Abstract
En god prognose kan forventes for de fleste, men ikke alle, tilfeller av skjoldbruskkjertelen papillær kreft. Mange molekylære studier har vist gunstig behandling og prognostiske faktorer i ulike molekylære markører. Mens de fleste tidligere rapporter har fokusert på genomikk og proteomikk, har noen fokusert på lipidomics. Med bruk av massespektroskopi (MS), har det blitt mulig å identifisere mange typer molekyler, og dette analytisk verktøy er blitt kritisk innen omics. Nylig ble avbildning massespektrometri (IMS) utviklet. Etter en enkel forbehandling prosessen, kan IMS brukes til å undersøke vev seksjoner på glassplater med posisjonsinformasjon.
Her har vi gjennomført en IMS analyse av syv tilfeller av skjoldbruskkjertelen papillær kreft ved sammenligning av kreft med normalt vev, med fokus på fordelingen av fosfolipider. Vi har funnet ut at fosfatidylcholin (16: 0/18: 1) og (16: 0/18: 2) og sphingomyelin (D18: 0/16: 1) er signifikant høyere i skjoldbrusk papillær cancer enn i normalt vev i skjoldbruskkjertelen som bestemt ved tandem masse (MS /MS) -analyse. Disse fordelings forskjellene kan være assosiert med den biologiske oppførsel av skjoldbruskkjertelen papillær kreft
Citation. Ishikawa S, Tateya jeg, Hayasaka T, Masaki N, Takizawa Y, Ohno S, et al. (2012) økt uttrykk av Phosphatidylcholine (16: 0/18: 1) og (16: 0/18: 2) i skjoldbruskkjertelen papillær kreft. PLoS ONE 7 (11): e48873. doi: 10,1371 /journal.pone.0048873
Redaktør: Yunli Zhou, Harvard Medical School, USA
mottatt: May 18, 2012; Godkjent: 02.10.2012; Publisert: 06.11.2012
Copyright: © 2012 Ishikawa et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av en SENTAN støtte fra Japan Science and Technology Agency til MS (https://www.jst.go.jp/sentan/en/); en Grant-in-Aid for Scientific Research til MS (WAKATE-S: 20670004, https://www.jsps.go.jp); og et tilskudd fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi, Japan til IT og MK. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Thyroid kreft er den vanligste ondartet svulst i hodet og nakkeregionen. De histologiske typer skjoldbrusk kreft varierer, og inkluderer papillær karsinom (80% av alle skjoldbrusk kreft tilfeller), follikulær karsinom, medullær karsinom, og udifferensiert karsinom. Prognose varierer også avhengig av histologisk type. Udifferensiert karsinom har en dårlig prognose, med en 10-års overlevelse på 10-20% eller mindre, mens pasienter med andre histologiske typer, som for eksempel papillær karsinom, follikulær karsinom, og medullary carcinoma kan forvente gode resultater med en 10-årig overlevelse på 90%, 90%, og 70-80%, henholdsvis [1]. Men selv tilfeller av papillær carcinoma unngå å bli kontrollert på grunn av fjernmetastaser eller anaplastisk transformasjon. Det vil være nødvendig å sikkert forutsi anaplastic transformasjon før det skjer, og for å identifisere tilfeller av dårlig prognose blant papillær karsinom, for å forbedre den generelle prognosen av skjoldbruskkjertelkreft.
Utviklingen i genomikk og molekylær biologi har belyst på patogene mekanismer knyttet til skjoldbruskkjertelkreft [2]. Stor innsats har blitt gjort for å identifisere gener og biomolekyler som er forskjellig uttrykt i kreftvevet, som kan benyttes som biomarkører for å belyse skjoldbruskkjertelkreft patogenesen og veilede hensiktsmessig og målrettet molekylær terapi [3], [4], [5]. Flere kandidat gener (for TSH reseptorer, RET /PTC, Ras, BRAF, p53) i utviklingen av ulike typer skjoldbrusk kreft [2] har blitt identifisert så langt. I tillegg har noen gjort forsøk på å utnytte proteomikk som et verktøy for oppdagelse for thyreoideaneoplasmer. Lewis og medarbeidere rapporterte en forskjell på protein uttrykk mellom papillær thyroideakarsinom og normal skjoldbruskkjertelen vev ved hjelp av massespektrometri (MS) [6]. Imidlertid er mekanismen for malign transformasjon ikke godt forstått, spesielt på proteinnivået.
