Abstract
Mål
5-Fluorouracil (5-Fu) har vært mye brukt som en første-linje narkotika for tykk- og endetarmskreft (CRC) behandling, men begrenset av legemiddelresistens og alvorlig toksisitet. Chemo-allergifremkallende som utvider sin effektivitet og overvinne sin begrensning er sterkt behov. Jiaogulan (Gyp), de viktigste komponentene fra
Gynostemma pentaphyllum plakater (Thunb.) Makino, har vist potensiell antitumor eiendom med liten bivirkning. Her har vi nøye utforsket chemo-sensibilisering av Gyp å forsterke anti-tumor effekt av 5-Fu
in vitro Hotell og
in vivo
.
metodikk /hovedfunnene
3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltertrazolium bromid tetrazolium assay og kolonidannelse test viser at Gyp kan betydelig forbedre 5-Fu-forårsaket SW-480, SW- 620 og Caco2 celler levedyktighet tap. Calcusyn analyse viser at Gyp fungerer i synergi med 5-Fu. Annexin V-PE /7-AAD flekker indikerer 5-Fu + Gyp kan indusere SW-480 celle apoptose. De aktiveringer av kaspase 3, ble caspase 9 og poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) som er involvert i prosessen. Gyp ble også funnet å oppregulerer 5-Fu-forårsaket fosfo-p53-ekspresjon og således forsterke 5-FU-indusert G0 /G1 faserest. Gyp forhøyet intracellulær ROS nivå, betydelig forbedret 5-Fu-utløst DNA skade respons som gjenspeiles av flowcytometri, kometmetoden og uttrykk for Ser139-Histone H2A.X. Inhibering av ROS og p53 henholdsvis reverserte celledød indusert av 5-Fu + Gyp, noe som tyder på nøkkelroller av ROS og p53 i prosessen. Videre har 5-Fu og Gyp i kombinasjon oppviser mye overlegen tumorvolum og vekt inhibering på CT-26 xenograft musemodell sammenlignet med 5-FU eller Gyp alene. Immunhistokjemi analyse antyder kombinasjoner sterkt undertrykt tumor spredning. Foreløpige toksikologiske resultatene viser at 5-Fu + Gyp behandling er relativt trygg.
Konklusjoner
Som potensiell chemo-sensitive, viser Gyp en fantastisk synergistisk effekt med 5-Fu å hemme kreftcelle spredning og tumorvekst. Ved å bruke 5-Fu og Gyp i kombinasjon ville være et lovende terapeutisk strategi for CRC behandling
Citation. Kong L, Wang X, Zhang K, Yuan W, Yang Q, Vifte J et al. (2015) Jiaogulan synergi Forbedrer Anti-tumor effekt av 5-fluorouracil på Colorectal Cancer in vitro og in vivo: En rolle for oksidativt stress-mediert DNA Damage og p53 aktivering. PLoS ONE 10 (9): e0137888. doi: 10,1371 /journal.pone.0137888
Redaktør: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Science Center, KINA
mottatt: 27 juni 2015; Godkjent: 24 august 2015; Publisert: 14. september 2015
Copyright: © 2015 Kong et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den tredje vanligste ondartet kreft og den fjerde største årsaken til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis, som står for omtrent 1,2 millioner nye tilfeller og 600 000 dødsfall per år [1]. Kirurgisk reseksjon, etterfulgt av kjemo- eller radioterapi, forblir den eneste etablerte kurativ behandling av CRC, men begrenset av legemiddelresistens og alvorlig toksisitet [2].
5-fluorouracil (5-FU), en analog av uracil , er den mest brukte kjemoterapeutisk middel for behandling av faste tumorer, spesielt for kolorektal kreft [3]. I kreftceller, er 5-Fu konvertert til fluordeoksyuridin monofosfat (FdUMP) for å utøve sin cytotoksiske effekt. FdUMP kan mis-innlemme i DNA eller RNA, hemme aktiviteter tymidylatkinase syntetase (TS), til slutt føre til celle apoptose [4]. Likevel er den generelle svarprosenten med 5-Fu monoterapi som førstelinjebehandling for CRC ganske begrenset (approximately10-20%) [5]. Ytterligere økning i dosen ville gi legemiddelresistens og uunngåelige bivirkninger begrenser dermed dets terapeutiske virkning. Nylig, kombinasjon eller flerkomponent (i stedet for mono) -terapi, i hvilket to eller flere typer av medikamenter blir brukt samtidig, er en bevist behandling for kreft [6,7]. 5-Fu kombinert med nye cytotoksiske medikamenter som oksaliplatin, resveratrol og irinotecan har ikke bare forbedret responsrater til 40-50%, men også redusert uønsket reaksjon av disse stoffene [8-10], noe som tyder på at 5-Fu har en fordelaktig sikkerhetsprofil og kan være egnet for kombinert behandling med andre legemidler. Til tross for disse forbedringene er nye terapeutiske strategier og nye chemo-allergifremkallende presserende behov.
