Abstract
RNA polymerase II transkriberer de fysiske endene av lineære eukaryote kromosomer i en rekke lange ikke-kodende RNA-molekyler inkludert telomeric repeat-holdig RNA (TERRA). Siden TERRA oppdagelsen, har fremskritt er gjort i karakterisering av TERRA biogenesis og regulering; tvert imot tilhørende funksjoner forblir unnvikende. De fleste av de biologiske roller så langt foreslått for TERRA er faktisk basert på
in vitro
eksperimenter utført ved hjelp av korte TERRA-lignende RNA oligonukleotider. Spesielt har det blitt foreslått at Terra inhiberer telomerase-aktivitet. Vi har utnyttet to alternative cellulære systemer for å teste om TERRA og /eller telomerer transkripsjon innflytelse telomerase-mediert telomer-forlengelse i humane kreftceller. I celler som mangler de to DNA metyltransferaser DNMT1 og DNMT3b er TERRA transkripsjon og steady-state nivåer øker kraftig mens telomerase er i stand til å forlenge telomerer normalt. På samme måte kan telomerase effektivt forlenge transgene induserbare telomerer som transkripsjon har blitt eksperimentelt utvidet. Våre data utfordre gjeldende hypotesen om at TERRA fungerer som en generell hemmer av telomerase og foreslår at telomer-lengden homeostase opprettholdes uavhengig av TERRA og telomerer transkripsjon
Citation. Farnung BO, Brun CM, Arora R, Lorenzi LE, Azzalin CM (2012) Telomerase effektivt forlenges Meget transkribere Telomerer i humane kreftceller. PLoS ONE 7 (4): e35714. doi: 10,1371 /journal.pone.0035714
Redaktør: Arthur J. Lustig, Tulane University Health Sciences Center, USA
mottatt: 23 februar 2012; Godkjent: 20 mars 2012; Publisert: 27 april 2012
Copyright: © 2012 Farnung et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av European Research Council (BFTERRA), den sveitsiske National Science Foundation (3100A0-120090 og PP00P3-123356) og Fondazione Cariplo (2008-2507). CMB mottatt et fellesskap fra Boehringer Ingelheim Fonds. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
de fysiske endene av lineære eukaryote kromosomer blir transkribert til en rekke ikke-kodende RNA (ncRNA) arter som utgjør den «telomeric transcriptome «. Blant disse arter, lang ncRNA Terra (telomeric repeat-inneholdende RNA) ble først oppdaget i pattedyrceller og suksessivt beskrevet i ikke-pattedyr, inkludert eukaryote sebrafisk,
Arabidopsis thaliana
, spirende gjær
Saccharomyces cerevisiae
og fisjon gjær
Schizosaccharomyces pombe product: [1] – [7]. TERRA molekyler er transkribert fra regionene umiddelbart foregående telomerer -Den subtelomeres- mot slutten av kromosomene i første rekke av den DNA-avhengige RNA polymerase II (RNAPII), som bruker den telomeric C-rik strengen som en mal. Derfor individuelle TERRA molekyler omfatter en subtelomeric kanalen og G-rike telomeric gjentar (5′-UUAGGG-3 «hos pattedyr). TERRA forblir knyttet til telomerer post-transcriptionally som tyder på at TERRA er et konstituerende del av telomeric heterochromatin [1], [3], [4], [6]. Andre RNA arter transkribert fra kromosomendene omfatter ARIA, a C-rik telomeric RNA så langt kun identifisert i fisjon gjær og planter, og to komplementære subtelomeric transkripsjoner blottet for påvisbare telomeric gjentar navnet ARRET, identifisert i spirende og fisjons gjær, og αARRET, identifisert bare i fisjon gjær [1], [4], [5], [7].