Lipider er assosiert med cellemembranstrukturen, proliferasjon [7], differensiering, metabolsk regulering, inflammasjon [8], og immunitet. Det er viktig å forstå forholdet mellom tumoren og lipider i diagnose og behandling. Lipider, særlig fosfolipider (PL), spiller en viktig rolle i sammensetningen av cellemembranen. Det er generelt akseptert at membranegenskapene blir bestemt av komponentene til PL arter, og sammensetningen av disse artene er strengt bestemt av komponentene til fettsyre arter [9], [10]. Noen rapporter utført hittil har fokusert på lipider, spesielt bindende fettsyrer i hode og nakke kreft; Men til dags dato, ingen metode har blitt utviklet som muliggjør påvisning av binding fettsyrer i PL.
Imaging massespektrometri (IMS) er et kraftig, nyutviklet verktøy som identifiserer fordelingen av kjente /ukjente molekyler på en vev seksjon [11], [12], [13]. Laser scanning muliggjør nøyaktig, todimensjonal MS på objektglass. Foreløpig er IMS det eneste verktøyet som gjør det mulig for visualisering av bindingen av fettsyrer til PL på vevssnitt, og dette neste generasjons tilnærming er å tiltrekke betydelig oppmerksomhet.
Hensikten med denne studien var å bruke IMS for å belyse hvilken PL-bundne fettsyrer var de viktigste komponenter i cellemembraner, og spesielt hvilke som ble uttrykt ved relativt høye nivåer i skjoldbruskkjertelen papillær kreft. Denne studien var den første til å etterforske tilfeller av PL i skjoldbruskkjertelkreft ved hjelp av IMS analyse, og den første til å lykkes identifisere PL som er høyt uttrykt i skjoldbruskkjertelen.
Resultater
1. IMS analyse av saken en
regioner av interesse (ROI) i kreft og normale regioner ble definert i henhold til hematoxylin og eosin (HE) -staining resultatene av en vev seksjon ved siden av delen som brukes for IMS analyse. Figur 1A gir HE-flekker resultater for saken en stund Figur 1B viser forstørret representative områder av kreft og normalt vev. Kreftcellene hadde en høy cytoplasma ratio og vises atom funksjoner karakteristisk for papillær skjoldbruskkjertelkreft. Histologiske funn av skjoldbruskkjertelen papillær kreft besto av søyle thyroidal epitel satt i papillær projeksjon. Den normale tyroideavev er sammensatt av mange sfæriske hul sekker som kalles skjoldbrusk follikler.
(A) Thyroid papillær kreft vev ble lokalisert på venstre side, og normal tyroideavev ble lokalisert på høyre side (opprinnelig forstørrelse 40 ×). Den stromal regionen ble ekskludert. Avkastningen ble bestemt ut fra de tilsvarende HE-flekker resultater. De svarte boksene indikerer representant regionen av kreft og normal skjoldbruskkjertelen vev. (B) Forstørret representative områder av kreft og normalt vev (original forstørrelse 200 ×). Kreftcellene hadde en høy cytoplasma ratio og vises atom funksjoner karakteristisk for papillær skjoldbruskkjertelkreft. Histologiske funn av skjoldbruskkjertelen papillær kreft besto av søyle thyroidal epitel satt i papillær projeksjon. Den normale tyroideavev er sammensatt av mange sfæriske hul sekker som kalles skjoldbrusk follikler.
Figur 2 viser spektra fra tilfelle en vev med paneler A og B avledet fra kreft og normale regioner, henholdsvis. Begge spektrum er gjennomsnitts spektrum, og ble hentet fra avkastningen i kreft og normalt vev. Antallet beregnede punkter i kreft og normalområdet var 1425 og 258, respektivt. Den horisontale aksen angir masse-til-ladning-forhold (
m /z
) og den vertikale akse angir den relative overflod av ionet. Den mest intense ion er tilordnet en overflod av 100, og blir referert til som basistopp. De fleste ioner dannet i en massespektrometri har én lading, slik at
m /z
verdi tilsvarer massen selv.
