Abstract
Bakgrunn
Høy grad av serøs eggstokkreft og livmorkreft er de mest dødelige kvinnelige skjede malignitet verdensomspennende. I del, til svikt behandle disse to aggressive kreft vellykket sentre på det faktum at mens de fleste pasienter er diagnostisert basert på dagens overvåkingsstrategier som å ha en fullstendig klinisk respons på sin primærbehandling, nesten halvparten vil utvikle sykdommen tilbakefall innen 18 måneder og flertallet vil dø av sykdommen tilbakefall innen 5 år. Videre, ingen dag brukes biomarkører eller bildediagnostikk kan forutsi utfallet etter første behandling. Sirkulasjons svulst DNA (ctDNA) representerer en teoretisk kraftig biomarkør for påvisning ellers okkult sykdom. Vi utforsket derfor bruk av personlige ctDNA markører som både overvåking og prognostisk biomarkør i gynekologisk kreft og sammenlignet dette med gjeldende FDA-godkjente overvåkingsverktøy.
metoder og resultater
svulsten og serumprøver var samlet på tidspunktet for kirurgi og deretter gjennom hele behandlingsforløpet for 44 pasienter med gynekologiske kreftformer, som representerer 22 eggstokkreft tilfeller, 17 livmor krefttilfeller, en peritoneal, tre egglederen, og en pasient med synkron eggleder og livmorkreft. Pasient /tumor-spesifikke mutasjoner ble identifisert ved hjelp av hel-exome og målrettet gensekvensering og ctDNA nivåer kvantifisert ved hjelp av dråpe digital PCR. CtDNA ble påvist i 93,8% av pasienter som prober ble utformet og nivåer ble sterkt korrelert med CA-125 serum og computertomografi (CT) skanning resultater. I seks pasienter, ctDNA oppdaget tilstedeværelsen av kreft selv når CT scanning var negativ og i gjennomsnitt hadde en prediktiv ledetid på syv måneder enn CT bildebehandling. Mest spesielt var ikke målbare nivåer av ctDNA på seks måneder etter første behandling forbundet med kraftig forbedret progresjon og total overlevelse.
Konklusjoner
Påvisning av restsykdom i gynekologisk, og faktisk alle kreftformer, representerer en diagnostisk dilemma og en potensiell kritisk vendepunkt i presisjon medisin. Denne studien indikerer at bruk av tilpassede ctDNA biomarkører i gynekologiske kreftformer kan identifisere nærværet av resttumor og samtidig mer dynamisk forutsi responsen på behandlingen i forhold til tiden brukes serum og bildediagnostikk. Av spesiell interesse, ctDNA var en uavhengig prediktor for overlevelse hos pasienter med eggstokkreft og livmorkreft. Tidligere anerkjennelse av sykdom utholdenhet og /eller tilbakefall og evnen til å stratifisere i bedre og verre utfall grupper gjennom ctDNA overvåking kan åpne vinduet for bedre overlevelse og kvalitet, og livet i disse kreftformene
Citation. Pereira E, Camacho -Vanegas O, Anand S, Sebra R, Catalina Camacho S, Garnar-Wortzel L, et al. (2015) Personlig Sirkulasjons Tumor DNA Biomarkører Dynamisk Tippe behandlingsrespons og overlevelse i Gynekologisk kreft. PLoS ONE 10 (12): e0145754. doi: 10,1371 /journal.pone.0145754
Redaktør: Goli Samimi, National Cancer Institute, USA
mottatt: 27 oktober 2015; Godkjent: 08.12.2015; Publisert: 30.12.2015
Copyright: © 2015 Pereira et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Disse studiene ble finansiert delvis av donasjoner fra Varadi Ovarian Initiative i Cancer Education (VOICE), den Derald H. Ruttenberg Foundation og MS Gordon familien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Gynekologisk kreftformer vil bli diagnostisert i løpet av 94.000 kvinner i USA og vil resultere i nær 29 000 dødsfall i år alene [1]. Utviklingen av mer følsomme og nøyaktige biomarkører vil være avgjørende for begge tidligere påvisning av sykdom og mer effektiv overvåking i etterbehandlings innstilling. For eksempel, i epitelial eggstokkreft, den mest dødelige kvinnelige skjede malignitet over hele verden, de fleste kvinner vil presentere med avansert stadium sykdommen som vil bli administrert av kirurgisk fjerning fulgt av kombinasjonen platina- og taxan-basert kjemoterapi. Villedende, med dagens sporingsteknologien, vil 80% av disse pasientene synes å ha en fullstendig klinisk respons på primærbehandling. Faktisk vil mer enn halvparten utvikle sykdommen tilbakefall innen 18 måneder. Dermed er en kritisk periode for å initiere mer aggressiv behandling tidligere og forbedring av overlevelse potensielt tapt for alltid. Den eneste tiden tilgjengelig serum biomarkør i gynekologiske kreftformer, CA-125 mangler sensitivitet og spesifisitet for overvåking behandlingsrespons og tidlig oppdagelse av tilbakefall [2,3]. Bildediagnostikk inkludert computertomografi (CT) skanning blir ofte brukt for sykdomsovervåking, men også mangel følsomhet og ofte forbli ufullstendig eller forsinket i å demonstrere progresjon av sykdommen [4,5].