Subtelomeric arrangører som driver transkripsjon av TERRA har blitt identifisert i humane celler og omfatter CpG dinukleotidpolyfosfater rike øyene består av strekninger av 29 og 37 bp tandem repetisjoner (29-37 repetisjoner). 29-37 gjentakelser er merket med tandem repeterte 61 bp enheter som er unnværlig for promoter-aktivitet og av hittil uncharacterized funksjon [8], [9]. CpG dinukleotider innenfor TERRA arrangører er tungt metylert i ulike kreft og primærceller [9]. I menneskelige tykktarmskreft HCT116 cellene slått ut for de to DNA metyltransferase enzymer DNMT1 og DNMT3b (DKO celler), TERRA promoter metylering er fullstendig avskaffet og RNAPII binding til TERRA arrangører og Terra steady-state nivåer markert utvidet [9]. Således er felles aktiviteten av DNMT1 og 3b begrenser Terra promoter transkripsjonen aktivitet, i det minste i HCT116-celler. Tilsvarende redusert subtelomeric CpG metylering er ledsaget av økte TERRA cellulære nivåer i celler avledet fra menneskelige pasienter rammet av immunsvikt, centromeric region ustabilitet, ansikts anomalier (ICF), en recessiv syndrom som stammer fra germline mutasjoner i DNMT3b genet [10]. Merkelig, er TERRA overflod redusert i museceller mangelfulle for DNMT1 og DNMT3a /b, selv om global metylering av subtelomeres er kompromittert, noe som tyder artsspesifikke mekanismer for TERRA regulering mediert av DNMTs [6], [11]. Faktisk TERRA arrangører er fortsatt å være preget i museceller og det er fortsatt mulig at murine TERRA arrangører ikke er regulert gjennom CpG metylering.
Mens TERRA biogenesis og regulering har blitt grundig studert, mangel på reproduserbare eksperimentelle verktøy for å endre TERRA cellulære nivåer regnskapet for sparsom kunnskap om TERRA-tilknyttede funksjoner. De fleste av de antatte roller så langt tilskrives TERRA ble trukket fra
in vitro
eksperimenter hvor korte TERRA-lignende RNA oligonukleotider ble ansatt. Slike
in vitro
eksperimenter har antydet at TERRA kan regulere telomerlengde homeostase, telomere replikering og telomeric DNA kondens [6], [12] – [14]. Spesielt TERRA-lignende oligonukleotider hemmet sterkt telomerase aktivitet i telomeric gjenta amplifikasjonsprotokoll (TRAP) og telomerase direkte analyser [6], [14]. Derfor er det generelt antatt at Terra virker som en generell inhibitor av telomerase-mediert telomer-forlengelse og et par indirekte
in vivo
bevis tilsynelatende støtter denne antagelse. En spirende gjær telomere kunstig tvunget til å transkribere gikk forkorting, mens lengden av de resterende telomerer var upåvirket [15]. Gjær mutanter med kompromittert Rat1p RNA eksonukleaseaktivitet bære høyere mengder av TERRA molekyler og kortere telomerer i forhold til villtype kolleger [16]. Endelig telomerer er kortere i celler fra etablerte ICF pasienter enn i celler fra friske donorer [10]. Likevel, det har ikke vært direkte testet om telomerer forkortes observert i disse forskjellige cellulære systemer virkelig stammer fra telomerase hemming. Dermed
in vitro
forblir den faktiske biologiske relevansen av evne til TERRA-lignende oligonukleotider for å hemme telomerase aktivitet fortsatt skal vurderes.
For å avgjøre om TERRA og telomer transkripsjon påvirke telomerase aktivitet
in vivo
, har vi utnyttet to alternative menneskelige mobilsystemer hvor TERRA transkripsjon er utvidet. Vi viser at DKO celler infisert med retrovirus som uttrykker den katalytiske subenhet av telomerase langstrakte sine telomerer så effektivt som parentale celler med intakt DNMT aktiviteter. Konsekvent, vises telomerase biokjemisk aktivitet for ikke å bli påvirket i de samme cellene. Vi presenterer også utvikling av et celledelt system hvor transkripsjon av unike «transkripsjonelt induserbare telomerer» (titels) kan styres etter ønske. Transkripsjon induksjon av titels påvirker ikke deres homeostatic lengden, heller ikke det hindre telomerase-mediert re-forlengelse ved forkorte indusert av telomerase-hemmere. Til sammen våre resultater utfordre allment aksepterte oppfatningen at TERRA er en mobil hemmer av telomerase og tigge for å utforske alternative funksjoner som utøves av TERRA og telomere transkripsjon. I tillegg er våre resultater antyder at telomerer forkortes observert i systemer hvor TERRA ble abnormt forhøyede [10], [15], [16] sannsynlig stammer fra kompromitterte telomerer integritet fremfor telomerase hemming. Discussion
Resultater og br>
TERRA steady-state nivåer opprettholdes uavhengig av telomer-lengden i humane kreftceller
forslaget rolle for TERRA i hemme telomerase aktivitet har foreslått en modell hvor lange telomerer akkumulere eller produsere mer TERRA, og dermed hindre telomerase for ytterligere å utvide dem [6], [14], [17]. Korrelerende bevis bruk av ikke-isogene pattedyrcellelinjer av forskjellig opprinnelse synes å støtte denne hypotesen [6]. Tvert imot har nyere arbeid i spirende gjær vist at eksperimentelt indusert over-forlengelse eller forkortelse av telomerer endrer ikke TERRA nivåer og RNAPII belegg på kromosomendene [18]. Vi har derfor satt opp for å teste om en korrelasjon mellom TERRA nivåer og telomerlengde i isogene humane celler med telomerer i ulike lengder.