Jiaogulan (Gyp), de store komponenter utdrag fra
Gynostemma pentaphyllum plakater (Thunb.) Makino, finnes hovedsakelig som dammarane -type triterpene glykosider (fig 1A) og har vært brukt som en tradisjonell populær folkemedisinen i Asia i århundrer for å behandle kreft [11-13], hyperlipoproteinemia [14], hepatitt [15], og hjerte- og karsykdommer [16]. Eksperimentell studie har rapportert at Gyp kan utløse apoptose i menneskelig kolorektalkreft 205 celler gjennom mitokondriene avhengig sti og aktivering av caspase-3 [17]. Våre tidligere undersøkelser tyder også på at Gyp hemmet human kolorektal kreft SW-480 og SW-620 celler spredning og migrasjon i en dose- og tidsavhengig måte [18,19]. Til tross for disse potenser, Gyp var relativt mindre giftig for menneske normale celler [20], som viser potensiell anvendelse i kreftbehandling. Men det er ikke noen informasjon om chemo-allergi effekt av Gyp før nå. Og om Gyp kan bli en god chemo-sensitive å forsterke effekten av kjemoterapi i klinikken er ikke klart. I denne studien bruker vi den menneskelige tykktarmskreft SW-480, SW-620, Caco2 celler og CT-26 xenograft mus modell for å utforske mulige chemo-allergi effekt av Gyp å forsterke anti-tumor effekt av 5-Fu
in vitro Hotell og
in vivo
. Så langt vi kjenner til, er den første studien
in vitro Hotell og
in vivo
preklinisk forskning som vurderer chemo-allergi effekt av Gyp og anti-tumor effekt av å bruke 5 -Fu og Gyp i kombinasjon. Disse funnene kan gi en ny terapeutisk strategi for å oppnå anti-kreft synergi.
(A) Kjemisk dammarane skjelett struktur av Jiaogulan. (B) Cellelevedyktigheten ble målt ved MTT-analyse etter 48 timer etter 5-FU behandling i SW-480 SW-620, og Caco2-celler. (C-F) Cellelevedyktigheten ble målt ved MTT-analyse etter 24 og 48 timer etter 5-FU og /eller Gyp behandling i SW-480 SW-620, og Caco2-celler. Kombinasjon indeks (CI) verdien ble analysert ved hjelp av CalcuSyn programvare. CI 1 indikerer en synergistisk effekt. (G) Colony dannelsen av SW-480 og Caco2 celler etter 5-Fu og /eller Gyp behandling. Alle data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD av tre paralleller og
p product: * 0,05,
p
** 0,01 versus kontroll;
p
##
0,01 versus 5-Fu eller Gyp alene gruppen.
Materialer og metoder
Kjemikalier og reagenser
Jiaogulan (Gyp) ble vennlig levert av Ankang Pharmaceutical Institutt for Beijing University (Shaanxi, Kina) og oppløst i 80% etanol (EtOH) til en endelig lagring konsentrasjon på 100 mg /ml. 5-fluorouracil (5-FU) ble anskaffet fra Sigam-Aldrich (St. Louis, Mo, USA) og oppløst i dimetylsulfoksyd (DMSO) også til en endelig lagring konsentrasjon på 100 mg /ml. Gyp og 5-Fu løsningen ble sterilisert gjennom 0.22μm filter for bruk i etterfølgende eksperimenter og lagres i -20 ° C.
