Abstract
Lungekreft er fortsatt en ledende årsak til død på grunn av sin metastaser til fjerne organer. Vi har undersøkt effekten av honokiol, et bioaktivt bestanddel fra
Magnolia
plante, på human ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellemigrasjon og de molekylære mekanismene bak denne effekten. Ved anvendelse av en
in vitro
celle migrasjon analysen, har vi funnet at behandling av A549, H1299, H460 og H226 NSCLC-celler med honokiol resulterte i inhibering av migrering av disse cellene på en dose-avhengig måte, noe som var forbundet med en reduksjon i nivåene av cyklooksygenase-2 (COX-2) og prostaglandin E
2 (PGE
2). Celecoxib, en COX-2-hemmer, også hemmet celle migrasjon. Honokiol hemmet PGE
2-forbedrede migrering av NSCLC-celler, inhiberte aktiveringen av NF-kB /p65, en oppstrøms regulator av COX-2, A549 og H1299-celler, og behandling av celler med koffeinsyre fenetyl- ester, en inhibitor av NF-kB, også hemmet migrasjon av NSCLC celler. PGE
2 har blitt vist å aktivere β-catenin signalering, noe som bidrar til kreftcellemigrering. Derfor sjekket vi effekten av honokiol på β-catenin signalering. Det ble observert at behandling av NSCLC-celler med honokiol nedbrutt cytosoliske β-catenin, redusert atom akkumulering av β-catenin og nedregulert matriks-metalloproteinase (MMP) -2 og MMP-9, som er de nedstrøms mål for β-catenin og spiller en avgjørende rolle i kreftcelle metastaser. Honokiol forbedrede: (i) nivåer av kasein kinase-1α, glykogensyntasekinase-3β, og (ii) fosforylering av β-catenin på kritiske rester Ser
45, Ser
33/37 og Thr
41. Disse hendelsene spiller viktige roller i degradering eller inaktivering av β-catenin. Behandling av celekoksib også redusert kjernekraft akkumulering av β-catenin i NSCLC celler. FH535, en hemmer av Wnt /β-catenin vei, hemmet PGE
2-forbedret celle migrasjon av A549 og H1299 celler. Disse resultatene indikerer at honokiol hemmer ikke-småcellet lungekreft celler migrasjon ved å målrette PGE
2-mediert aktivering av β-catenin signal
Citation. Singh T, katiyar SK (2013) Honokiol hemmer Ikke- småcellet lungekreft Cell migrasjon av målretting PGE
2-mediert aktivering av β-catenin signale. PLoS ONE 8 (4): e60749. doi: 10,1371 /journal.pone.0060749
Redaktør: Xianglin Shi, University of Kentucky, USA
mottatt: 02.01.2013; Godkjent: 02.03.2013; Publisert: 08.04.2013
Copyright: © 2013 Singh, katiyar. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble finansielt støttet av Veterans Administration Merit omtale Award (1I01BX001410-01, SKK). Virkemiddelapparatet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
Lungekreft er ansvarlig for flere dødsfall i USA hvert år enn bryst, tykktarm og prostata kreft kombinert, og dermed har en enorm innvirkning på menneskers helse og helseutgifter [1]. Ett av tre kreftrelaterte dødsfall skyldes lungekreft, og har ingen forbedring i løpet av de siste ca 30 år [2], [3]. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for ca 80% av alle typer lungekreft og inkluderer adenokarsinom, plateepitelkreft og store celle karsinom [4], [5]. Cyklooksygenase-2 (COX-2) er ofte konstitutivt oppregulert i forskjellige humane kreftformer, inkludert lungekreft [6] – [10]. Selv om flere genetiske endringer er nødvendig for lungekreft og dens utvikling, er COX-2 anses som et sentralt element i orkestre lunge kreftutvikling. COX-2 er et induserbart enzym og genererer prostaglandiner (PG) ved dets virkning på arachidonsyre. Blant PGS, er PGE