(A) Spectrum av kreft regionen og (B) spektrum av normalområdet. Hver spekteret ble i gjennomsnitt fra avkastningen av kreft og normalt vev i Figur 1. Hvert tall vist i tabell 1 ble beregnet ved hjelp av disse spektra.
Tabell 1 viser de 50 topp plukke resultater for case 1 ( unntatt isotopiske topper) som ble statistisk analysert. Cancer og normal intensitet betyr at den gjennomsnittlige (± standardfeil) intensitet som ble delt av avsøkningspunktet i kreft og normale områder. Welch t-test ble utført mellom den midlere intensitet av kreft og normale områder.
m /z
verdiene i Tabell 1 er listet opp i rekkefølge av intensitet i kreft regionen. Tallet på
m /z
verdier uten isotopiske toppene var 40, og antallet av de verdiene med signifikante forskjeller var 26. Alle
m /z
verdiene i tabell 1 ble tildelt bruker spektrum vist i figur 2A og B.
2. Visualisering av molekylære fordeling i skjoldbruskvevet i tilfelle en
Figur 3 viser ion bildet som ble visualisert ved hjelp av
m /z
verdiene vist i Tabell 1. Utvalget av hvert ion fargebilder var optimalisert manuelt, slik at toppene har ulike fargeområder. Generelt ble ondartet celleproliferasjon stimulert på grunn av cellevekstfaktorer, som induserer en økning i celletetthet og komponenter av kreftceller som for eksempel PL. Derfor, mens intensiteten av alle
m /z
verdier bør være høyere hos kreft regioner, intensiteten av noen verdier (i særdeleshet,
m /z
772,5, 782,5 og 848,5) in cancer regionene var lavere.
visualisert ion bilder svarende til de resultater som er vist i tabell 1. i alle bildene, er det kreftvev på venstre og normalt vev er på høyre side. Fordelingen av intensiteten for hver
m /z
verdi var ikke konstant i cancer og normal tyroideavev.
3. Sammenligning av resultatene i alle tilfeller
På samme måte som tilfellet en, topp plukking og statistisk analyse ble utført på alle tilfeller. Tabell 2 viser de 50 mest aktive plukke resultater og utelukker isotoper topper.
m /z
verdier viser ingen signifikante forskjeller ble ekskludert. Tre
m /z
verdier *, inkludert
m /z
798,5, 796,5 og 741,5, ble funnet å være felles for alle tilfeller.
Den vanlige
m /z
verdier i alle tilfeller vises i figur 4. Rois av kreft og normalt vev i alle tilfeller ble beskrevet i HE-farget resultater for alle tilfeller. Intensiteten av nesten alle
m /z
verdiene var høyere i kreft regionen i forhold til normal thyroid regionen. Bare intensiteten distribusjon av
m /z
741,5 differensiert dem fra de andre.
Den avkastningen av hvert tilfelle er definert ved en stiplet linje i HE-flekker bilder. Intensiteten av alle verdier i kreft-regionen var høyere enn hos normale områder. Fordelingen av intensitet i
m /z
741,5 var forskjellig fra fordelingen av intensitet i den andre
m /z
verdier.
4. Molekyl identifikasjon
De tre vanligste
m /z
verdier i alle tilfeller ble underkastet tandem masse (MS /MS) analyse for å identifisere strukturer av biomolekyler forbundet med forløper-ioner. (Figur 5). Den Metabolitt MS søk (https://www.hmdb.ca/labm/jsp/mlims/MSDbParent.jsp) ble anvendt for å registrere.