Vi stabilt smittet livmorhalskreft HeLa-celler med retrovirus uttrykker den katalytiske subenheten til humant telomerase (hTERT ). Som en kontroll ble infisert vi de samme celler med tom vektor (EV) retrovirus eller med retroviruser som uttrykker hTERT C-terminalt-fusjonert til et influensa hemagglutinin epitop tag (hTERT-HA). hTERT-HA viser normal katalytisk aktivitet
in vitro
men klarte ikke å forlenge telomerer
in vivo
, sannsynligvis på grunn av svekket rekruttering til telomerer [19]. Stabilt infiserte populasjoner ble valgt ut og holdt i kultur i flere populasjonsdoblinger (PDS). Telomerer restriksjonsfragment (TRF) analyse av genomisk DNA viste at på den tiden da forsøkene ble utført hTERT infeksjon hadde ført til en betydelig forlengelse av bulk telomerer: TRFs ble på mellom 2 og 5 kb i EV-infiserte celler og mellom 5 og mer enn 15 kb i hTERT-infiserte celler (figur 1A). Som forventet, gjorde hTERT-HA uttrykk ikke endre telomerlengde, selv om det ble uttrykt på nivåer tilsvar til hTERT (figur 1A og E). Vi så fordøyd genomisk DNA med
Msp
I eller med CpG metylering sensitive isoschizomer
Hpa
II og hybridisert det til radiomerkede sonder som tilsvarer de 29-37 repetisjoner innenfor TERRA arrangører. I samsvar med det vi tidligere har rapportert [9], fant vi at 29-37 repetisjoner i stor grad metylert i HeLa celler. Begrensningen mønster oppdaget med 29-37 gjenta prober ble ikke endret i hTERT-uttrykke celler i forhold til ev og hTERT-HA kontrollceller, noe som indikerer at telomer-forlengelse ikke påvirker metylering staten TERRA arrangører (Figur 1b). Northern blot analyse av total RNA ved hjelp telomeric sonder ikke avsløre vesentlige endringer i de totale TERRA cellulære nivåer i hTERT-infiserte celler sammenlignet med ev- eller hTERT-HA-infiserte kontroller (figur 1C). En størrelse forskyvning av TERRA molekyler mot høyere molekylvekt var tydelig i celler med langstrakte telomerer, som tyder på at i hvert fall i disse cellelinjene telomer-lengden kan påvirke lengden av TERRA molekyler (figur 1C). I samsvar med den nordlige blot analyse, kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) målinger av TERRA molekyler transkribert fra kromosomarmer 10Q, 15Q og XpYp viste ingen statistisk signifikant endring i TERRA steady-state nivåer ved telomer-forlengelse (figur 1D). Vi utførte også analoge eksperimenter i primære humane lunge fibroblaster (HLF), og som for HeLa-celler, gjorde telomere forlengelse ikke vesentlig endre metylering staten TERRA arrangører og cellulære TERRA nivåer (Figur S1).