2 regnes som den mest effektive metabolitt eller inflammatorisk megler som antas å spille en sentral rolle i kreft vekst, progresjon, invasjon og metastasering. Studier i tykktarmskreft, hvor COX-2 er spontant overuttrykt, har avslørt en kobling mellom COX-2 /PGE
2 og β-catenin signalering som bidrar til veksten av kreft i tykktarmen [11]. Smith et al [12] har vist at ultrafiolett stråling-indusert COX-2 uttrykk og PGE
2 produksjonsresultater i økt aktivering av β-catenin signalering. Det finnes rapporter som tyder på at COX-2 /PGE
2 /β-catenin akse eller koblingen er assosiert med lungekreft metastase [13] den. β-catenin er en 90 kD cytosolprotein og fungerer som en viktig del av Wnt veien. I fravær av wnt ligander, er β-catenin rekruttert til fosforylering /ødeleggelse komplekset, som inneholder tumor suppressor, adenomatøs polypose coli (APC) og Axin. Ødeleggelsen Komplekset letter fosforyleringen av β-catenin av glykogen syntase kinase 3β og kasein kinase (CK1) som fører til nedbrytning av proteasomal β-catenin. Hvis β-catenin ikke fosforyleres deretter N-terminalt un-fosforylert β-catenin akkumuleres i cytosol, går det inn i kjernen og virker sammen med transkripsjonsfaktorer, slik som T-celle-faktor, for å aktivere transkripsjon av mål-gener som er assosiert med celleoverlevelse , spredning og metastase [14] – [16]. Siden, er lungekreft en svært ondartet kreft med en potent evne til å metastasere fjernt og en viktig årsak til kreftrelaterte dødsfall, en tilnærming som reduserer sin metastatisk evne kan bidra til utvikling av en effektiv strategi for sin behandling og /eller forebygging.
phytochemicals av terapeutiske verdier tilby lovende muligheter for utvikling av effektive strategier for forebygging av svulst celle migrasjon, invasjon og metastasering. Honokiol (C
18H
18O
2, figur 1A) er en lovende bioaktive bestanddel av barken på
Magnolia
planter som har blitt brukt i tradisjonell japansk medisin for behandling av enkelte plager på grunn av sin antitrombotiske, antidepressive og anti-bakterielle egenskaper [17]. Anti-kreftfremkallende virkninger av honokiol har vært undersøkt i en rekke forskjellige kreftcellelinjer, så vel som i noen tumormodeller og oppviser ingen åpenbar toksisitet
in vivo product: [18] – [25]. Våre undersøkelser har også vist at honokiol utøver kjemopreventive virkninger på ultrafiolett strålings-indusert hudkreft og at denne effekten er forbundet med sine målrettet mot inflammatoriske mediatorer, som for eksempel COX-2 og PGE
2 [25]. Lite er imidlertid kjent med hensyn til om honokiol mål invasjon eller metastatisk potensial av lungekreftceller. Som lungekreft er svært metastatisk, forsøkte vi å bestemme kjemoterapeutiske effekten av honokiol på lungekreft cellemigrasjon eller invasjon ved hjelp av ulike lungekreft cellelinjer som
in vitro
modell. I den foreliggende kommunikasjons, vi utforsket kjemoterapeutiske effekten av honokiol på migrasjon /invasiv potensialet av humane NSCLC-celler og undersøkt om inhiberende effekt av honokiol på cellemigrering er forbundet med inaktivering av β-catenin signalering, og om PGE
2 har noen rolle i denne prosessen. For dette formålet ble fire forskjellige NSCLC cellelinjer valgt: A549, H1299, H460 og H226. Normal human bronkial epitelcellelinje (BEAS-2B) ble anvendt som en kontroll. Her presenterer vi bevis for at honokiol hemmer invasiv potensialet i NSCLC cellelinjer ved å målrette PGE
2-mediert aktivering av β-catenin signalering.