Den absolutte mengden av cellefritt DNA (cfDNA) i pasientens serum som en markør av sykdom tilstedeværelse i gynekologisk kreftformer ble først utforsket mer enn 10 år siden [6,7]. Med bruk av nye teknologier og sekvense analytiske teknikker, evnen til å detektere sirkulerende tumorspesifikt DNA (ctDNA), ofte referert til som «flytende biopsi», har utviklet seg. Målingen av ctDNA har vist seg å være en nøyaktig gjenspeiling av sykdom nærvær og tumorutviklingen i flere krefttyper, inkludert bryst, lunge, tarm og mage kreft [8-12]. Tidligere studier i gynekologiske kreftformer har først og fremst vurdert tilstedeværelse av ctDNA på ett tidspunkt ved hjelp av bekken vasker, ascites, serum og plasma [13-15]. Som et proof-of-prinsippet studie for å vise evne til å serielt spore sykdom, vi nylig brukt en tumor-spesifikke fusjon hendelse for å demonstrere fortsatte tilstedeværelsen av ctDNA, og dermed minimal restsykdom, hos en enkelt pasient over en fireårsperiode i møte med gjentatte ganger normal CA125 målinger [16]. Bortsett fra dette, er longitudinelle studier samkjøre ctDNA nivåer med tumorbelastning og klinisk kurs i gynekologisk kreft mangler. Ikke desto mindre, det teoretiske dynamisk, følsom og spesifikk natur av ctDNA som en biomarkør antyder stort potensiale for revolusjonerende vår tilnærming til tumor overvåking i gynekologiske kreftformer.
Her beskriver vi en rask og effektiv rørledning som par tumor-spesifikke punktmutasjon identifikasjon med dråpe digital PCR-basert ctDNA gjenkjenning. Vi har testet denne rørledningen til å oppdage og overvåke tumorstatus på 44 kvinner med gynekologisk kreft. Spesielt ved bruk av en kombinasjon av hel exome sekvensering (WES) og regissert gensekvensering panel, har vi samlet svulst mutasjon profiler for en kohort av eggstokkreft og livmorkreftpasienter. Pasient-avledet paneler av ctDNA biomarkører ble samlet og testet ved hjelp av dråpe digital PCR, som vi valideres for å være i stand til å detektere enkle kopier av ctDNA pr serumprøve. De ctDNA Resultatene ble sammenlignet mot dagens FDA-godkjente serum biomarkør, CA125, CT scanning og den kjente kirurgisk /klinisk status for pasienter. Dette er den første studien som viser i gynekologiske kreftformer som ctDNA kan oppdage tilstedeværelsen av kreft tidligere enn andre for tiden anbefalte test modaliteter og at ctDNA nivåer ved ferdigstillelse av primærbehandling er en uavhengig prediktor for både progresjonsfri (PFS) og total overlevelse ( OS).