(A) MS /MS-data for
m /z
798,5. Strukturen av en topp ble analysert. Produktet ion spekteret av
m /z
798,5 som en forløper ion ble oppnådd ved MS /MS av skjoldbruskkjertelen papillær kreft regionen. Dette biomolecule ble identifisert ved nøytral tap som [PC (16: 0/18: 1) + K]
+. På samme måte, (B)
m /z
796,5 ble identifisert som [PC (16: 0/18: 2) + K]
+. (C)
m /z
741.5 ble identifisert som [SM (D18: 0/16: 1) + K]
+
I MS /MS for PL. med kationer er visse karakteristiske fragment topper ofte oppdages. Toppen ved
m /z
798,5 (figur 5A) ble identifisert som fosfatidylcholin (PC) på grunn av den nøytrale tap av 59 Da og 183 Da i løpet av MS /MS, noe som er en indikasjon på PC [14], [ ,,,0],15]. I mellomtiden, den nøytrale tapet av 256 Da tilsvarte palmitinsyre. Den type kation tilleiret til et biomolekyl er vanligvis enten et natrium- eller kalium-ion, når prøven er hentet fra biologisk vev. Det ble observert en forskjell på 38,0 mellom
m /z
577,5 og 615,5, noe som er konsistent med utskifting av en kalium-ion (molekylvekt 39,10) med et proton (molekylvekt, 1,01). Ifølge en metabolitt MS søk, jo topp på
m /z
798,5 indikerer [PC (16: 0/18: 1) + K]
+. På samme måte, konkluderte vi med at
m /z
796,5 samsvarer [PC (16: 0/18: 2) + K]
+ (figur 5B)
. resultatene av
m /z
741.5 viste topper av
m /z
682,4 og 558,4 (figur 5C). Toppen på
m /z
682,4 samsvarer nøytral tap av trimetylamin (59 Da), og topp på
m /z
577,5 samsvarer nøytral tap av trimetylamin (59 Da) og cyclophosphate (124 Da). Toppen på
m /z
184 samsvarer trimetylamin (59 Da), cyclophosphate (124 Da) og et proton ion (1 Da). Resultatene indikerte at
m /z
741,5 inneholdt et alkalimetall addukt phosphocholine; Derfor
m /z
741,5 var en PC eller sphingomyelin (SM) arter. Anvendelse av nitrogen regel til fosfolipider, odd nominell masse indikert SM på grunn av tilstedeværelsen av en ytterligere nitrogen i sfingosin av SM. Vi konkluderte derfor at
m /z
741,5 var en SM arter. Metabolitten MS søke faktisk foreslått at
m /z
741,5 samsvarer [SM (D18: 0/16: 1) + K].
+
Diskusjoner
for mer enn et århundre, har patologiske undersøkelser vært den primære og viktigste verktøy for diagnostisering av kreft regioner. Kreft klassifiseringen selv har blitt etablert basert på resultatene av klassiske fargemetoder som HE flekker, og slike metoder vil fortsette å spille en ledende rolle i kreftdiagnose. Imidlertid bør begrensningene til klassifisering basert på klassiske farge resultater noteres. Det er ofte slik at pasienter med samme patologisk diagnose ikke alltid har den samme prognose. Diagnoser er ofte laget basert på morfologi. Ved bruk av vanlige patologiske teknikker, kan vi bare utføre morfologiske observasjoner, og det er vanskelig å avdekke detaljer av komponentene i vevssnitt.
In situ hybridisering
og /eller immunhistokjemi analyser muliggjøre analyse av distribusjonen av kjente molekyler; Det har imidlertid vært umulig å undersøke fordelingen av ukjente molekyler. For en detaljert og nøyaktig diagnose, er det nødvendig å innhente informasjon om komponenter som spesifikke proteiner og lipider i en prøve.
Som en viktig teknikk i proteome generasjon post-genomet era, MS har blitt mye brukt i en rekke medisinske felt for diagnose og behandling av forskjellige sykdommer, inkludert kreft. Mange nye biomarkører blitt identifisert så langt ved hjelp av MS, som siden har blitt utvidet til å omfatte IMS [11], [16], en teknikk som gjør det mulig for analyse og visualisering av fordelingen av individuelle biomolekyler i ethvert område av et vev delen [17] . Dermed er denne tilnærmingen potensielt av stor betydning.
En IMS sekvens skaper en rekke spektre. For å få gyldig informasjon fra disse spektrum, vi utførte tillegg av et addukt ion. I biologisk vev, lipider har en tendens til å bli positivt ladet av et proton, natrium, og kalium-ion, noe som indikerer at fordelingen av den positive ion påvirker fordelingen av lipider; forskjellige verdier har en tendens til å bli oppnådd i IMS analyseresultater. I denne studien, tilsatte vi kaliumsalt til matriksen basert på rapporter om Sugiura og medarbeidere som selektivt analysert PC med forskjellige fettsyresammensetninger ved tilsetning av kaliumsaltet til matriseoppløsningen [18]. Når tilsatt til matrisen, kaliumsaltoppløsningen forårsaket en sammenslåing av forskjellige ione-addukter (addukter med proton, natrium og kalium) til én enkelt potassiated art. Denne tilnærmingen gjorde oss i stand til å redusere en rekke topper og gjort det lettere å identifisere molekyler av interesse.