(A) molekylære strukturen av honokiol, et bioaktivt phytochemical fra
Magnolia
anlegget. (B) Et cellemigrering potensial av forskjellige NSCLC-cellelinjer ble bestemt ved anvendelse av en Boyden kammer assay. Like mange kreftceller ble lastet inn i det øvre kammer av Boyden kammere, inkubert i 24 timer, og migrerende celler ble detektert på membranen etter farging med krystallfiolett. (C) den vandrende celler ble tellet, og resultatene er uttrykt som gjennomsnittlig antall trekk celler ± SD /valgt mikroskopisk felt, n = 3, forstørrelse:. X 10
Materialer og Metoder
Reagenser og antistoffer
Renset honokiol ble kjøpt fra Quality phytochemicals, LLC (Edison, NJ). Boyden Chambers og polykarbonat-membraner (8 um porestørrelse) for cellemigrasjon analyser ble erholdt fra Neuroprobe (Gaithersburg, MD). De antistoffer som er spesifikke for β-catenin ble kjøpt fra R Santa Cruz, California) etter produsentens protokoll. I korthet, 2 x 10
5-celler /brønn ble sådd ut i en 6-brønns plate og tillatt å vokse opp til 70% konfluens. COX-2 siRNA blanding med transfeksjon reagenser ble lagt over cellene i ca. 6 timer i en inkubasjon kammeret og overført til 2 x vekstmedium i ca. 20 timer. Ved 24 timer etter transfeksjon, ble friskt medium tilsatt og cellene ble inkubert i ytterligere 48 timer som beskrevet tidligere [29]. Deretter ble cellene høstet og underkastet cellemigrering analysen. Knockdown av COX-2 uttrykk i A549 og H1299 celler etter transfeksjon ble bekreftet som beskrevet tidligere [29].
Western Blot analyse
NSCLC-celler ble behandlet med eller uten honokiol eller andre agenter interessen for ønsket tidsrom, deretter ble cellene høstet, og lysert med iskald lyseringsbuffer supplert med proteaseinhibitorer, slik som beskrevet tidligere [26], [30]. Proteiner ble elektrofore løst på 8-10% Tris-glysingeler og overført på en nitrocellulosemembran. Etter blokkering av ikke-spesifikke bindingsseter, ble membranen inkubert med det primære antistoff ved 4 ° C over natten. Membranene ble vasket og deretter inkubert med peroksidase-konjugert sekundært antistoff og de spesifikke proteinbånd ble påvist ved hjelp av den forbedrede Chemiluminescence reagenser. For å verifisere lik belastning av proteiner på de gels, ble membranen strippet og reprobed med enten anti-β aktin eller anti-histon H3 antistoff.
Statistical Analysis
For celle migrasjon analyser, data i kontrollgruppen ble sammenlignet med honokiol-, PGE
2 eller celekoksib-behandlingsgruppene separat ved hjelp av enveis variansanalyse (ANOVA) med GraphPad Prism versjon 4.00 for Windows-programvare (GraphPad Software, San Diego, California. www. graphpad.com.). Alle kvantitative data er vist som gjennomsnitt ± SD. I hvert fall
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
komparativ analyse av invasiv Potential of Human NSCLC Cells
Først må vi bestemmes den komparative invasiv potensialet i ulike NSCLC cellelinjer, slik som A549, H1299, H460 og H226, bruker Boyden kammeret analysen. Inkubering av NSCLC-celler i 24 timer i Boyden kammer resulterte i et større antall migrering av celler som gjenspeiler deres invasivitet. Representative mikrofotografier av krystall-fiolett-farget celler er vist i figur 1B. Trekkende eller invasive celler ble tellet under mikroskop, og resulterende data er presentert i form av det gjennomsnittlige antall invasive celler SD /mikroskopisk felt ± (forstørrelse x 10) (figur 1C). Som vist på figur 1C, invasjonen kapasiteten av celler som var nesten identisk med unntagelse av at det invasive potensialet av H226-celler var relativt lavere enn andre cellelinjer. Under identiske betingelser, migrering potensialet av de normale humane bronkiale epitelceller var signifikant lavere enn NSCLS-celler (data ikke vist).
