvis gjennom BMP-lignende baner, mens hemme TGFfi lignende trasé [10] – [14]. I tillegg regulerer endoglin rekke cellulære prosesser gjennom ikke-Smad avhengige veier. Relevant for cellulær invasjon, samhandler endoglin gjennom sin cytoplasmaområde med LIM-domene-inneholder proteiner zyxin og zyxin relaterte proteiner en å regulere brennvidde heft sammensetning og aktin cytoskjelettet [15], [16]. Dessuten regulerer endoglin integrin-aktivering og signalering i en rekke cellulære prosesser [17] – [21]. Endoglin kan også modulere trans potensialet i H-Ras [22].
Rollen endoglin i kreft er komplekse, gitt ulike uttrykk og funksjon på tvers av celletyper [23], [24]. De fleste studier av endoglin funksjonen har blitt gjennomført i endotelceller. Germline mutasjoner i endoglin føre til genetisk sykdom arvelig hemoragisk telangiectasia [25], fremhever endoglin rolle som en viktig regulator av endotelceller motilitet, invasjon, og spredning. I flere kreftformer, inkludert PCa, er endoglin overuttrykt i endotelceller i mikrovaskulaturen og er forbundet med angiogenese [26] – [28]. Det er også sterkt uttrykt i mikromiljøet stromal [29]. Således, ved det generelle vevsnivå, endoglin ofte er overuttrykt i kreft. I kontrast og av stor betydning, i epitelceller hos flere solide svulster – og i prostata epitelet i særdeleshet – vi og andre har vist at endoglin uttrykk er tapt med sykdomsprogresjon [30], [31]. Vi har vist at dette tapet fremmer celle løsgjøring [31], celle invasjon [14], [32] og metastase [33]. Mekanistisk har vi vist at endoglin undertrykker invasjon på en måte som er avhengig av RI Alk2 og den nedstrøms R-Smad Smad1 [14]. Imidlertid er involvert i denne prosessen Riis er imidlertid ukjent.
På grunn av rollen til Alk2 og Smad1 i endoglin-mediert undertrykkelse av invasjon (EMSI) i PCa, hypotese vi at en eller flere Riis er involvert i denne prosessen. I denne rapporten identifiserer vi at ActRIIA og BMPRII er påkrevd. Interessant nok har de motsatte virkninger på nedstrøms Smad1 signalering. ActRIIA fremmer den tidligere identifiserte signale aksen, mens BMPRII har bimodal funksjon, fremme Smad1-avhengig signalisering via dens kinase-aktivitet mens inhibering av den til sin store cytosoliske haledomene. Sammen disse funnene er den første til å identifisere ActRIIA og BMPRII som viktige regulatorer av EMSI og vise at de opererer gjennom distinkte ennå gjensidig avhengige mekanismer. Disse resultatene åpne nye veier for farmakologiske målretting av PCa metastatisk potensial
Materialer og metoder
Cell Culture Transfeksjon
opprinnelse og kultur vilkår for PC3-M menneskelige PCA cellene er blitt beskrevet [34]. Den PC3-M-linjen er en meget metastatisk PC3-derivat cellelinje. De ble holdt i RPMI 1640 media supplert med 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES buffer, 50 enheter /ml penicillin, 50 ug /ml streptomycin og 10% føtalt bovint serum (Life Technologies, Grand Island, NY). DU145-celler er humane PCA-celler avledet fra et hjernemetastaser og ble oppnådd fra ATCC (Manassas, VA). Disse cellene ble opprettholdt i DMEM media supplert med de ovennevnte produkter i tillegg til 1 mM natrium pyruvat (Life Technologies). Alle celler ble holdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% karbondioksid og 95% luft under sub-konfluente eksponentiell vekstvilkår med triweekly endringer av medium, og ble erstattet med fast passasje cellene på en jevnlig basis.
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP ble autentisert i henhold til metoder som er beskrevet i American Type Culture Collection Technical Bulletin No. 8, cellelinje verifikasjonstesten Anbefalinger [35]. Spesielt celler fra lav passasje (dvs. . 15 passasjer) ble frosset aksjer brukt og var opp igjen etter 20 passasjer; celler gikk rutine mikroskopisk undersøkelse for å bekrefte uniform og standard mobil arkitektur og ingen mikrobiell infeksjon; og cellene ble testet (innen tre måneder) og funnet negative for mykoplasma-infeksjon.