Metoder
pasient~~POS=TRUNC Påmelding og prøvetaking
Førti-fire pasienter med gynekologisk, maligniteter ble registrert og godkjent for deltakelse etter å skaffe passende skriftlig informert samtykke som en del av vår Institutional Review Board (IRB) -godkjent gynekologiske kreft genomikk program på Icahn School of Medicine ved Mount Sinai (tabell 1). Tumorprøver ble oppsamlet på tidspunktet for kirurgi. Blodprøver ble tatt ved tidspunktet for kirurgi og igjen med hvert blodprøvetaking gjennom pasientens kliniske forløp. Kirurgisk tumorvev ble umiddelbart flash frosset i flytende nitrogen etter høsting, og serum ble oppsamlet i BD Vacutainer-Sstll Advance rør (BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ). Innen fire timer etter innsamling, ble blodprøver ble sentrifugert i 10 minutter ved 12.000 g). Serum ble overført til et 15 ml Falcon rør og sentrifugert ved 1,200g i ytterligere 10 minutter for å eliminere gjenværende cellerester. Kliniske data ble hentet fra pasientjournaler og inkludert demografiske variabler, initial tumor nettstedet, histologi, klasse, scene, CA-125 nivåer og kjemoterapeutiske regimer. Data om kirurgiske prosedyrer, steder av metastatisk sykdom og tilbakefall av tumorer, ble også samlet inn. Alle pasienter med livmor eller eggstokkreft var kvalifisert for opptak dersom de nødvendige prøver i henhold til studieprotokollen og relevante kliniske data var tilgjengelige. CA-125 nivåer, computertomografi (CT) resultater, kirurgiske resultater og kjemoterapiregimer
DNA Extraction Protokoller
Genomisk svulst DNA ble ekstrahert fra ca 25-50mg av vev ved hjelp av DNeasy blod og vev Kit (Qiagen, GmbH, Hilden) i henhold til produsentens instruksjoner. Kimlinje DNA ble ekstrahert fra helt blod ved hjelp av ArchivePure DNA Kit (5 Prime) i henhold til DNA-renseprotokoll for fullblod, levert av produsenten. Kvantifisering av genomisk DNA ble utført ved anvendelse av qubit fluorometri. Sirkulerende fri (cfDNA) ble ekstrahert fra 1 ml av serum ved hjelp av de sirkulerende Nucleic Acid Kit (Qiagen, GmbH, Hilden) og eluert med 105 ul av DNase- og RNase-fritt vann.
Identifikasjon av somatiske mutasjoner
Personlig kreftmutasjonsprofiler ble identifisert for hver enkelt pasients svulst ved enten hele exome sekvensering (WES) eller en målrettet gensekvensering tilnærming. I begge analyser, ble genomisk DNA (gDNA) fra tumorvev og en normal kontroll sekvensert for å identifisere genetiske varianter (SNVs og små indels) som er spesifikke for tumor bare (somatiske mutasjoner). All sekvensering ble utført på avdeling for genetikk og Genomics på Icahn School of Medicine ved Mount Sinai. Hel-genom bibliotekene ble fremstilt fra gDNA bruker NEBNext DNA Bibliotek Prep kit (New England Biolabs, Ipswich, MA), anriket til hele exome bibliotekene bruker SeqCap EZ Menneskelig Exome Library v3.0 capture system (Roche NimbleGen, Madison, WI) , som dekker ca 64 Mb av genomet hvor varianter kan kalles; parvise end sekvensering (2×100 nt leser) ble gjort på Illumina HiSeq 2500 (Illumina, San Diego, California) i enten High Output eller Rapid Run-modus. Målrettet genet sekvensering ble utført ved hjelp av Ion AmpliSeq
TM Cancer Hotspot Panel v2 (Life Technologies, Carlsbad, CA) ved hjelp av Ion Torrent PGM sekvenseringsteknologi til ~ 1000 til 3000X dekning. Den Ion AmpliSeq
TM Cancer Hotspot Panel v2 interrogates 50 onkogener og tumorsuppressorgener over 207 amplikonene (dekker 21 820 nt hvor varianter kan kalles). Basert på erfaring, ble kandidatsomatiske mutasjoner triaged for Taqman sonde utvikling hvis mutant allel brøkdel var ≥ 8% og passerte manuell vurdering ved å inspisere rå lese justeringer i IGV genom nettleser verktøyet, deretter validert for siste generasjonen av sonde ved direkte Sanger-sekvensering av tumor DNA og dens sammenkoblet perifert blod mononukleære celler (PBMC) genomisk DNA. Siden WES data gitt et større antall kandidatsomatiske mutasjoner enn var praktisk å validere, ble kandidater med høyere allel brøk og bedre variant samtalekvaliteten prioriteres.