(A) TRF analyse av HeLa celler infisert med tom vektor (eV), hTERT eller hTERT-HA retrovirus. DNA ble kuttet med
Rsa
jeg og
Hinf
jeg restriksjonsenzymer og hybridiserte med telomeric sonder. (B) Den samme DNA som i A ble kuttet med
Hpa
II (metylering bokstaver) eller
Msp
I (metylering insensitive) restriksjons nukleaser og hybridisert med en probe påvise 29-37 bp gjentakelser av TERRA arrangører. (C) Nuclear RNA ble hybridisert bruker telomeric sonder for å oppdage total TERRA og suksessivt med 18S rRNA-sonder for å kontrollere for lasting. Tall nederst er forholdene mellom TERRA og 18S signal uttrykkes som dobling i løpet ev-infisert prøver. Molekylvekt er på venstre i kilobaser. (D) QRT-PCR analyse av steady-state nivåer av TERRA transkripsjoner stammer fra 10Q, 15Q og Xp /YP kromosomendene. Barer er gjennomsnitt fra tre uavhengige forsøk uttrykt som dobling i løpet ev-infisert prøver. Feil barer og tallene er standardavvik og p-verdier, henholdsvis. (E) Western blot analyse av infiserte celler ved hjelp av anti-hTERT (for å oppdage alle hTERT molekyler), anti-HA (for å oppdage hTERT-HA) og anti-PCNA (lasting kontroll) antistoffer.
på en komplementær måte, dyrket vi HeLa-celler i nærvær av telomerase inhibitoren BIBR1532 [20] i ca. 19 uker. BIBR1532 behandling førte til en betydelig forkorting av bulk telomerer: telomer-lengden ble stort sett på mellom 2 og 5 kb i ubehandlede kontrollceller og mellom 1 og 3 kb i BIBR1532-behandlede celler (Figur 2A). Behandlede celler fordelt i likhet med ubehandlede celler som indikerer at telomerer var lange nok til å opprettholde normal cellevekst (data ikke vist). Telomerer forkortes fremkalte ikke noen vesentlig endring i metylering delstaten 29-37 repetisjoner eller totalt eller kromosom bestemte TERRA steady-state nivåer (figur 2B-D). Til sammen disse eksperimentene viser at, som nylig vist for spirende gjær [18], telomerlengde endringer påvirker ikke TERRA promoter metylering eller TERRA cellulære nivåer i humane celler. Vi konkluderer med at Terra transkripsjon ikke er regulert av telomerlengde, i det minste i de celletyper som vi har analysert.
(A-D) HeLa-celler ble behandlet med den telomerase-inhibitoren BIBR1532 (+ BIBR) i 19 uker eller venstre ubehandlet (-BIBR). Telomerlengde, Terra promoter metylering og total eller kromosom bestemte TERRA likevektsnivåer ble analysert som i figur 1. Totalt RNA ble benyttet for alle eksperimentene. For Northern blot analyse av total Terra (C) beta-aktin (ACT) ble anvendt som en normaliseringskontroll. Molekylvekt er på venstre i kilobaser.
DNA metyltransferase-mangel celler har normal telomerase aktivitet
De forhøyede TERRA nivåer stede i DKO celler gjør dem til et passende mobilsystemet for å teste effekter som utøves av TERRA på telomerase aktivitet. Vi stabilt smittet DKO og HCT116 foreldre (PAR) celler med hTERT eller ev retrovirus og utvalgte stabile bestander. Muligens på grunn av ulike transcriptional tilstand av de to cellelinjer, flere ganger har vi funnet at over-uttrykt hTERT protein nivåer var mer enn to ganger høyere i nivå enn i DKO celler (figur 3A). Som vist ved QRT-PCR og Northern blot, steady-state