Transient transfeksjon av celler ble utført som tidligere beskrevet [36]. Kort, 24 timer etter plating ble cellene transfektert med transitt-LT1 Transfeksjon Reagens (Mirus Bio LLC, Madison, WI) for invasjon analyser som involverer plasmid DNA bare, med Dharmafect Duo (Thermo Scientific, Lafayette, CO) for invasjon analyser som involverer samtidig levering av plasmid DNA og siRNA, eller med Dharmafect2 (Thermo Scientific, tidligere Dharmacon) for invasjon og luciferase forsøk med levering av siRNA alene. For immunoutfellingsstudier eksperimenter ble celler transfektert med plasmid DNA ved hjelp Lipofectamine LTX (Life Technologies). Cellene ble så anvendt i de angitte assayer 24-48 timer etter transfeksjon. Alle reagenser ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. I noen eksperimenter, som angitt, ble cellene vasket to ganger med PBS, serum-sultet i medium inneholdende 0,1% bovint serumalbumin i 3 timer, og behandlet med 2 ng /ml TGFfi, 5 ng /ml BMP7, eller 20 ng /ml BMP9 i 30 minutter før lyse
Reagenser
nøytraliserende antistoffer til ActRIIA, Fc-ActRIIA og Fc-BMPRII ligand feller, og rekombinant humant TGFB ble kjøpt fra R . D Systems (Minneapolis MN) . Antistoffer mot følgende proteinene ble kjøpt: fosfor-Smad1 /5, fosfor-Smad1 /5/8, Smad1, og Myc-tag fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA), endoglin fra BD Biosciences (San Jose, California), GAPDH fra Enzo og biovitenskap (Farmingdale NY), FLAG-tag og Myc-tag fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), α-tubulin fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California), HRP-konjugert geit anti-mus IgG (H + L) F (ab «) 2-fragment fra KPL (Gaithersburg, MD), og ECL esel anti-kanin helt antistoff fra GE Healthcare Biosciences (Pittsburgh, PA). De sirnas brukt i denne studien var alle bassenger av fire individuelle siRNAs, bestilt fra Thermo Scientific som ON-TARGETplus SMARTpools
Plasmider
Følgende ekspresjonsvektorer ble brukt. PcDNA3 tom vektor kjøpt fra Life Technologies, endoglin i en pcDNA3 vektor, ble konstruert og tidligere beskrevet av oss [31], pCMV-β-galaktosidase (β-gal) kjøpt fra Agilent Technologies (Santa Clara, CA), pcDNA3-ActRII, pcDNA3-ActRIIA-ΔKD- 5myc, pcDNA3-ActRIIB og pcDNA3-ActRIIB-ΔKD-5myc ble sjenerøst gitt av Wylie Vale (Salk Institute, La Jolla, California) [37], [38], pcDNA3-ActRIIA-myc ble generert fra pcDNA3-ActRIIA av Custom DNA konstruksjoner (University Heights, OH), pCMV5-BMPRII, -BMPRII-KI og -BMPRII-Δtail konstruksjoner ble sjenerøst gitt av Liliana Attisano (University of Toronoto, Canada) [39], pGL3-MLP-BRE
2-luciferase var en sjenerøs gave fra Peter ti Dijke (Leiden University Medical Centre, Nederland) [40], PRL-tk
Renilla
luciferase ble kjøpt fra Promega (Madison, WI).