PCR-analyse design og validering
Tilpassede TaqMan Analyser ble utformet ved hjelp av Life Technologies web-baserte designverktøy (www.lifetechnologies.com/order/custom-genomic-products). Analyser som finnes umerkede PCR primere (forover og bakover) i tillegg til VIC, TET eller FAM merket sonder, som autosøk for villtype og mutant-varianter hhv. Analysene ble deretter godkjent av kvantitativ PCR (qPCR) med TaqMan® Genotyping Master Mix (Life Technologies, Foster City, CA) på en ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, California). Først spesifisitet ble etablert ved å teste analyser på tumor og matchet PBMC genomisk DNA. Linearitet av hver prøve ble deretter opprettet ved å sammenligne hver analyse mot en standardkurve fremstilt fra en serie av seriefortynninger av tumor-DNA, varierende fra 400-4000 genomet tilsvarende kopier som er spesifikke for den analysen.
Mutasjon Kvantifisering i sirkulerende fritt DNA (cfDNA)
for ytterligere å etablere følsomhet, linearitet og nedre grense for deteksjon, utviklet analyser ble deretter testet ved dråpe digital PCR (Raindance Technologies, Billerica, MA) i henhold til produsentens protokoll. For dette formål, ble seriefortynninger av tumor-DNA preparert for hver analyse, og som strekker seg fra 2-24 kopier tilsatt i en bakgrunn av 100.000 kopier av genomisk villtype-DNA. Når den nedre grensen for deteksjon ble etablert for hver analyse ble utført på ddPCR cfDNA ekstrahert fra pasientens serum og /eller plasma. Tyve ul eluert cfDNA ble anvendt for hver PCR-reaksjon, som representerer 200 ul serum. Det totale volum PCR-reaksjon ble 50 ul (genererende 10 ^ 6 dråper). PCR-betingelsene var som følger: 95 ° C i 10 minutter for en syklus; 95C (15 sekunder) og 58C (ett minutt) med et trinn for 45 sykluser hver; og 98c (10 minutter). PCR-produktet ble deretter innført i regndråpe Sense instrument for kvantifisering av villtype og mutante kopiantall. Hver cfDNA prøve ble analysert ved hjelp av minst to replikater. For å etablere analyse reproduserbarhet og effektivitet cfDNA ekstraksjon, piggete vi hver pasientblodprøven med en kjent konsentrasjon av Lambda DNA spaltet med Hindlll fag (Qiagen, GmbH, Hilden) før cfDNA isolasjon. qPCR ble brukt for å kvantifisere de 125 og 535 bp DNA-fragmenter av λ- Hindlll. Basert på λ DNA-ekstraksjon effektivitet, utvinning effektivitet for cfDNA utdrag brukt i disse studiene var mellom 60 og 90%.
Statistical Analysis
For å vurdere muligheten for ctDNA og CA125 å forutsi tilstedeværelse svulst på CT bildebehandling og på tidspunktet for operasjonen, ble parameterne for sensitivitet og spesifisitet samt tilsvarende 95% konfidensintervall beregnet hjelp av logg-binomisk modell som tok hensyn til de sammenhenger som oppsto fra det foreligger flere målinger på samme pasient i løpet av tid. Forutsannsynligheter fra disse montert modeller ble så brukt i logistiske regresjonsmodeller å beregne og sammenligne de områdene under Receiver Operating Characteristic (ROC) kurver (AUC) for både ctDNA og CA125. Total overlevelse (OS) og progresjonsfri overlevelse (PFS) ble estimert ved hjelp av metoden for Kaplan-Meier og sammenlignet med den log-rank test, mellom pasienter med nivåer av ctDNA som enten var til stede eller fraværende etter kirurgisk reseksjon og adjuvant behandling. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SAS versjon 9.3 (SAS Institute, Inc., Cary, NC). Hypotesetesting var tosidig og gjennomført på 5% signifikansnivå.