I forrige rapport, vi demonstrert muligheten for IMS som et verktøy for analyse av patologiske prøver [19]. Vi viste at IMS kan brukes til å profilere biologiske molekyler, inkludert undergrupper av PL. Vi fokuserte på distribusjon av PL i skjoldbruskkjertelen papillær kreft. PL er til stede som en bestanddel av cellemembranen, og er også uttrykt i kreftvevet. Intensitetene for de fleste
m /z
verdier i kreft regioner er høyere enn de hos normale regioner; imidlertid intensiteten av noen verdier (
m /z
772,5, 782,5 og 848,5) hos kreft regioner er lavere enn den i vanlige områder av vev (se figur 2 og tabell 1). Generelt ble ondartet celleproliferasjon stimulert på grunn av cellevekstfaktorer, som induserer en økning i celletetthet og komponenter av kreftceller som for eksempel PL. PL består av utallige kombinasjoner av lipider som er basert på lengden, grad av acylkjede metning, og den polare hodet gruppe. Figur 2 viser at det kan oppstå disse forskjellene i intensitet fra fordelingen av skjoldbrusk kreft-spesifikke fettsyrer som er knyttet til PL.
I brystkreft, PL, spesielt PC-er, i kreftvev ble rapportert å ha en forholdsvis høyt nivå av linolsyre (18: 2), og lave nivåer av stearinsyre (18: 0) [20] og oljesyre (18: 1) [21], sammenlignet med normalt brystvev. Luisa
et al.
Identifisert mønsteret i PL mønster og klasseforskjeller i brystkreftceller [22]. I sin rapport, kreftceller viste en høy relativ overflod av PC (16: 0/18: 1) og PC (18: 1/18: 1) tilsvarende [MH]
+ på
m /z
760 og 786. for SM, SM (18: 1/16: 0) tilsvarende [MH]
+ på
m /z
703 ble påvist hovedsakelig i kreftceller
en annen tidligere rapport viste at mRNA av 1-acylglycerol-3-fosfat-O-acyltransferase (AGPAT) 11 som effektivt bruker LPA (18: 1) som en acyl-akseptor og fettsyren 18: 1 som en acyl-donor er betydelig oppregulert i menneskelig brystkreft og livmorhalskreft [23]. Våre resultater viser at
m /z
798.5 topper inneholder fettsyren C18: 1, og de er uttrykt sterkt i skjoldbruskkjertelen kreft regioner. Mens en tidligere studie avslørte utvalg av spesifikke fettsyrebindende PL, gir vi mer informasjon om de relative endringene i PL i skjoldbruskkjertelen papillær kreft.
I figur 4, distribusjon av intensiteten i
m /z
741,5 tilsvarte [SM (D18: 0/16: 1) + K]
+, og er forskjellig fra den intensitetsfordelingen i de andre med unntak av tilfellet 1 og 5. HE-farging resultatene viste at området der
m /z
741,5 intensitet uttrykkes sterkt i hovedsak besto av stromale og kreft regioner. Vi rapporterte at intensiteten uttrykt SM var høyere i kreft og stromale regioner enn i normale områder i en studie av tykktarmskreft levermetastaser [19]. Vår resultat var i samsvar med denne rapporten
Stearoyl-CoA-desaturase 1 (Scd1) er det hastighetsbegrensende enzym i den cellulære syntesen av enumettede fettsyrer, inkludert C18:. 1, fra mettede fettsyrer. Falvella
et al.
Rapporterte at Scd1 genet overekspresjon er assosiert med hepatocarcinogenesis i mus [24]. Scaglia
mfl.