Invasion Analyser
bølgen analyser ble utført i det vesentlige som tidligere beskrevet av oss [41], med følgende modifikasjoner. I korthet ble cellene ko-transfektert med den indikerte DNA og β-gal, med eller uten siRNA som angitt. Etter 48 timer ble cellene sådd ut på 8,0 um pore Growth Factor-Redusert Matrigel Invasion Chambers (BD Biosciences) i serum-fritt medium inneholdende 0,1% BSA, i replikater på n = 4 brønner for hver eksperimentell tilstand. Serum-fri NIH-3T3-kondisjonert medium ble plassert i bunnkammeret som en kjemoattraktant, og cellene ble tillatt å invadere i 24 timer. Celler på toppen av membranen ble fjernet fra tre brønner pr tilstand (som tillater kvantifisering av invaderte celler), mens den fjerde ble etterlatt uforstyrret (totalt cellekontroller). Etter festing celler og farging for β-gal uttrykk ved hjelp av en in situ ß-galaktosidase Farging Kit (Agilent Technologies), ni mikroskopiske felt (av 100x) per brønn ble fotografert på en Olympus CKX41 mikroskop utstyrt med en QImaging RETIGA 1300 digital CCD kamera og QCapture bildebehandlingsprogrammer. β-gal-positive celler ble tellet i hvert felt ved hjelp av Image J programvare og normalisert invasjon ble bestemt for hver brønn som βgal
+ celler i invasjon brønn /β-gal
+ -celler i totalt brønnen. Relativ invasjon ble beregnet i prosent av en kontroll tilstand (f.eks tom vektor /siNeg).
kvantitativ revers transkriptase-polymerase kjedereaksjon
RNA ble isolert fra celler ved bruk av RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia , CA), i henhold til produsentens instruksjoner. RNA ble behandlet med RNase fri DNase og dens kvalitet og kvantitet vurdert ved optisk tetthet. cDNA ble syntetisert ved hjelp av enten TAQMAN revers transkripsjon Reagenser (Life Technologies) eller qScript cDNA SuperMix (Quanta biovitenskap, Gaithersburg, MD), og qPCR utføres med TaqMan Universal PCR Master Mix og TaqMan primer-probe par på en 7500 Real Time PCR System (alle fra Life Technologies), alle som tidligere beskrevet av oss [33]. RT minus kontroll-reaksjonene ble kjørt som en negativ kontroll. Validert genet spesifikke ekson spenner primer /probe sett for ACVR2A, ACVR2B, BMPRII, TGFβRII, endoglin, Smad1, Smad5, Smad8, og GAPDH var fra Applied Biosystems. Analysene ble gjennomført i replikater på to og de resulterende midlere terskel sykluser (CT) ble anvendt for videre analyse. Analysene ble gjentatt minst én gang på en egen tid, også i replikater av 2. Ct for individuelle reaksjoner ble identifisert gjennom Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System programvare. Genekspresjon ble normalisert til den av GAPDH, og relativ genekspresjon ble beregnet ved 2
-ΔΔCt metoden [42].
luciferase Assays
Cellene ble transient transfektert med pGL3 BRE
2-luciferase (induserbare) og PRL-TK (konstitutive) plasmider ved et forhold på 20:01, med andre plasmider ± sirnas som angitt, som tidligere beskrevet av oss [14]. I korthet, etter 48 timer ble cellene lysert og luciferaseaktivitet ble målt ved bruk av en dual-luciferase reporter Assay System (Promega). Målinger ble gjort på enten en Synergy HT plateleser (BioTek, Winooski, VT) eller en Mono 2010 luminometer (Analytical Luminescence Laboratory, San Diega CA). Etter å subtrahere bakgrunnssignalet, ble luciferase-aktivitet beregnet som forholdet mellom ildflue luciferase /
Renilla
luciferase.
Western blotting
Cellelyse og immunblotting ble utført som tidligere beskrevet av oss [ ,,,0],14]. I korthet ble cellene vasket med PBS, lysert med lyseringsbuffer: PBS (137 mM NaCl, 10 mM Na-fosfat, 2,7 mM KCI), 0,5% Triton X-100, 1 mM EDTA, 2,5 mM natriumpyrofosfat, 1 mM β-glycerofosfat med tilsetning av protease inhibitor cocktail (# P8340,) fosfatase-inhibitor cocktail 1 og 2, 10 mM natriumfluorid, og 1 mM natrium-ortovanadat (alt fra Sigma-Aldrich), og lysater klaret ved sentrifugering, alt ved 4 ° C. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved Bradford-metoden (Bio-Rad, Hercules, CA), ble like mengder separert ved SDS-PAGE under denaturerende og reduserende betingelser, overført til nitrocellulose (Bio-Rad), og farget med Ponceau S (Sigma-Aldrich ) for å verifisere selv lasting og transport. Membranene ble enten blokkert og probet med primær (4 ° C over natten) og sekundært antistoff (1t romtemperatur) i 5% melk i TBS-T (25 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20) eller blokkert og undersøkt med 0,5% melk /TBS-T bruker SNAP id vakuum manifold (Millipore), i henhold til produsentens forslag. Membraner ble deretter inkubert med ECL Western blotting Detection reagenser og utsatt for Amersham Hyperfilm ECL (begge fra GE Healthcare). Filmene ble utviklet ved hjelp av en SRX-101A film prosessor (Konica Minolta, Wayne, NJ). Membranene ble strippet i 62,5 mM Tris (pH 6,8), 2% SDS, og 100 mM β-merkaptoetanol i 20 minutter ved 50 ° C, vasket en kort stund i TBS-T, og re-probet som ovenfor. Alle Western blot ble gjentatt minst en gang, til en separat tid.