nivåer av TERRA molekyler transkribert fra 61-29-37 gjenta holdig 10Q og 15Q kromosom ender ble dramatisk økt i DKO celler (figur 3B og S2A) og konsekvent med resultatene ovenfor beskrevet for HeLa og HLF celler, gjorde hTERT stabil uttrykk ikke endre TERRA beløp i enten cellelinje (figur 3B). Vi forberedte proteinekstrakter og analysert telomerase aktivitet ved hjelp av kvantitative TRAP analyser. Ingen signifikant forskjell i telomerase-aktivitet ble målt i ev-infisert par og DKO-celler, mens hTERT infeksjon førte til en betydelig økning i telomeraseaktivitet i begge cellelinjer (figur 3C og D). TRAP-aktivitet var noe høyere i hTERT-infiserte par celler enn i hTERT-infiserte DKO-celler, og vi tillegger denne forskjellen til de lavere mengder av total hTERT-proteinet uttrykt i DNMT-manglende cellelinje (figur 3A, C og D). RNA isolert fra TRAP ekstrakter inneholdt 10Q og 15Q TERRA molekyler, selv om en stor del av dem (ca. 90 og 80% for par og DKO-celler, henholdsvis) forble i cellepelletene igjen etter ekstraksjon (figur 3E), sannsynligvis fordi de fleste Terra er kromatin i forbindelse [1], [3], [6]. Likevel, med tanke på at 10Q og 15Q TERRA molekyler er ~300 ganger mer tallrike i DKO enn i par celler (Figur 3B), regner vi med at DKO TRAP ekstrakter inneholdt ~600 ganger flere TERRA molekyler enn par ekstrakter. I konklusjonen, rapporterer vi at FELLE aktivitet er lik i celler med drastisk forskjellige TERRA nivåer. Dette står i sterk kontrast til resultatene som oppnås
in vitro
med korte TERRA-lignende oligonukleotider [6], [14]. Vi mener at de korte RNA oligonukleotider ansatt
in vitro
ikke oppfører seg som naturlige, lange TERRA molekyler, muligens på grunn av deres bruk i høye, ikke-fysiologiske konsentrasjoner.
(A) Western blot analyse av hTERT-uttrykk i HCT116 foreldre (par) eller DNMT1 og 3b doble KO (DKO) infiserte celler. Tall nederst er forholdene mellom hTERT og PCNA (lasting kontroll) signaler, uttrykt som fold økning hTERT-smittet foreldre celler. (B) QRT-PCR analyse av steady-state nivåer av TERRA transkripsjoner stammer fra 10Q og 15Q kromosom ender uttrykt som dobling i løpet ev-smittet par celler. Barer og feilfelt er gjennomsnitt og standardavvik fra tre uavhengige forsøk. (C) Analyse av TRAP-amplifiseringsproduktene fra de angitte cellelinjer. Tre forskjellige mengder av de totale proteinene ble anvendt for hver cellelinje og å kontrollere for spesifisitet man prøve ble forbehandlet med RNase A. Kontroll primere amplifisering ble inkludert i alle reaksjoner en intern kontroll (IC). (D) Kvantifisering av telomerase aktivitet i de angitte prøver ved hjelp QRT-PCR-basert TRAP analyser. Barer og feilfelt er gjennomsnitt og standardavvik fra tre uavhengige forsøk, etter normalisering gjennom EV-smittet foreldrecelleprøver. Tall tyder på P-verdier (*: P 0,01). (E) QRT-PCR-basert kvantifisering av 10Q og 15Q TERRA transkripsjoner i TRAP ekstrakter (ext) eller i celle pellets igjen etter ekstraksjon (PLT). Relative TERRA beløpene er uttrykt som brøkdeler av total TERRA molekyler fra pellet pluss ekstrakt. Barer og feilfelt er gjennomsnitt og standardavvik fra tre uavhengige eksperimenter.