Resultater
Clinicopathologic Kjennetegn på pasienter og deres Svulster
Førti-fire pasienter som gjennomgår behandling for gynekologisk kreft ble registrert for denne studien og deres krefttype og clinicopathologic informasjon er vist i tabell 1. Tumor-avledet DNA, germline DNA, ctDNA og kliniske data var tilgjengelige for alle pasienter. Alle ovarietumorer var høyverdig serøs histologi med unntak av en ondartet blandet mesodermal svulst. Selv om de fleste av livmorkreft var høy klasse, de histologiske subtyper var variert. Ved anvendelsen av våre analyser høyverdig serøs svulster i egglederen, bukhinne og eggstokk ble gruppert sammen som bekken høyverdige serøs karsinom (HGSC). Flertallet av svulster sekvensert ble samlet på tidspunktet for primær kirurgi (n = 40), mens fire tumorprøver var fra tilbakefall.
Identifikasjon av somatiske Genomisk Varianter og utvikling av personlig ddPCR Analyser
En oversikt av vår personlige ctDNA analyse rørledning er vist i S1 fig. Ved hjelp av en kombinasjon av WES og målrettet panel sekvensering, vi først forsøkte å identifisere signifikante tumorspesifikke mutasjoner for å utvikle digitale dråpe PCR (ddPCR) -baserte analyser. Åtte svulster ble sekvensert ved hjelp WES data fra Illumina parvise end sekvense samlet på HiSeq 2500 og 36 ble sekvensert ved hjelp av målrettet Ion AmpliSeq ™ Cancer hotspot Panel v2 bruker Ion Torrent PGM sequencer. Alle svulster sekvensert ved hjelp WES var ovarietumorer. Serumprøver var tilgjengelige fra enten primær eller sekundær operasjon for alle pasienter. Langsgående serumer var tilgjengelig for 23 pasienter. ctDNA ble hentet fra en total av 228 individuelle tidspunkter med et gjennomsnitt på 7,8 tidspunkter per pasient (fig 1).
Kandidat mutasjoner ble identifisert for 36 pasienter (S1 Table). Av mutasjonene oppdaget ved hjelp av målrettet panel, den hyppigst muterte genet var TP53 (23/36 pasienter; 66%), som alltid skjedde i høyverdig serøs histologi av både eggstokkene og endometrial svulster. Mutasjoner ble også identifisert, om enn på lavere frekvenser, i PTEN, PIK3CA, MET, KRAS, FBXW7 og BRAF. Flere kandidat mutasjoner ble identifisert for 16 pasienter. Alle søker mutasjoner ble bekreftet av Sanger-sekvensering av de respektive svulster.
I alt 52 unike analyser, ut av 55 utformet, ble validert for sensitivitet, spesifisitet og linearitet ved hjelp av kvantitativ PCR (qPCR), som representerer 32 pasienter for som ctDNA kvantitative studier kan utføres. Robustheten av de forskjellige assays som genereres for hver av pasientene ble demonstrert ved en rekke forskjellige beregninger. For alle 52 analyser, korrelasjonskoeffisienten for linearitet, R
2, var større enn 0,99 (mener, 0,9988, S2A fig). Den nedre grense for påvisning ble etablert for hver tilpasset analyse ved bruk av pigg svulst-DNA fra den respektive pasient med kjente mutasjoner og testet ved bruk av 2-24 mutant kopier i en bakgrunn av 100000 villtype kopier av sitt kimlinje DNA. Basert på disse tester, for å følsomhet skille mellom villtype og mutant sekvens for alle prober som brukes i denne undersøkelsen varierte mellom 0,01% og 0,002%. Kvantifisering av spesifikke kreft mutante kopier i cfDNA var sterkt korrelert i ddPCR gjentak (Pearson r: 0,9938, S2C fig). Det var også en høy lineær sammenheng mellom allel brøkdel som bestemmes av ddPCR og målrettet sekvensering (Pearson r: 0,95). Og denne korrelasjonen var statistisk signifikant p = 4.47E-15 (S2D figur)
Estimering av følsomhet og spesifisitet ctDNA å forutsi tumor Presence
Vi så evaluert evnen til serielt-samlet ctDNA å screene for klinisk tilstedeværelse av tumor. Samtidig har vi også sammenlignet den tiden brukes FDA-godkjent test, CA-125. Å etablere en relativ bakken sannhet for svulst nærvær, brukte vi CT bildebehandling og funn på tidspunktet for operasjonen. Mens relativt upresise, gjorde dette mulig for oss å identifisere en rekke viktige funn. Data som sammenligner ctDNA og CA-125 nivåer av tilstedeværelsen av svulst på CT bildebehandling var tilgjengelig på tvers av 53 tidspunkter for 23 pasienter.