Immunoutfelling
Cellene ble vasket med PBS og overflateproteiner som ble tverrbundet med 2 mM vann-gjennomtrengelige tverrbinding reagens 3,3′ ditiobis (sulfosuccinimidylpropionate) (DTSSP; Thermo Scientific) i PBS. Tverrbindings Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av Tris, pH 7,5 til 20 mM. Cellene ble deretter lysert som angitt ovenfor ved bruk av buffer bestående av følgende: 10 mM Tris-HCl, pH 7,4; 145 mM NaCl; 10% glycerol; 0,5% NP-40; protease og fosfatase-hemmere som ovenfor. Lysater ble fjernet ved sentrifugering, og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved Bradford-metoden som ovenfor. En lik mengde protein ble klaret med agarosekuler konjugert til rekombinant Protein A (Life Technologies, som brukes for kanin-IgG) eller Protein G Plus (Thermo Scientific, som brukes for mus IgG) i 1 time ved 4 ° C med rotasjon. Forklarede lysater ble overført til nye rør og inkubert med IgG over natten ved 4 ° med rotasjon. Antistoff-antigen-kompleksene ble gjenvunnet ved 2 timers inkubering med Protein A eller Protein G, i overensstemmelse med den forhåndsklaring trinn. Perlene ble gjenvunnet og supernatanten ble fjernet og lagret. Perlene ble vasket tre ganger med iskald lyseringsbuffer. Prøvene ble ekvilibrert til 1X Laemmli-buffer inneholdende 5% β-merkaptoetanol (Sigma-Aldrich) og inkubert i 95 ° C varmeblokk i 6 minutter, noe som reduserer og denaturering prøvene og å spalte den tverrbinderen. Prøvene var Western strøket som beskrevet ovenfor.
Statistical Analysis
For å analysere invasjon analyser ensidige uparede Student t-tester ble beregnet på grunnlag av den takserte fenotype for reversering av undertrykkelse av invasjonen. For luciferasepreparater analyser og QRT-PCR, ble Student tosidige uparede Student t-test benyttet. P values≤0.05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
Endoglin-mediert Undertrykkelse av Invasion Krever ActRIIA og BMPRII
Endoglin-mediert hemming av invasjon (EMSI) ved PCA krever en RI, dvs. alk2 [14]. I tillegg kanonisk signalering gjennom TGFp-superfamilien av reseptorer krever ligand-avhengig aktivering av RI med en RII [6]. Vi har derfor en hypotese om at EMSI ville kreve en eller flere Riis. Vi vurderte dette ved trans PC3-M og DU-145 humane PCA celler med endoglin, sammen med siRNA spesifikke for enkelte RII undergrupper: activin En reseptor typen IIA (ActRIIA), activin En reseptor typen IIB (ActRIIB), bein morfogenetiske protein reseptor typen II (BMPRII) eller transformerende vekstfaktor β reseptor type II (TGFβRII). For både PC3-M og DU-145-celler, endoglin undertrykker signifikant invasjon til 60% og 50% av kontrollceller, henholdsvis, og dette blir opphevet ved siRNA målretting ActRIIA eller BMPRII men ikke ActRIIB eller TGFβRII (figur 1A). For ytterligere å undersøke mekanismen av ActRIIA og BMPRII i å påvirke EMSI, studier fokusert på menneske PC3-M PCA celler. De utgjør en metastatiske fenotype [34] og er kjent for å uttrykke meget lave grunnlinjenivåer endoglin [14].