3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltertrazolium bromid tetrazolium (MTT), Hoechst 33342, propidiumjodid (PI), RNase A, N-acetylcystein (NAC), og pifithrin-α ble kjøpt fra Sigma-Aldrich. Guava nexin Reagens ble hentet fra Millipore Corporation (Rica, MA, USA). 2 «, 7»-dichlorofluorescein-diacetat (DCFH-DA) var fra Molecular Probes Inc. (Eugene, Oregon, USA). Den aspartataminotransferase (AST), alaninaminotransferase (ALAT), blod urea nitrogen (BUN) og kreatinin (Cr) assay kit ble levert av Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kina).
Cellelinjer
den menneskelige tykktarmskreft SW-480, SW-620, Caco2 celler og normalt humant navlevene endotelceller HUVEC ble hentet fra Cell Bank av den kinesiske Academy of Science (Shanghai, Kina). Celler ble dyrket i RPMI-1640, L-15 medium (Sigam-Aldrich) eller Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Gibco, Life Technologies, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Hyclone, USA), 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, og 1 mM glutamin. Kulturer ble holdt ved 37 ° C med fuktighet og 5% CO
2.
Celleviabilitet assay
Cellelevedyktigheten ble evaluert ved hjelp av MTT-analyse, og kolonidannelse test. For MTT-analysen,-celler (1 x 10
5 celler /ml) ble sådd i 96-brønners plater (Corning Inc., NY, USA) over natten og eksponering for 5-Fu (1, 5, 10, 50, 100 , 300 ug /ml), Gyp (70, 85, 100 ug /ml) eller 5-Fu + Gyp i 24 og 48 timer (kontroll løsningsmiddel eksponering til 80% etanol og DMSO samtidig). Etter behandling, ble cellelevedyktigheten bestemmes ved å tilsette 10 ul MTT-løsning (5 mg /ml i PBS) til hver brønn, fulgt av inkubering i 4 timer ved 37 ° C med 5% CO
2. MTT-blandingen ble fjernet og 150 ul DMSO ble tilsatt til hver brønn. Prøvene ble ristet på en rister i 15 minutter, og absorbansen ved 570 nm ble målt ved anvendelse av en mikroplateleser (Bio-Tek, ELX800, USA). Cellelevedyktigheten ble beregnet som følger:. (1-gjennomsnittlige absorbans av behandlet gruppe /gjennomsnittlig absorbans av kontrollgruppe) x 100%
Colony formasjonstest ble utført for å evaluere den langsiktige proliferativ potensialet av SW-480 eller Caco2 celler etter 5-Fu og /eller Gyp behandling. Celler ble sådd ut i 6-brønns plater ved en densitet på 1000 celler /brønn og dyrket i 7-10 dager ved 37 ° C med 5% CO
2. Mediet ble endret etter 3 dager før synlige kolonier dannet. Deretter ble kolonier ble fiksert med 4% paraformaldehyd ved 4 ° C i 15 minutter og farget ved hjelp av Giemsa i 30 minutter. Prøvene ble vasket med PBS og tørket ved romtemperatur. Antallet fargede kolonier som inneholdt 50 celler ble tellet manuelt. Spredningspotensiale ble beregnet som følger:. Relativ kolonidannelse rate (%) = antall kolonier i behandlingsgruppen /antall kolonier i kontrollgruppen × 100%
Taksering kombinasjon index
etter deteksjon av enkelt- og kombinasjons inhibitoriske effekter av 5-Fu og Gyp, kombinasjonen indeksen (CI) ble beregnet i henhold til metoden til Chou og Talalay [21] med CalcuSyn program (Biosoft, Cambridge, UK). Verdien av CI er et kvantitativt mål på graden av interaksjon mellom medikamenter. CI 1 indikerer synergisme, CI = 1, betegner additive effekter; CI 1, betegner antagonisme.
Fastsettelse av celle apoptose
Cell apoptose ble oppdaget ved hjelp av Guava nexin analysen, som benytter Annexin V-PE å oppdage fosfatidylserin på det ytre membran av apoptotiske celler [22] . SW-480-celler (2 x 10
5 celler /ml) ble sådd i 24-brønns plater og behandlet med 5-FU og /eller Gyp i 24 timer, deretter ble cellene høstet og vasket med PBS. Etter at 100 ul celler til hver prøve ble suspendert i en blanding av 100 pl Annexin V-PE og 7-AAD bindingsbuffer, inkubert ved 37 ° C i 20 minutter i mørket og utsatt for strømningscytometri-analyse (Millipore, USA) umiddelbart . Histogrammer ble analysert ved hjelp av FCS Express V3 programvare.