sensitivitet og spesifisitet ctDNA å forutsi tilstedeværelsen av svulst på den sammenkoblede CT scan var 0,91 [0,73 til 0,97] og 0,60 [0,31 til 0,83], henholdsvis (tabell 2). Lignende resultater ble oppnådd for CA-125 og CT-skanning (tabell 2). Den lave spesifisitet ctDNA var overraskende for oss, og så vi undersøkte dette i større dybde. Avviket ble funnet å være et resultat av manglende samsvar mellom testene i seks pasienter. Spesielt alle de seks pasientene hadde påvisbare nivåer av ctDNA men negative CT bildebehandling resultater innen to uker etter ctDNA blodprøvetaking. Avhør av deres komplett historikk viste at alle seks pasienter ble senere funnet å ha kirurgi påvist svulster som ikke hadde blitt oppdaget av CT-skanning. Videre analyser av pasientdata viste at i gjennomsnitt, spådde ctDNA tilbakefall ca 7 måneder. (Område: 1-11 måneder) tidligere enn CT imaging (figur 2)
I dette representativt eksempel, økning i ctDNA nivåer i pasient~~POS=TRUNC 137 nivåer foran en økning i CA-125-nivå innen seks måneder, og pre-date positiv identifikasjon av tumorvekst krever tarm reseksjon syv måneder senere. CT scanning var uspesifikke og pasienten ble brakt til operasjonsstuen for utforskende kirurgi, som avslørte tilstedeværelse av tumor.
CA-125 og ctDNA nivåer ble deretter sammenlignet med tilstedeværelsen av svulst på tidspunktet for kirurgi på 30 tidspunkter for 21 pasienter. Når sammenlignet med tilstedeværelsen av tumor ved kirurgi, ctDNA hadde en sensitivitet på 0,81 [0,60 til 0,92] og en spesifisitet på 0,99 [0,81 til 0,99]. Til sammenligning var sensitiviteten og spesifisiteten til CA-125 var 0,82 [0,61 til 0,93] og 0,64 [0,17 til 0,94], respektivt. Områder under ROC-kurver ble beregnet for ctDNA og CA-125 og var 0,91 [0,83 til 0,99] og 0,70 [0,44 til 0,95], henholdsvis. Selv om disse resultatene tyder på at ctDNA kan være en mer nøyaktig diagnostisk test enn CA-125, forskjellen i ROC-kurver var ikke statistisk signifikant (p = 0.3575) [Tabell 2].
ctDNA Levels følgende Initial Treatment Are Predictive av overlevelse Forskjeller
Vi neste vurdert om ctDNA nivåer etter kirurgisk reseksjon og adjuvant behandling hadde prognostisk betydning. Før og etter behandling ctDNA nivåene ble analysert for 10 pasienter og sammenlignet med PFS og OS. Gjeldende kliniske status, død av sykdom (DOD), i live med sykdommen (AWD) og ingen tegn på sykdom (NED), var tilgjengelig for alle 10 pasienter (Tabell 3). Ikke målbare nivåer av ctDNA følgende initial adjuvant behandling var assosiert med både økt PFS (p = 0,0011 Kaplan Meier) og OS (p = 0,0194, figur 3). Median PFS forskjellen var litt over 2 år (seks måneder versus 32 måneder). Alle fire pasienter med gjennomsnittlig etter behandling ctDNA nivåer ≥ 10 kopier /ml er DOD, mens en pasient med ctDNA = 5 kopier /ml, som også intrigere hadde svært lave nivåer av ctDNA forbehandling, er AWD. Av de fem pasienter med ikke målbare ctDNA nivåer etter behandling, har ingen dødd av sykdommen, tre er AWD og to er NED. To av pasientene har allerede overlevde etter 5 år. Vi merket ingen overlevelses forskjeller basert på ctDNA verdier før behandling
Kaplan-Meier analyse av progresjonsfri (venstre panel) og total overlevelse (høyre panel) mellom personer med usynlige. (CtDNA = 0; blå linjer) og påvisbare ctDNA (≥ 1, røde linjer). Signifikante forskjeller i progresjonsfri overlevelse (p = 0,001) og total overlevelse (p = 0,0194) mellom ikke målbare og påvisbare grupper.