A) Effekten av type II-reseptorer på endoglin mediert undertrykkelse av invasjon (EMSI). PC3-M (venstre) eller DU-145 (til høyre) celler ble transient transfektert med tom vektor (Vec) eller med endoglin sammen med siRNA, som angitt. Følgende sirnas ble brukt: siNeg – ikke-måls negativ kontroll, si2A – rettet ActRIIA, si2B – mål ActRIIB, siBMP – mål BMPRII, siTGF – mål TGFβRII. Etter 48 timer ble celle invasjon målt. Data representerer gjennomsnittet ± SEM fra 3 uavhengige eksperimenter, hvert i replikater på 3. *, p≤0.05 sammenlignet med Vec /siNeg. Mikrografer er representative bilder av celler som har invadert gjennom Matrigel, ble farget for βgal, og avbildes (forstørrelse 100X). B) ActRIIA og BMPRII siRNA er bestemt. PC3-M-celler ble transient transfektert med endoglin sammen med de indikerte sirnas som i (A). Etter 48 timer mRNA-ekspresjon ble målt via QRT-PCR, normalisert til GAPDH, og uttrykt i forhold til siNeg-transfekterte celler (normalisert til 1,0). Data representerer gjennomsnittet ± SD av et enkelt eksperiment, utført i replikater på N = 2; lignende resultater ble oppnådd på en uavhengig forsøket (N = 2 replikater). *, P≤0.05 forhold til siNeg. C) ActRIIA og BMPRII siRNA undertrykker målet protein. PC3-M-celler ble transfektert med ActRIIA-myc (øvre panel) eller BMPRII-flagg (nedre paneler), så vel som med de indikerte sirnas, etterfulgt av Western blot for angitte proteiner. Dataene er fra et representativt eksperiment (n = 2 separate eksperimenter). D) Blokkering ActRIIA eller BMPRII ligandbindende hemmer EMSI. PC3-M-celler ble transient transfektert med tom vektor eller endoglin som ovenfor. Etter 2 dager ble cellene forbehandlet i 5 timer ligand feller består av ActRIIA eller BMPRII ekstracellulære domenet fusjonert til immunglobulin Fc-region (Fc-A2 eller Fc-B2 henholdsvis). Behandlingen fortsatte under den påfølgende gjennomføring av celle invasjon analyser. Data representerer gjennomsnitt ± SEM av 3 uavhengige eksperimenter, hver i gjentak av N = 3. *, p≤0.05 forhold til Vec /-.
Det er nær homologi blant TGFB Superfamily reseptorer. Det er derfor spesielt viktig å ta siRNA spesifisitet, som vi viser i figur 1B. Ved hjelp av sekvensspesifikke primere for hver reseptor, viser vi ved QRT-PCR som reseptoren spesifikk siRNA vesentlig slår ned målrettet reseptoren ved ≥60% i hvert tilfelle, uten signifikant modulering av ikke-target-reseptorer. Effekten og spesifisiteten av siRNA rettet mot ActRIIA og BMPRII ble neste demonstrert ved å måle effekter på proteinnivå. En endemisk problem innen feltet relatert til det faktum at antistoffer dannet mot et gitt TGFp super reseptorsubtypen har en tendens til å ha forholdsvis høye nivåer av kryssreaktivitet. Vi adressert dette ved co-transfeksjon celler med enten myc-merket ActRIIA eller FLAG-merket BMPRII, sammen med siRNA til individuelle Riis, etterfulgt av tag-spesifikke Western blot (figur 1C). På denne måten viser vi reseptor-spesifikke siRNA-mediert hemming av protein uttrykk til nesten ikke målbare nivåer for både ActRIIA og BMPRII.