Honokiol hemmer cellemigrering av Menneskelig NSCLC-celler
Effekten av honokiol var fastsettes på cellevandring eller invasiv potensialet i A549, H1299, H460 og H226 human NSCLC cellelinjer ved hjelp Boyden kammer celle migrasjon analyser. Innledningsvis ble en screening eksperiment utført for å bestemme effekten av lavere konsentrasjoner av honokiol (uM). Som vist i figur 2A, i forhold til ikke-honokiol-behandlede kontrollceller, behandling av celler med honokiol i konsentrasjoner på 0, 5, 10 og 20 uM i 24 timer reduserte invasiv potensialet av disse kreftceller på en konsentrasjonsavhengig måte. Tettheten av de migrerende celler på membranen etter farging med krystallfiolett er vist i figur 2A, og antallet av migrerende celler /mikroskopisk felt er oppsummert i figur 2B. Den cellemigrasjon ble hemmet med 38 til 66% (
P
0,01 til 0,001) i A549 celler, med 37-62% (
P
0,01 til 0,001) i H1299 celler , 12-58% (
P
0,05 til 0,001) i H460 celler og 32-69% (
P
0,05 til 0,001) i H226 celler i en konsentrasjonsavhengig måte etter behandling med honokiol (figur 2B). Forholdsvis høyere inhiberende virkning av honokiol på cellemigrering ble observert ved 48 timer tidspunkt (data ikke vist).
(A) Behandling av NSCLC-celler med honokiol (0, 5, 10 og 20 uM) i 24 h hemmer migrering av celler på en doseavhengig måte. (B) De trekkende celler ble talt i hver behandlingsgruppe, og resultatene er presentert som gjennomsnittlig antall trekkende celler SD /felt ±, n = 3. Betydelig hemming i celle migrasjon
versus
ikke-honokiol-behandlet kontrollgruppe, *
P
0,001,
†
P
0,01;
¶
P
0,05. (C) sårheling eller bunnen av analysen ble utført for å vurdere effekten av honokiol om overgangen evnen til NSCLC-celler. Celler ble inkubert med eller uten honokiol i 36 timer. Honokiol hemmer migrering av celler på en doseavhengig måte sammenlignet med kontroll (ikke-honokiol-behandlede celler). Control (0 h) panelet viser den opprinnelige avstanden mellom cellelagene umiddelbare etter at en ripe eller såret. Mellomrommet mellom de stiplede linjer indikerer den hvite plass i stor grad ledig av lungekreftceller. De representative mikrofotografier vises fra tre uavhengige forsøk. (D) ledig tomrom av cellene mellom cellelagene ble målt ved hjelp av mikro-grid skala henhold mikroskop, og dataene blir presentert som en tom plass i form av mikrometer ± SD for hver cellelinje. Signifikant hemming i celle migrasjon versus ikke-honokiol-behandlede kontroller, *
P
. 0,001
Den hemmende effekten av honokiol på NSCLC cellemigrasjon ble ytterligere bekreftet ved hjelp av en sårtilheling analyse, som beskrevet i Materiale og metode. For sårheling assay, ble effekten av honokiol på cellemigrering bestemt ved 36 timer etter behandlingen, mens i Boyden kammer analysen virkningen av honokiol ble bestemt etter 24 timer. Det var på grunn av det faktum at i sårheling analyse første cellene festet til platene, og deretter begynne voksende og etterpå begynne å migrere eller begynne å helbrede sårene. Dermed tar det lengre tid. Som vist i figur 2C, i forhold til ikke-honokiol-behandlede kontrollceller, behandling av celler med honokiol (0, 10 og 20 uM) i 36 timer redusert migrering kapasiteten til alle cellelinjer (A549, H1299, H460 og H226) benyttet i denne studien på en doseavhengig måte. Den store gap eller såre plass mellom cellelagene etter at et sår ble dekket av de vandrende NSCLC celler som ikke ble behandlet med honokiol. Men tomrommet mellom cellelagene ble mindre dekket av trekkende celler behandlet med honokiol og denne effekten var doseavhengig. Det såret eller tomrom mellom cellelagene er markert med stiplede linjer (Figur 2C). Disse data foreslår videre at honokiol hemmet den vandrende effektiviteten av NSCLC celler. Avstanden mellom de stiplede hvite linjer ble målt mikroskopisk i hver behandlingsgruppe. Som oppsummert i figur 2D, tomrommet mellom cellelagene var signifikant større i honokiol-behandlede celler (
P
0,001) sammenlignet med ikke-honokiol-behandlede kontrollceller. Dette viser at honokiol hemmet fremgangskreftcellemigrering. For å kontrollere at hemming av kreft celle migrasjon av honokiol var en direkte effekt på migrasjon evne, og det var ikke på grunn av en reduksjon i celle levedyktighet, ble en MTT analyse utført ved hjelp av celler som ble behandlet likt med de som brukes i migrasjons analyser. Behandling av normale humane bronkiale epitelceller (Beas-2B) og NSCLC-celler med honokiol ved konsentrasjoner på 0, 5, 10 og 20 uM hadde ingen signifikant inhibitorisk virkning på cellelevedyktighet, som vist i figur 3A.