Diskusjoner
Vi viser at seriemåling av ctDNA er en overvåking biomarkør i gynekologiske kreftformer som er så følsom og spesifikk som FDA-godkjente serum biomarkør CA-125 og kan oppdage sykdommen tilbakefall måneder tidligere enn CT skanning. Videre målingen av ctDNA nivåene ved tidspunktet for fullføring av initial terapi, debulking kirurgi og kombinasjon platina /taxan dublett kjemoterapi, tilveiebringer en ny prediktor for overlevelse forskjeller i pasienter. Spesielt ble ikke målbare nivåer av ctDNA assosiert med både økt progresjon og total overlevelse. I vår studie befolkning, forskjellen i PFS var litt over to år mellom kvinner med påvisbare og ikke målbare nivåer av ctDNA. Disse forskjellene, tidligere deteksjon enn CT bildebehandling og separasjon av kvinner med verre og bedre overlevelse, er påfallende, siden det teoretiske grunnlaget for kreft overvåking er at tidligere påvisning resulterer i bedre behandlingsalternativer og resultater. Hva er i dag kjent er at i dag, og stole på klinisk undersøkelse, CA-125 målinger og bildebehandling, er de fleste av eggstokkreft pasienter etter første behandling diagnostisert som å ha en fullstendig klinisk respons. Til tross for dette, vil mer enn halvparten av disse kvinner utvikler sykdommen tilbakefall innen 18 måneder.
CA-125 og CT-bilder er de mest brukte overvåking modaliteter i eggstokkene og livmorkreft. Likevel er CA-125 regnes som valgfritt og CT bildebehandling anbefales som indikert klinisk ved National Comprehensive Cancer Network (NCCN) retningslinjer [17]. I overkant av 50% av pasienter med kreft i eggstokkene med normale CA125 nivåer etter kjemoterapi likevel ha vedvarende sykdom, men å skille mellom pasienter utelukkende på denne biomarkør er for tiden ikke mulig [18]. For ~ 50% av pasientene med vedvarende sykdom, økt følsomhet og spesifisitet som gis av en genombasert tilnærming kan tillate ytterligere under kategorisering av pasienter for å hjelpe skille sykdom og terapeutiske undergrupper. CA-125 er også mye uttrykt i andre vev, og er forhøyet i benigne prosesser slik som endometriose, uterin leiomyomata, benigne adnexal masser, egglederbetennelse, leversykdom, hjertesvikt, menstruasjon, og graviditet, noe som begrenser dens anvendelse ved overvåking av eggstokk-kreft [ ,,,0],19]. Til slutt, med en halveringstid beregnet å være i området fra 9-44 dager, [20], CA-125 ikke kan tilby så rask respons på tumorvolumendringer som ctDNA. På den annen side, mens CT-avbildning er standardmetoden i evalueringen av tilbakefall av sykdommen, i vårt kohort var det seks tilfeller av negativ CT-avbildning med detekterbar ctDNA i møte med restsykdom. Videre og som nevnt ovenfor, en økning i ctDNA innledes radiologisk bevis for tumor tilbakefall, i gjennomsnitt med 7 måneder.
I en rekke andre krefttyper, ctDNA nivåer har vist seg å nærmere korrelert med endringer i tumor volum enn tilgjengelige biomarkører [8], men longitudinelle studier på mennesker som korrelerer ctDNA nivåer med tumorbyrde i gynekologiske kreftformer hadde vært mangler. Tidligere vår gruppe rapportert om påvisning av genetiske rearrangementer, spesielt fusjonsbegivenheter, og deres bruk som ctDNA analyser for å retrospektivt overvåke en pasient med avansert stadium eggstokkreft [16]. Begrunnelsen for igangsetting vår studie var at til tross for denne pasientens historie tilsynelatende klinisk remisjon basert på flere negative kliniske, biokjemiske og radiologiske undersøkelser hun hadde flere tilbakefall. For en fire-års periode, pasienten gjennomgikk hoved debulking kirurgi og kjemoterapi, tumorer, og flere kjemoterapeutiske regimer. Blodprøver ble lengderetningen innsamlet og lagret i vår biobank som en del av et forskningsprogram. Mens postsurgical CA125-nivåer ble forhøyet bare tre ganger for 28 målinger, den spesifikke fusjons ctDNA biomarkør var lett detekterbar i alle av de samme blodprøver og i tumorer. Selv om vi ikke direkte relateres ctDNA mengde med tumorbyrde, svulsten spesifikke fusjon ctDNA fortsatte å være synlig i tider med tilsynelatende klinisk remisjon, demonstrere evne til ctDNA å påvise okkult sykdom i eggstokkreft.