Hoechst 33342 farging
Hoechst 33342 farging ble brukt til å bekrefte endringer av kjerner morfologi SW-480 celler etter 5-Fu, Gyp eller 5- Fu + Gyp behandling. I korthet, etter inkubering i 24 og 48 timer, ble cellene farget med 10 mM Hoechst 33342 ved 37 ° C i mørke i 15 minutter, deretter vasket tre ganger med PBS og observert ved hjelp av et fluorescens mikroskopi med standard eksitasjon filtre (Nikon, Japan) .
Cell syklus analyse
SW-480 celler ble sådd i 24-brønns plater og eksponering for 5-Fu, Gyp eller 5-Fu + Gyp for 24 og 48 timer. Da de behandlede celler ble høstet og anordnet som følgende trinn: vasket to ganger med kald PBS, fiksert med 70% iskald etanol ved -20 ° C over natten, vasket to ganger med kald PBS, inkubert med 100 mg /ml RNase A i 30 min ved 37 ° C, etter at farget med 50 mg /ml PI i mørket i 30 minutter og underkastet strømningscytometri-analyse. For hvert forsøk ble 5.000 celler registrert. De oppnådde resultater ble analysert ved hjelp av Cell quest programvaren.
Bestemmelse av DNA-skade
PI skytes inn i DNA og størrelsen av DNA-fragmenter som fremkommer som et hypoploid DNA histogram [23]. Celler i 24-brønners plater ble behandlet med 5-Fu, Gyp eller 5-Fu + Gyp i 24 og 48 timer, deretter farget med 5 ug /ml PI, permeabilisert ved fryse kaster og underkastet strømningscytometri-analyse. Histogrammer ble analysert ved anvendelse av FCS Express programvare V3.
Comet assay, en sensitiv og rask metode for påvisning av DNA-skade i individuelle celler, ble utført som tidligere beskrevet [24].
Måling av intracellulært ROS produksjon
endringen av intracellulære ROS nivået ble målt ved bruk av den oksidative omsetting av den følsomme fluorescerende probe 2 «, 7′-dichlorofluorescein-diacetat (DCFH-DA) for å fluorescerende 2′, 7»-dichlorofluorescein (DCF ). DCFH-DA diffunderer lett gjennom cellemembranen og hydrolyseres enzymatisk ved intracellulære esteraser til danner ikke-fluorescerende DCFH, som deretter hurtig oksyderes for å danne sterkt fluorescerende DCF i nærvær av ROS, og fluorescensintensiteten er proporsjonal med ROS produksjon. Celler ble inkubert med 5-Fu, Gyp eller 5-Fu + Gyp i 6 og 12 timer, deretter farget med 10 uM DCFH-DA ved 37 ° C i mørke i 30 min. Etter vasking med PBS tre ganger, ble cellene sett under et fluorescensmikroskop, umiddelbart (Nikon, Japan).
NAC (5 mM) ble benyttet som en ROS fjerningsmiddel tilsatt til kulturmediet samtidig med 5-Fu og /eller Gyp legger til. ROS-generasjon, DNA-skade og celle apoptose ble analysert som beskrevet ovenfor.
Pifithrin-α (10 uM) ble anvendt som en inhibitor for p53 for å redusere ekspresjon av p53 i kulturmedium når cellene ble inkubert med 5 -Fu og /eller Gyp. Den celleviabilitet, ROS dannelse og DNA-skade ble analysert som beskrevet ovenfor.
Western blot-analyse
Western blotting ble utført som tidligere beskrevet [25]. Proteiner (60 ug) ble underkastet elektroforese på 5 til 13,5% polyakrylamidgeler, og ble gelene overført på nitrocellulosemembraner (Millipore, MA, USA), som ble inkubert med relevante antistoffer. Følgende antistoffer ble brukt: Phospho-p53 (Ser15), Phospho-cdk2 (Thr160), caspase 3, caspase 9, BCL-2, Ser139-Histone H2A.X, kløyvde-PARP, β-aktin (Cell Signaling Technology, Danvers , MA, USA) og Cyclin E (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Den β-aktin-ekspresjon ble anvendt som referanse band. The protein uttrykk Hastigheten ble kvantifisert ved Kvantum ett-maskinen.