Binding av ekstracellulære ligander til ActRIIA og BMPRII utgjør en avgjørende faktor for sin signalfunksjon. Vi har derfor antatt at hvis ActRIIA og BMPRII virkelig er viktige regulatorer av EMSI, da deres modulering av denne prosessen bør være avhengig av beslektede ligander, i det minste delvis. Vi er fast bestemt på at dette er faktisk tilfelle ved trans celler med endoglin, etterfulgt av å måle effekten på invasjonen når ekstracellulære beslektede ligander ble blokkert fra reseptor binding (figur 1D). Dette ble oppnådd ved å behandle cellene med rekombinante protein konstruksjoner, Fc-A2 eller Fc-B2, som består av den ActRIIA eller BMPRII ekstracellulære domener, respektivt, fusert til et immunoglobulin konstant domene, og dermed tjener som en ligand felle. Som det kan ses i figur 1D, blokkering av ligandbinding til reseptoren enten reverserer EMSI. Disse ligand-blokkerende studier utfylle våre knockdown studier. Til sammen våre funn implisere ActRIIA og BMPRII som viktige fysiologiske regulatorer av EMSI.
ActRIIA og BMPRII har motsatt Effekter på Nedstrøms Smad1 Signa
Vi har tidligere vist at endoglin øker fosforylering av Smad1, som Smad1 undertrykker celle invasjon, og det Smad1 er nødvendig for EMSI [14]. Vi vurderte derfor effekten av ActRIIA og BMPRII på regulering av Smad1 fosforylering. Dette ble gjort ved å slå ned ActRIIA eller BMPRII via transfeksjon av PC3-M-celler med siRNA mens co-trans med tom vektor eller endoglin. Fosforylering av Smad1 ble så vurdert ved Western blot (Figur 2A). Uavhengig av endoglin status, knockdown av ActRIIA reduserer fosfor-Smad1 nivåer. Overraskende, knockdown av BMPRII har motsatt effekt; det øker fosfor-Smad1. I likhet med de tidligere studier [31], er den endogene ekspresjon i endoglin PC3-M-celler så lavt som å nærme seg grensen for deteksjon.
PC3-M-celler ble transient transfektert med tom vektor eller endoglin og den indikerte siRNA som i figur 1. To dager senere ble cellene lysert for Western blot (A) eller luciferase-assay promoter (B). A) ActRIIA og BMPRII forskjellig regulere Smad1 protein fosforylering. Western blot den resulterende cellelysat ble utført for Smad1, fosfo-Smad1 /5 (pSmad1 /5), endoglin og GAPDH. Dataene er hentet fra et representativt eksperiment (N = 4 forsøk). B) ActRIIA og BMPRII forskjellig regulere BRE
2-luciferase aktivering. Cellene var også co-transfektert med BRE
2-luciferase og
Renilla
luciferasepreparater konstruksjoner, og luciferase aktivitet (normalisert til
Renilla
luciferase aktivitet) ble målt. Dataene er middelverdien ± SD fra et enkelt eksperiment utført i replikater på N = 2, utført tre ganger med lignende resultater (også N = 2). *, P≤0.05 mellom de angitte gruppene. C) BMP7- og BMP9 stimulert Smad1 fosforylering er ulikt regulert av ActRII og BMPRII. -Celler ble transfektert som ovenfor, serum-sultet og behandlet med BMP7 eller BMP9 som angitt. Western blot den resulterende cellelysat ble utført for fosfo-Smad1 /5 (pSmad1 /5) og total Smad1. Dataene er hentet fra et representativt eksperiment (N = 2 forsøk).
Vi har tidligere demonstrert i samme systemet vi bruker nå at primær indusert økning i endoglin uttrykk status indusere økning i både Smad1 fosforylering samt som i Smad1 transkripsjonen aktivitet, som målt ved hjelp av luciferase reporter-analyse ved bruk av Smad1-responsive BRE
2-luciferase reporter-konstruksjonen [14]. Viktigere, i samme system, vi har også vist hvordan flere ulike forstyrrelsene har uharmoniske effekter på Smad1 fosforylering og dets funksjonelle transkripsjonen aktivitet. Men i alle tilfeller, endringer i Smad1 transkripsjonen funksjon reflektert samstemmige effekter på biologisk funksjon, som evaluert ved tilhørende Smad1 knockdown studier samt invasjons assays [14], [32]. Mens mekanismen bak dette fenomen er ikke helt klar, synes det å reflektere det faktum at humane prostataceller inneholder svært høye nivåer av sur fosfatase, og at i løpet av cellelysis den har protein-spesifikke effekter som ikke kan være tilstrekkelig bringes under kontroll, selv med høy nivåer av fosfatase-hemmere [43]. Vi anser derfor vurdering av Smad1 transkripsjonen funksjon å være informativ analyse. Som sådan, gikk vi på å evaluere effekten av ActRIIA og BMPRII knockdown på BRE
2-luciferase aktivering (figur 2B). Igjen viser vi at, uavhengig av endoglin status, knockdown av ActRIIA reduseres betydelig Smad1 funksjon mens knockdown av BMPRII signifikant øker den. Disse funn er i overensstemmelse med Smad1 fosforylering dataene i figur 2A, og viser at endringer i Smad1 fosforylering er assosiert med endret Smad-mediert transkripsjon. Men de viser også at BMPRII-induserte effekter på Smad1 transkripsjonen funksjonen ikke er sammenfallende med BMPRII effekt på EMSI.