Effektiv telomerase-mediert telomer-forlengelse i DKO celler
For å overvåke hvordan telomerase forlenges telomerer i par og DKO celler vi klare for genomisk DNA fra infiserte celler 2, 5 og 9 dager etter infeksjon. Vi deretter utført TRF analyse ved hjelp av sonder spesifikt oppdage kromosom 10Q subtelomeric sekvenser eller telomeric gjenta sonder oppdage bulk telomerer. Selv 10Q og bulk TRFs var vesentlig kortere i DKO enn i foreldre celler, de begge gjennomgikk progressiv forlengelse gjennom den valgte tids kurs i celler infisert med hTERT men ikke i ev kontrollceller (Figur 4A). Dermed er telomerase i stand til å forlenge telomerer både i par og DKO celler inkludert 10Q telomerer, som er tungt transkribert i DKO celler (figur 3B og S2A). For å få mer kvantitative data, har vi gjort bruk av enkelt telomerlengde analyse (STELA), en PCR-basert tilnærming som gjør det mulig å presist måle lengden på enkelt telomerer [21]. STELA av 15Q telomerer bekreftet at den gjennomsnittlige telomerlengde i DKO-celler er lavere enn i parentale celler (5,9 kb og 3,8 kb pari og DKO-celler, henholdsvis, figur 4B og C). Ikke desto mindre, slik som allerede foreslått av TRF analyse, 15Q telomerene ble effektivt forlenget i begge cellelinjer infisert med retrovirus hTERT (Figur 4D). Ved kvantitativ analyse av Stela produkter og normalisering gjennom befolkningen dobles (PD) tid beregnet for de to cellelinjer (17,7 t og 29,6 h for par hTERT og DKO hTERT celler, henholdsvis) vi anslått at telomerase forlengelses priser var ca ~204 bp /PD i par celler og ~186 bp /PD i DKO celler (Figur 4C og D). Denne liten forskjell i telomerase forlengelses prisene ikke korrelerer med enormt økte nivåer av 15Q TERRA i DKO celler (figur 3B) og vil trolig tilskrives de ulike hTERT protein nivåer påvist i infiserte pari og DKO celler (figur 3A). Trypanblått farging og fluorescens-aktivert cellesorterer (FACS) analyse av Annexin V og propidiumjodid–farget celler viste ingen stor forskjell i andelen døde eller apoptotiske celler i de ulike cellelinjer og heller ikke gjorde det viser betydelige endringer i fordelingen av celler mellom de ulike faser av cellesyklusen (fig S2B). Dette indikerer at jo høyere PD tiden målt for DKO-celler er sannsynligvis tilskrives en lengre syklusperiode av disse cellene, en forestilling ytterligere bekreftet ved det tydelig forsinkelse i cellesyklusutvikling observert for synkroniserte DKO celler frigjøres fra en nocodazol blokk (fig S3A).
(A) TRF analyse av pålydende og DKO celler infisert med tom vektor (ev) eller hTERT retrovirus. Genomisk DNA ble oppsamlet 2, 5 og 9 dager (d) etter infeksjon, spaltet med
Rsa
I og overført til en nylonmembran. Den samme membran ble først hybridisert med en probe detektere 10Q TRFs og suksessivt med en sonde detektere totale telomerer. (B) STELA av 15Q telomerlengde ved hjelp av den samme DNA som i A. markør molekylvekter er på venstre i kilobaser. (C) Box plot representasjon av 15Q telomere lengder. Gjennomsnittlig telomere lengder i kilobaser og det totale antallet telomerer analysert (n) er angitt for hver prøve. (D) 15Q telomere forlengelses priser uttrykt som gjennomsnitt telomer-lengden på ulike befolknings doublings. Merk at for par celler, ble bare tre tidspunkter brukt fordi ingen statistisk signifikant forskjell i gjennomsnittlig telomer-lengden ble målt mellom dag 5 og dag 9.
Normal telomerer forlengelse i hTERT smittet DKO cellene ikke støtte forestillingen om at TERRA fungerer som en telomerase inhibitor
in vivo
. Likevel, vurderte vi muligheten for at TERRA transkripter i DKO-celler er ikke i stand til å inhibere telomerase, enten fordi de ikke på riktig måte å lokalisere til telomerer eller fordi de er drastisk nedregulert i løpet av S-fase, når telomerase opptrer [17], [22] . Vi samlet indirekte immunfluorescens med RNA fluorescens
in situ
hybridisering (IF /RNA-FISH) for å samtidig oppdage telomeric faktor TRF2 og Terra molekyler. DKO cellene inneholdt mer og lysere TERRA foci enn foreldre celler og hTERT infeksjoner endret ikke det generelle mønsteret av TERRA hybridisering. Omtrent 20 og 30% av TRF2 foci samlokalisert med TERRA foci i par og DKO celler, henholdsvis (figur S2C og D), mest sannsynlig som gjenspeiler det faktum at den økte nivåer av TERRA i DKO celler tilrettelagt påvisning av TERRA foci. På den annen side er den fraksjon av TERRA foci ko-lokaliserende med telomerer var lik i begge cellebakgrunn, noe som indikerer at den iboende evne til Terra å forbli knyttet til telomeric heterochromatin krever ikke intakte DNMT aktiviteter (fig S2C og D). Viktigere, gjorde hTERT uttrykk ikke endre Samlokaliseringen priser i begge cellelinje. Derfor er brøkdel av TERRA knyttet til telomerer lik i pari og DKO celler, og telomere forlengelse ikke merkbart påvirke TERRA lokalisering. Vi deretter blokkert par og DKO celler i G2 /M fase og sluppet dem synkront inn i cellesyklus i en tid som er tilstrekkelig til å komme seg gjennom S-fasen (Figur S3A). Vi forberedte total RNA ved ulike tidspunkt og dot-blot hybridiserte det til TERRA og aktin sonder. TERRA nivåer vært stabil gjennom hele tidsforløpet i begge cellelinjer (figur S3b og C). Til sammen disse observasjonene avsløre at telomerase-mediert telomer-forlengelse ikke er vesentlig svekket i DKO celler, der Terra transkripsjons priser og steady-state nivåer er dramatisk økt [9]. Denne mangelen på robust hemming ikke stammer fra mislocalization av TERRA eller fra sin nedregulering i S-fase. Dette er godt i tråd med våre observasjoner at telomerase aktivitet er upåvirket i de samme cellelinjer.