I denne studien, har vi nå vise evne til fintfølende detektere enkeltpunktmutasjoner ved digital PCR på særegen også utover 0,01% fra en kompleks prøve. Ved hjelp av denne rørledning, når de pasientspesifikke ctDNA prober er blitt generert og validert, kan testing av serumprøver være fullført innen noen timer og er lett innlemmes i et overvåkningsprogram (S3 Fig). Vår tilnærming krever forkunnskaper i tumor-spesifikke genetiske endringer i hver enkelt pasients svulst. I denne studien brukte vi en kombinasjon av WES og en målrettet panel som retter seg mot 50 vanlige muterte onkogener og tumor dempere. Dette kombinert tilnærming tillot oss å generere ctDNA prober for 82% av kvinnene i vår studie. Som forventet, WES identifisert mutasjoner i 8/8 av tumorprøver. Kreften panel som vi brukte mulig for oss å avhøre 207 amplikonene over 50 onkogener og tumorsuppressorgener på et svært høyt dekning og resulterte i identifisering av mutasjoner i 28/36 (78%) prøver. I fremtiden, bruk av sekvense paneler fokusert spesielt på eggstokkene og livmorkreft bør gi rom for en enda mer robust og effektiv identifikasjon plattform.
Målet med disse neste generasjons overvåkingsstudier er å oppdage tilbakefall av sykdommen tidligere så at pasientene vil være mer optimale kirurgiske kandidater, deres behandlinger mer effektivt tilpasset og, hvis og når det er nødvendig, triaged for terapeutiske studier. Omvendt, for noen kvinner, kan bruken av ctDNA-baserte biomarkører redusere antallet unødvendige inngrep, resultere i mindre enn behandling og omgå de finansielle kostnader og stråling som er knyttet til CT-bildediagnostikk. Til syvende og sist nå det ctDNA har vist seg å detektere restsykdom tidligere, og kan skille mellom kvinner med dårligere og forbedret overlevelse i ovarier og livmorkreft, kliniske studier som definerer anvendeligheten av ctDNA som et overvåkingsverktøy i gynekologiske kreftformer kan nå bli utformet.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 fig. Oversikt over ctDNA analyse rørledning
doi:. 10,1371 /journal.pone.0145754.s001 plakater (TIF)
S2 Fig. Nøyaktighet og reproduserbarhet ddPCR analysen i PT208. (TP53 mutasjon, Chr17: 7577539; G A) for ctDNA deteksjon og kvantifisering product: (A) Analyse linearitet ble bestemt ved å analysere serie fold kreft allel fraksjons fortynninger. Mutant kopier oppdaget av ddPCR systemet ble støttet av en R
2 på 0,99. (B) Den nedre deteksjonsgrense for denne analysen ble etablert ved å tilsette serie svulst DNA fortynninger i en base på 100.000 eksemplarer av genomekvivalenter fra pasientens germline DNA. Brøk mutasjon konsentrasjons prosenter varierte 0,025 til 0,002 og ble analysert ved ddPCR. Mutasjon fraksjonen ble påvist så lavt som 0,002%. (C) Repliker reproduserbarhet for ctDNA deteksjon. Pearson korrelasjon mellom enkelt replikater er beregnet og vist (Pearson r = 0,99) (D) Avtale av mutant allel brøkdel besluttsomhet mellom sekvensering og ddPCR (p = 4.47E-15)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0145754. S002 product: (TIF)
S3 fig. Nåværende og foreslo gynekologisk overvåking algoritme
doi:. 10,1371 /journal.pone.0145754.s003 plakater (TIF)
S1 Table. Kandidat tumor spesifikke mutasjoner identifisert av WES og målrettet sekvensering.
Prøver avhørt av WES er markert med en stjerne.