(A) En sammenlignende doseavhengig effekt av honokiol på proliferasjonen potensialet i BEAS-2B-celler og NSCLC-cellelinjer, som analysert ved MTT-analyse. (B) Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av honokiol i 24 timer, og cellelysater ble utsatt for Western blot-analyse for å måle nivåer av COX-2. (C) Behandling av A549 og H1299 celler med celecoxib, en inhibitor av COX-2 i 24 timer hemmer cellemigrering potensialet på en doseavhengig måte. (D) Antallet celler som migrerer ble tellet på membranen, og resultatene er uttrykt som gjennomsnittlig antall trekk celler SD /felt ± fra tre separate eksperimenter. Signifikant hemming av honokiol versus ikke-honokiol-behandlede kontrollceller, *
P
0,001,
†
P
0,01,
¶
P
0,05. (E) Effekt av celekoksib på uttrykket nivåer av COX-2 i A549 og H1299 celler. Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av celecoxib i 24 timer, deretter høstet og cellelysatene ble underkastet Western blot-analyse for måling av COX-2-nivåer. Den relative tettheten av proteinbånd i blotter ble målt ved hjelp av en ImageJ program utviklet ved National Institutes of Health (https://rsb.info.nih.gov/ij) og normalisert med p-aktin band. I hvert tilfelle Kontrollgruppen ble gitt en vilkårlig enhet 1.0. (F) Transfeksjon av A549 og H1299 celler med COX-2 siRNA reduseres betydelig celle migrasjon. Betydelig reduksjon av celle migrasjon versus kontroll siRNA-behandlede celler, *
P
. 0,001
hemmende effekt Honokiol på celle migrasjon av NSCLC Cells er assosiert med reduksjon av endogen COX-2 Expression
for å undersøke om honokiol hemmer NSCLC celle migrasjon ved å målrette den endogene uttrykk for COX-2, vi fast bestemt på nivåene av COX-2 i lysatene av celler behandlet med og uten honokiol å bruke western blot analyse. Som vist i figur 3B, behandling av A549, H1299, H460 og H226-celler med honokiol reduserte nivåer av COX-2-ekspresjon i en konsentrasjonsavhengig måte i forhold til ekspresjon av COX-2 i ubehandlede kontroller. Disse resultatene foreslår at inhibering av kreftcellemigrering ved honokiol kan være assosiert med inhibering av COX-2 ekspresjon i kreftceller.
Celecoxib, en selektiv COX-2-inhibitor, Hemmer NSCLC cellemigrasjon
for å finne ut om den hemmende effekten av honokiol på NSCLC cellemigrasjon er formidlet gjennom sin hemmende effekt på COX-2 uttrykk, like mange A549 og H1299 cellene ble utsatt for cellemigrasjon analysen etter behandling med ulike konsentrasjoner av celekoksib (0, 5 , 10, 20 uM) i 24 timer. Som vist i figur 3C, behandling av cellene med celecoxib resulterte i en doseavhengig reduksjon i cellemigrering kapasiteten til disse celler sammenlignet med ikke-Celecoxib-behandlede kontroller. Data på cellemigrering er oppsummert i figur 3D, hvor det foreslått at behandling av celler med celecoxib inhiberte signifikant (
P
0,01 til 0,001) migreringen av A549 og H1299-celler på en doseavhengig måte. Disse data antydet at hemmingen av endogene konstitutive nivåer av COX-2 ekspresjon er assosiert med inhibisjon av NSCLC celle migrasjon. Videre ble nivåer av COX-2 sjekket i lysater av celler behandlet eller ikke-behandlet med celekoksib ved hjelp av western blot-analyse. Western blot data viste at behandling av A549 og H1299 celler med celecoxib i 24 timer resulterte i reduksjon av COX-2-ekspresjon i disse cellene, som vist i figur 3E.