Rapporterte at hemming av Scd1 uttrykk i humane lungekreftceller svekker tumorigenesis, mens frekvensen av apoptose ble løftet [25]. Disse rapporter indikerer at Scd1 fører til en økning i C18:. 1 i kreftvevet
Den type fettsyre påvirkninger celleform og cellemembranen fluiditet [9]. De endringer av kreftcellemembran fluiditet kan påvirke den biologiske oppførsel av kreft, slik som invasjon /metastasering. IMS er det eneste verktøy som gjør det mulig for visualisering av bindingen av fettsyrer til PLS på vevssnitt. Nylig har et økende antall rapporter fokusert på forholdet mellom patologiske fornærmelser og PL, inkludert PC-er [26], dvs. ombygging vei av PL [27]. Det er forventet at IMS analyse vil bidra til å oppnå en bedre forståelse av forholdet mellom fettsyrer og kreftmekanismer.
Ved hjelp av IMS, vi direkte profilert PC og SM uttrykk fra vevsprøver. Denne utforskende profilering av PL på grunnlag av IMS analyse gitt resultater som understreker potensialet i IMS for patologiske diagnoser. Den potensielle anvendelse av IMS analyse i den kliniske arbeidsflyten er blitt foreslått i en tidligere rapport [28]. Sammenlignet med konvensjonelle metoder slik som MS og immunhistokjemi, har IMS visse fordeler som et klinisk anvendelse. Eksempel rensing og utvinning er nødvendig før MS-analyse. I tillegg utførelsen av et antistoff-baserte analysen i immunhistokjemi er alltid degradert til lett observerte endringene i intensitet eller lokalisering. På den annen side krever IMS analyse bare en enkel forbehandling, dvs. matrise avsetning og fiksering av tilstands innstillinger IMS. Dette betyr at tiden ikke går tapt mellom prøvetaking og analyse. Det er spådd at IMS vil bli lett introdusert i patologisk undersøkelse innstillingen.
Nyere studier har gitt holdepunkter for de kliniske fordelene med IMS analyse, nemlig at dets profiler diskriminere mellom andre sykdommer og prostata kreft [29] og HER2-status av brystkreft [30]. I disse rapportene, IMS aktivert klassifisering av morfologiske og diagnostiske egenskaper. En nylig utviklet variant av IMS analyse, referert til som «målsøkt billeddannende massespektrometri» (TIMS), ble beskrevet av thiery og medarbeidere [31]. En slik målrettet analyse muliggjorde visualisering av molekyler av interesse direkte fra vevet seksjonen ved bruk av laser-reaktive photocleavable molekyl koder knyttet til antistoffer. Denne tilnærmingen gir kvantifiseringen ved å estimere signalstyrken, og et utmerket signal-til-støy-forholdet i de resulterende spektrum. Det er viktig å merke seg at denne diagnosen ble laget på en enkelt prøve seksjon; få kreft biopsier var tilgjengelige, og flere ville være nødvendig for å kvantifisere en biomarkør ved IHC. I fremtiden vil IMS analyse gi nye biomarkører og i sin tur, nye patologiske kategorier, og kan derfor bli et viktig diagnostisk verktøy i klinisk setting.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Prøvetaking og arkivering av pasientdata ble utført ved hjelp av skriftlig informert samtykke, og ble godkjent av etisk komité av Kyoto University. Denne studien ble utført i henhold til Kyoto-universitetet retningslinjer for patologisk prøvehåndtering.