Xenotransplantat tumormodell
murine kolorektal kreft CT-26 celler ble hentet fra Celle Resource Center, Institutt for medisinske Science (Beijing, Kina), og tilstanden til kultur var samme med SW-480 celler. De BALB /c mus (kvinne, 18-20 g kroppsvekt) ble levert av Experimental Animal Center for fjerde Military Medical University (Xi’an, Kina). De ble plassert i en luftkondisjonerte rom ved 23 ± 2 ° C, med fri tilgang til mat og vann, og ble opprettholdt på en 12 timers lys-mørke-syklusen. Etter å ha blitt matet i våre anlegg for en uke, forvente tre mus ble anvendt som normal kontroll, ble alle andre inokulert med 0,1 ml av CT-26-celler (1 x 10
7 celler /ml) i den venstre oxter region og tilfeldig delt inn i 6 grupper med 6-8 dyr i hver gruppe. Behandlingen startes dagen etter CT-26 celler implantasjon (dag 1). Gruppe Jeg fikk omvendt osmose vann via mageskylling daglig og regelmessig saltvann via intraperitonealt injisert annenhver dag som kontrollgruppe; Gruppe II ble injisert med 5 mg /kg 5-FU intraperitonealt hver dag; Gruppe III ble gitt 25 mg /kg Gyp via mageskylling hver dag; Gruppe IV ble gitt 50 mg /kg Gyp via mageskylling hver dag; Gruppe V ble gitt 5 mg /ml 5-Fu + 25 mg /ml Gyp og gruppe VI ble gitt 5 mg /kg 5-FU + 50 mg /kg Gyp. De lange (a) og kort (b) diametrene av tumorene ble målt ved bruk av glide calipers hver dag etter dag 6 for beregnet tumorvolum som har formelen: ab
2/2. Kroppsvekt ble også målt.
Musene ble observert daglig for kliniske tegn og avlivet på den nittende dag. Vevsprøver ble veid og fiksert med 10% formalin i minst 24 timer, innebygde med parafin, deretter farget av hematoxylin-eosin farging og immunhistokjemi. Hemmingshastigheten ble beregnet som følger: (1- gjennomsnittlig tumorvekt av de behandlede gruppe /gjennomsnittlig tumorvekt av kontrollgruppen) x 100%. I mellomtiden, milt ble skåret ut og veiet for beregnet milt indekser som følger: miltvekt /kroppsvekt x 100%. Nivåene av ASAT, ALAT, BUN og Cr i serum ble også påvist.
Eksperimenter bruker mus ble utført i henhold til National Institute of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, og ble godkjent av universitetets Institutional Animal Care og bruk komité Shaanxi Normal university (Xi’an, Kina).
Immunohistochemistry analysen
Immunohistokjemi ble utført på 7 pm deler av parafininnstøpte prøvene ved hjelp av monoklonalt anti-PCNA antistoff (Abcam, Cambridge, UK). I korthet, etter deparaffinization og hydratisering, ble delene behandlet med varme-mediert antigen hentes ved hjelp av 10 mM citratbuffer (pH 6,0) i 15 minutter og permeabiliserte med 0,2% Triton X-100 i 15 min. Deretter endogen peroksidase-aktivitet ble stoppet med 3% hydrogenperoksydoppløsning i 10 min. Ikke-spesifikk binding ble forhindret ved inkubering med 5% normalt geiteserum i 15 min. Deretter ble seksjonene inkubert med anti-PCNA-antistoff (1: 8000 fortynninger) over natten ved 4 ° C i et fuktig kammer. Antistoffbinding ble påvist ved anvendelse av pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff ved 37 ° C i 30 minutter. Deretter deler ble visualisert ved diaminobenzidine løsning, kontra lett med hematoxylin, dehydrert med etanol og observert ved hjelp av lysmikroskopi (Nikon, Japan).
Statistisk analyse
SPSS 16,0 programvare (SPSS Inc., Chicago ) ble brukt for statistisk analyse. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD) av tre prøver tatt fra tre uavhengige eksperimenter. Statistiske sammenligninger ble gjort ved hjelp av enveis variansanalyse (ANOVA),
p product: * 0,05 ble ansett å være betydelig forskjell,
p
** 0,01 og
p
##
0,01 ble ansett for å være svært betydelig forskjell.