selektive COX-2-knockdown hjelp siRNA fører til reduksjon of Cancer Cell Migration
rollen av COX-2 i cellemigrering ble ytterligere bekreftet ved hjelp siRNA knock-down av COX-2 i NSCLC-celler og undersøkt om det ville føre til hemming av cellemigrering in cancer celler. Transfeksjon av A549 og H1299 celler med COX-2 siRNA resulterte i betydelig reduksjon av celle migrasjon i A549 (79%,
P
0,001) og H1299 (75%,
P
. 0,001) celler etter 24 timer sammenlignet med overføringen av kontroll siRNA-transfekterte A549 og H1299 celler (figur 3F)
Honokiol hemmer produksjonen av PGE
2 og PGE
2-forbedrede Cell migrasjon i NSCLC Cells
Som chemopreventive effekten av honokiol på celle migrasjon evne 4 forskjellige NSCLC cellelinjer var nesten identiske, vi har valgt 2 cellelinjer (A549 og H1299) for videre detaljerte og mekanistiske studier. Som PGE
2 er en hovedmetabolitt av COX-2, og har vært implisert i COX-2-medierte bivirkninger, inkludert den invasjon og metastase av kreftceller; vi fast bestemt på nivåene av PGE
2 i honokiol-behandlede celler ved hjelp av PGE
2 immunoassay kit. Våre resultater viste at behandling av celler med honokiol i 24 timer resulterte i signifikant reduksjon i produksjon av PGE
2 i begge A549 (20-64%,
P
0,01 til 0,001) og H1299 ( 13-65%,
P
0.01-0.001) celler på en doseavhengig måte (figur 4A), noe som tyder på at honokiol-indusert reduksjon av PGE
2-produksjon kan være forbundet med en inhiberende virkning av honokiol på cellemigrering i disse cellene.
(A) Behandling av A549 og H1299 celler med honokiol reduserte nivåer av PGE
2 på en doseavhengig måte. Nivåene av PGE
2 ble målt i cellelysatene ved hjelp av PGE
2 immunoassay kit og resultatene er uttrykt som pg /mg protein ± SD, n = 3. Betydelig reduksjon i forhold til kontrollceller, *
P
0,001,
†
P
0,01. (B) Behandling av A549 og H1299 celler med honokiol hemmer PGE
2-forbedret celle migrasjon evne. Dataene på cellemigrering kapasitet av celler er oppsummert som en midlere antall trekk celler ± SD /mikroskopisk felt, n = 2. Signifikant inhibering versus PGE
2 alene behandling; *
P
0,001,
†
P
. 0,01
Deretter undersøkte vi om PGE
2 økt migrasjon av NSCLC celler og om honokiol hemmer PGE
2-indusert cellemigrasjon i humane NSCLC-celler. For dette formål ble A549 og H1299-celler behandlet med PGE
2 (10 uM) med og uten honokiol i 24 timer og cellemigrering bestemt.
in vitro
behandlingsdose av PGE
2 ble valgt på basis av tidligere studier [29], [31]. Det ble funnet at behandling av NSCLC-celler med PGE
2 resulterte i en betydelig økning i cellemigrering (
P
0,05) sammenlignet med celler som ikke var behandlet med PGE
2 ( Figur 4B). Behandling av A549 og H1299 celler med honokiol (10 og 20 mm) resulterte i signifikant hemming (
P
0,01 til 0,001) av PGE
2 (10 mm) induserte cellemigrasjon (figur 4B) .