1. Prøveopparbeidelse
Syv japanske pasienter som gjennomgikk rutine thyroidectomy ved Kyoto universitetssykehus var involvert i denne studien. Seks kvinner og en mann ble inkludert og gjennomsnittlig pasientens alder var 52 år. Det var ingen tilbakefall i alle tilfeller. Prøvene ble oppnådd fra en skjoldbrusk kreft seksjon og tilstøtende normalt vev umiddelbart etter tumor-reseksjon. Den patologisk diagnose var papillær thyroideakarsinom. Den oppnådde Vevet ble frosset i flytende nitrogen umiddelbart for å minimalisere nedbrytning og ble holdt ved -80 ° C. Vevssnittene ble skåret i skiver med en tykkelse på 10 um ved hjelp av en cryostat (CM 1950, Leica, Wetzler, Tyskland). En del ble montert på en indium-tinn-oksid-belagt (ITO) glass lysbilde for IMS analyse. En annen seksjon ved siden av den som brukes for IMS ble montert på en glassplate (MAS frakk, Matsunami, Osaka, Japan) for HE farging å identifisere kreft og normal skjoldbrusk regioner
2.. Matrise avsetning
matriseoppløsning ble fremstilt ved oppløsning av 50 mg 2, 5-dihydroksybenzosyre (DHB; Bruker Daltonics, Leipzig, Tyskland) i 1 ml 70% metanol og 10 mM kaliumacetat. DHB er en mye brukt matrise for lavmolekylære molekyler. Tilsetningen av kaliumsaltet til matriseoppløsningen forårsaket en sammenslåing av forskjellige ione-addukter til én enkelt potassiated art. Denne tilnærmingen gjort oss i stand til å redusere antallet av topper og forenklet identifisering av molekyler av interesse. Et tynt matrise lag ble påført på overflaten av vevet seksjoner ved hjelp av et 0,2 mm munnstykke Spraymaling (Procon Boy FWA platina, Mr. hobby, Tokyo, Japan) som ble holdt ved 15 cm fra vevsoverflaten. Den totale mengde av matriseoppløsning på hvert objektglass var 1 ml. Den sprøyteteknikk aktivert fullstendig matrise dekning over hele vevet overflate, og tilrettelagt co-krystalliseringen av matriksen og biomolekyler.
3. Imaging massespektrometri analyse
vevssnitt ble analysert ved hjelp av en matrise-assistert laser desorpsjon /ionisering-time-of-flight /time-of-flight (MALDI-TOF /TOF) -type instrument, Ultraflex II TOF /TOF (Bruker Daltonics), som var utstyrt med en 355-nm Nd: YAG-laser ved 200 Hz repetisjon. Data ble kjøpt i positiv-ion-modus bruker en ekstern kalibreringsmetode med ioner fra DHB, angiotensin II og bradykinin. Deres nedbrytningsprodukter fra dekket
m /z
100 til 1200. kalibreringsproteiner ble avsatt på overflaten av prøvemateriale. Hver rasterscan ble utført automatisk i regionene i kreft og normalt vev. Intervallet mellom datapunktene var 100 mikrometer, og 100 laserstråle skudd ble bestrålt på hvert datapunkt. De massespektrometri parametrene var optimalisert manuelt for å oppnå den høyeste følsomhet med
m /z
verdier i størrelsesorden 400-900. Alle spektra ble ervervet automatisk ved hjelp flexImaging 2.1-programvaren (Bruker Daltonics), og filformatet ble konvertert for å muliggjøre analyse med Biomap (https://www.maldi-msi.org) og SIMtools programvare (in-house programvare; Shimadzu Corporation) . Den ion bildet ble visualisert ved hjelp Biomap programvare.
4. Sammenligning av signal intensiteter mellom kreft og normal skjoldbrusk regioner
IMS analyseresultater ble integrert, og avkastningen i kreft og normal skjoldbruskkjertelen vev ble definert som tilsvarer HE resultater ved hjelp SIMtools programvare. De 50 toppene med unntak av isotopiske topper ble plukket fra ROI som ble definert som kreft i skjoldbruskkjertelen og normal region, og den statistisk forskjell ble bestemt ved Welch t-test. Forskjeller med p 0,01 ble betraktet som signifikant
5.. Sammenligning av resultatene for alle tilfeller
Vi utførte IMS og statistisk analyse på alle saker, og plukket
m /z
verdi som hadde signifikant høyere uttrykk i kreft regioner og var vanlig i alle tilfeller.
6. Molekylær identifisering
De vanligste
m /z
verdier i alle tilfeller ble ansatt for MS /MS-analyse for molekyl identifikasjon. MS /MS-analyse ble utført på vevssnitt i positiv-ion-modus ved hjelp QSTAR Elite (Applied Biosystems /MDS Sciex, Foster City, CA, USA), en hybrid kvadrupol /TOF massespektrometer utstyrt med en ortogonal MALDI kilde og en pulset Nd : YAG laser. Metabolitten MS søk ble anvendt for å bestemme molekylarter PL. Matrisen oppløsning ble fremstilt på samme måte som for IMS analyse. De massespektrometri parametrene var optimalisert manuelt for å oppnå den høyeste følsomhet med m /z-verdier i området 100-850.