Generering av humane kreftcellelinjer som bærer transcriptionally induserbare telomerer
DNMT1 /3b sletting fører til globale transkripsjons endringer i DKO celler [23]. For å få en mobilsystemet der transkripsjon av unike telomerer kan endres, genereres vi stabile cellelinjer som bærer transgene telomerer som kan transkriberes i en induserbar måte ( «transcriptionally induserbare telomerer»; titels). Vi kombin telomere seeding fenomenet med induserbar genuttrykk Tet-on-teknologi [24] – [26] og konstruert en telomer-seeding vektor omfattende en hygromycin motstand kassett og doksysyklin (DOX) -inducible minimal CMV arrangøren plassert oppstrøms av et (TTAGGG ) n telomeric array (figur 5A). En ~1.6 kb unik sekvens referert til som «induserbar transkripsjonelt subtelomere «(tiSUBTEL) separerer telomeric sekvens fra den induserbare promoteren (figur 5A). Seeding Plasmidet ble linearisert ved
Apa
-fordøyelse for å avdekke den telomeric kanalen ved sin 3 «ende og transfektert inn i en Tet repressor-uttrykkende cellelinje avledet fra HeLa-celler (T-Rex-HeLa). Uavhengige hygromycin-resistente kloner ble utvalgt og testet for Titel poding ved Southern blot-analyse. Genomisk DNA ble spaltet med
Xhol
I for å frigjøre Titel TRFs og hybridisert ved bruk av radioaktivt merkede prober som tilsvarer tiSUBTEL sekvenser (SBP i figur 5A). To kloner (cl12 og CL17) viste den typiske smøre hybridisering mønster forventet for nylig seeded titels (figur 5B) og ble valgt for ytterligere karakterisering. I begge kloner, ble tittel TRFs stort sett på mellom 3 og 6 kb. Fordi
Xho
I kutt ca 2,4 kb oppstrøms for første telomeric gjenta på seeding plasmid (figur 5A), titels telomeric traktater ble stabilisert seg på ca 0,6 til 3,4 kb, en størrelsesområde kan sammenlignes med en av bulk telomerer i foreldrenes og i klonale celler (Figur S4A). Vi ytterligere bekreftet tittel seeding i kloner 12 og 17 ved hjelp av flere eksperimentelle tilnærminger. Vi stabilt smittet både klonale cellelinjer med hTERT uttrykte retrovirus og bekreftet at både titels og naturlige telomerer ble lett langstrakt på hTERT infeksjon (Tall 5B og S4A). STELA med oligonukleotider tilsvarende tiSUBTEL sekvenser produsert amplifiseringsprodukter hybridiserer til både SBP og telomeric sonder bare når vi brukte genomisk DNA fra cl12 og CL17 celler, men ikke fra foreldre celler (figur S4B). DNA FISH av metafase kromosomer fremstilt av cl12 og CL17 celler ved hjelp av fluorescensmerkede seeding plasmider blottet for telomeric gjentar avdekket at nylig seeded titels ble integrert i en og to kromosom ender i klone 17 og klon 12 celler, henholdsvis (figur 5C). Endelig dot blot hybridisering av genomisk DNA fordøyd med Bal31 eksonuklease avdekket en progressiv forsvinning av tittel hybridisering signaler over tid (figur S4C).