Honokiol hemmer NF-kB /p65 aktivitet hos NSCLC Cells: NF-kB er en viktig regulator av Cancer Cell Invasion /migrasjon
NF-kB er en up-stream regulator av COX 2; derfor har vi bestemt om honokiol påvirker aktivitet samt nivåene av proteiner av NF-kB familie i NSCLC celler. For dette formål, igjen A549 og H1299-celler ble behandlet med honokiol (0, 5, 10 og 20 uM) i 24 timer, og deretter ble cellene høstet og atom lysater og hele cellelysater ble fremstilt for western blot-analyse. Western blot analyse viste at behandling av celler med honokiol reduserer atom akkumulering av NF-kB /p65 på en doseavhengig måte (figur 5A). Aktiviteten av NF-kB /p65 også ble betydelig redusert (
P
0,05 og
P
0,001) etter behandling av celler med honokiol (figur 5B). Våre data viser også at behandling av honokiol resulterte i undertrykkelse av IKKα, et enzym som er ansvarlig for NF-kB-aktivering, og hindret nedbrytningen av IκBα (figur 5A). For ytterligere å verifisere hvorvidt NF-kB har en rolle i NSCLC celle migrasjon, ble A549 og H1299-celler behandlet med en potent inhibitor av NF-kB, ble koffeinsyre fenetyl ester (CAPE), og cellevandring bestemt. Som vist på figur 5C og 5D, behandling av celler med CAPE i 24 timer resulterte i en doseavhengig reduksjon i cellemigrering av A549 (42-78%,
P
0,05 til 0,001) og H1299 ( 41-76%,
P
0.05-0.001) celler i forhold til ikke-honokiol-behandlede kontrollceller, og denne effekten av CAPE var lik den som ble observert på behandling av cellene med honokiol (figur 2A, 2B). Videre har vi også sjekket effekten av CAPE på proteiner av NF-kB familie i A549 og H1299 celler ved hjelp av western blot analyse. Som vist på figur 5E, behandling av celler med CAPE resulterte i undertrykkelse av nivåene av NF-kB /p65 og IKKα i begge cellelinjer på en doseavhengig måte.
(A) A549 og H1299 cellene ble behandlet med varierende konsentrasjoner av honokiol i 24 timer, ble cellene høstet og cytosoliske og atom fraksjoner ble underkastet western blot-analyse. (B) Aktiviteten av NF-kB /p65 i de nukleære fraksjoner av celler ble målt ved hjelp av NF-kB /p65-spesifikk aktivitet analysesett, n = 3. NF-kB /p65-aktivitet er uttrykt i form av prosent av ikke- honokiol behandlede kontrollceller. Signifikant hemming
versus
kontroll, *
P
0,001,
¶
P
0,05. (C) Behandling av celler med CAPE, en inhibitor av NF-kB, i 24 timer hemmer migreringen av celler i en doseavhengig måte. (D) data på cellemigrering er oppsummert som det gjennomsnittlige antall celler som migrerer ± SD pr mikroskopisk felt /gruppe. Signifikant hemming
versus
kontrollgruppen, *
P
0,001,
¶
P
0,05. (E) Behandling av celler med CAPE for 24 timer hemmer nivået av NF-kB og IKKα som bestemmes ved hjelp av western blot analyse.
Honokiol hemmer Nuclear Opphopning av β-catenin
PGE
2 har blitt vist å aktivere β-catenin signalveien som har vært implisert i kreftcellevekst, invasjon og metastase [12], [13]. Som vi har funnet at behandling av NSCLC-celler med honokiol hemmer nivåene av PGE
2 og inhiberer PGE
2-forbedrede migrering av lungekreftceller, har vi videre bestemme hvorvidt inhibering av NSCLC celle migrasjon av honokiol er også forbundet med undertrykkelse av β-catenin signalering. For dette formål ble A549 og H1299-celler behandlet med honokiol i 24 timer, og nukleære og cytosoliske fraksjoner av cellelysatene ble underkastet analyse av proteiner av β-catenin signalering. Western blot analyse viste at behandling av A549 og H1299 celler med honokiol resulterte i reduksjon av nivåene av atom β-catenin (Figurene 6A og 6B) på en doseavhengig måte. Siden, kjernekraft akkumulering av β-catenin er omvendt korrelert med fosforylering på visse viktige rester av β-catenin (Ser
45, Ser
33, Ser
37 og Thr
41), sjekket vi effekten av honokiol på nivåene av β-catenin fosforylering på disse områdene.