For å undersøke BMPRII videre, vi undersøkte effekter på signalering under forhold med bein morphogenic protein (BMP) ligand stimulering . ActRIIA og BMPRII ble slått ned som vist i figur 2A,-celler ble serum-sultet, simulert med enten BMP7 eller BMP9, og Smad1 /5 fosforylering vurdert ved Western blot (Figur 2C). Med enten BMP7 eller BMP9, knockdown av ActRIIA demper ligand-stimulert Smad1 /5 fosforylering, mens knockdown av BMPRII forsterker det. Ved å demonstrere en tilsvarende signalresponsprofil under betingelser med BMP ligand stimulering sammenlignet med den for vanlige dyrkningsbetingelser, er betydningen av BMP ytterligere understøttet. Disse funnene underbygge de i figur 1D, som viser at BMP ligand er nødvendig for EMSI.
Verken BRE
2-luciferase promoter system eller de tilgjengelige phospho-Smad antistoffer er i stand til å fullstendig skille mellom Smad1 , Smad5 og Smad8 isoformer. Vi vurderte derfor i hvilken grad disse andre Smad isoformer kunne redegjøre for tiden observerte effektene. Spesielt gitt at BMPRII knockdown uventet førte til det som så ut til å være økt Smad1 signalering, ønsket vi å undersøke muligheten for at BMPRII knockdown var økende Smad5 eller Smad8 signalering, potensielt maske et funksjonelt viktig nedgang i Smad1 signalering. Ved hjelp av gen-spesifikke QRT-PCR-analyse, må vi først vise at siRNA til de enkelte Smad isoformer er svært spesifikk og effektiv, betydelig stanse målrettet isoform med ≥90% i hvert tilfelle, samtidig som de har ingen signifikant effekt på ikke-target isoformer (Figur 3A). Vi neste søkt å finne ut hvilke Smads ble aktivert ved endoglin overekspresjon. Knockdown av Smad1 resulterer i nær totalt tap av spesifikt signal fra et antistoff som gjenkjenner fosfo-Smad1, 5 og 8 (figur 3B). Vi bekrefter at Smad1 protein uttrykk er effektivt undertrykt av siRNA til Smad1, men er ikke undertrykt av siRNA rettet mot Smad5 eller Smad8. Ved hjelp av et antistoff som gjenkjenner både fosforylert Smad1 og Smad5, viser vi at Smad5 er også fosforylert i nærvær av endoglin. Vi fortsatte med å vise at knockdown av Smad1 fører til en 90% reduksjon av endoglin-indusert økning i BRE
2-luciferase (Figur 3C). I motsetning til dette, endoglin-induserte økning i BRE
2-luciferase-aktivitet er redusert med bare 30% etter Smad5 knockdown, og ikke i det hele tatt ved Smad8 knockdown. Til slutt, som vi viser i figur 2 som BMPRII knockdown øker Smad1 aktivering, undersøkte vi effekten av Smad isoform undertrykkelse i møte med BMPRII knockdown i endoglin replete celler (Figur 3D). I likhet med funn i figur 3C, Smad1 knockdown opphever betydelig økt BRE
2-luciferase aktivitet oppnås ved BMPRII knockdown, mens Smad5 eller Smad8 knockdown har ingen signifikant effekt. Alle sammen de ovennevnte funn viser at ActRIIA øker Smad1 fosforylering og funksjon, mens BMPRII synker den.