(A) Scheme av Titel seeding vektor. iCMV: induserbar CMV promoter; SBF og SBR: oligonukleotidene anvendt i RT-PCR eksperimenter; SBP: sonde brukes i TRF, STELA og nordlige blot eksperimenter. (B) tittel TRF analyse av genomisk DNA fremstilt fra klon 12 (cl12), klone 17 (CL17) og foreldre (PAR) celler infisert med hTERT-uttrykke retrovirus eller ev kontrollretrovirus. DNA ble hybridisert hjelp SBP sonder. Marker molekylvekt er på venstre i kilobaser. (C) Delvis metafaser fra cl12 og CL17 hybridiserte
in situ
å oppdage titels (pilspisser). (D) Northern blot analyse av total RNA fra cl12 og CL17 behandlet i 24 timer med kombinasjoner av doksycyklin (DOX) og trichostatin A (TSA) eller venstre ubehandlet. SBP prober ble anvendt for å detektere tiTERRA. De samme membraner ble strippet og re-analysert for å påvise beta-aktin transkripsjoner (ACT) for å kontrollere for lasting. (E) QRT-PCR analyse av tiTERRA steady-nivåene i de angitte cellelinjer som ble behandlet med ulike kombinasjoner av DOX og TSA eller venstre ubehandlet. For hver cellelinje, blir verdiene uttrykkes som gangers økning sammenlignet med ubehandlede prøver. Barer og feilfelt er gjennomsnitt og standardavvik fra 3 til 7 eksperimenter. P-verdier for aktuelle prøvene er angitt med tall eller av en stjerne (*: P 0,01; **: P 0,001)
transkripsjon induksjon av titels
For å teste om. titels svarte til transkripsjonsinduksjons, vi dyrket cl12 og CL17-celler i nærvær eller fravær av doksycyklin (DOX) i 24 timer. Vi samlet inn totalt RNA og utsatt det til nordlige blot analyse ved hjelp SBP prober (figur 5A). DOX behandling førte til fremkomsten av RNA-arter, referert til som «induserbar transkripsjonelt Terra «(tiTERRA), som består i lengde mellom omtrent 0,5 og 6 kb (figur 5D). Fordi induserbar promoter sekvens er plassert ca 1,6 kb oppstrøms for telomeric sekvens, konkluderer vi med at tittel transkripsjon kan fortsette gjennom det meste av telomeric kanalen. Vi utførte QRT-PCR analyse ved revers transkribere RNA med tilfeldige heksamer og PCR forsterke den oppnådde cDNA ved hjelp av SBF og SBR oligonukleotider (figur 5A). Som forventet ble ingen tiTERRA detektert i parentale celler, noe som bekrefter spesifisiteten av RT-PCR-metode (figur 5E). Selv ved lave nivåer, ble tiTERRA transkripsjoner allerede påvist i både ikke-induserte kloner, avslører en basal transkripsjonen aktivitet fra den induserbare CMV promoter i fravær av induksjon (figur 5E). Absolutte kvantifisering av tiTERRA molekyler indikerte at, i ikke-induserte kloner ble tiTERRA opprettholdt på nivåer sammenlignbare med de av endogene TERRA molekyler transkribert fra 10Q kromosom ender (fig S5a og B). Dette indikerer at tiTERRA holdes ved fysiologiske nivåer i begge klonale cellelinjer. I samsvar med de nordlige blot resultater, DOX behandling induserte en 10-til-20-ganger økning i tiTERRA nivåer i begge kloner (Tall 5E og S5b). TiTERRA molekylene ble også påvist i PCR eksperimenter utført med cDNA revers transkribert ved hjelp av C-rik oligonukleotider (Telc) komplementære til telomeric strekningen innenfor TERRA molekyler (Figur s5a og C). Således, som med naturlig TERRA, individuelle tiTERRA transkripsjoner inneholder både telomeric og subtelomeric sekvenser.
TERRA uttrykk er epigenetiske regulert og histondeacetylase inhibitor trichostatin A (TSA) fremmer ansamling av TERRA transkripsjoner i humane kreftceller [27] . Vi behandlet cl12 og CL17 celler med TSA i nærvær eller fravær av DOX og kvantifisert tiTERRA ved QRT-PCR.