Resultater
Gyp synergi potenserer 5-Fu-indusert celleviabilitet hemming
Fig 1B viser cytotoksisitet av 5-Fu på SW -480, SW-620 og Caco2 celler for behandling henholdsvis 48 timer. Caco2-celler utførte mer følsomme enn SW-480 og SW-620-celler til 5-FU behandling (IC50-verdien ble beregnet til 31,75 pg /ml for Caco2 og 257,23, 366.40 ug /ml for SW-480, SW-620 celler). Når konsentrasjonen overstiger 50 ug /ml, SW-480 SW-620 og celle viser noe motstand mot 5-FU-behandling. Imidlertid Gyp hemmet SW-480, SW-620 og Caco2-celleformering i en dose- og tidsavhengig måte (IC50-verdi ble beregnet som 99,59, 107,53 og 112,22 ug /ml for SW-480 SW-620, og Caco2-celler etter inkubering i 24 timer, figur 1C-1E). Når co-behandlede celler med Gyp (70, 85, 100 ug /ml) og 5-FU (5, 10 ug /ml) samtidig, vises den kombinerte behandling, selv i lave doser langt høyere anti-proliferativ aktivitet på SW-480 , SW-620 og Caco2-celler enn for enkelt behandling. For eksempel behandling av SW-480 celler med 5 mikrogram /ml 5-Fu eller 70 mikrogram /ml Gyp alene for 24 timer hemmet celleviabilitet med 14,6 ± 2,67% (
p
˂ 0,05
vs
kontroll) og 13,8 ± 2,80% (
p
˂ 0,05
vs
kontroll), henholdsvis. Likevel behandling av SW-480 celler med 5 mikrogram /ml 5-Fu + 70 ug /ml Gyp for 24 timer betydelig hemmet celle levedyktighet ved 53,29 ± 1,02% (
p
˂ 0,01
vs
kontroll og 5-Fu alene). Når inkubasjonstiden ble øket til 48 h, cellelevedyktigheten hemming av 5 ug /ml 5-FU var 32,37 ± 3,22% (
p
˂ 0,01
vs
kontroll), 70 ug /ml Gyp var 24,87 ± 1,83% (
p
˂ 0,01
vs
kontroll), 5 mikrogram /ml 5-Fu + 70 ug /ml Gyp var 72,11 ± 1,53% (
p
˂ 0,01
vs
kontroll og 5-Fu alene).
for ytterligere å validere synergistisk trekk ved 5-Fu og Gyp, de celleviabilitet hemming effekter av singelen og kombinert behandling ble analysert ved hjelp av CalcuSyn programvare. CI verdi for 5-Fu + Gyp behandling SW-480 celler var 0,68 ± 0,05, SW-620 celler var 0,65 ± 0,10 og Caco2 celler var 0,72 ± 0,07 under de anvendte doser (fig 1C-1E). For SW-480-celler, viste kombinasjonen av 5-FU (5 ug /ml) og Gyp (70 ug /ml), den beste synergistiske inhibering kapasitet (CI verdiene 0,63 og 0,68 for 24 og 48 h), som ble utvalgt for videre mekanistiske studier. Videre har 5-Fu og Gyp i kombinasjon utviste mye svakere giftighet overfor normalt humant navlevene endotelceller HUVEC (figur 1F).
Colony formasjonstest ble utført for å ytterligere verifisere den proliferative potensial til SW-480 og Caco2-celler etter fem-Fu og /eller Gyp behandling. Fig 1G viste at 5-Fu, Gyp, 5-Fu + Gyp alt hemme langsiktig proliferativ potensialet av SW-480 eller Caco2-celler, sammenlignet med ubehandlede gruppen (
p
0,01 vs kontroll), og den viktigste en med færre kolon dannelse ble observert i 5-Fu + Gyp gruppe (
p
0,01 vs 5-Fu eller Gyp alene).
apoptotisk respons utløst av 5- Fu og /eller Gyp
Som vist i figur 2A, i ubehandlet kontroll, 93,35 ± 0,84% var levedyktige, 0,2 ± 0,06% cellepopulasjonen var i tidlig stadium av apoptose (nederst til høyre) og 2,75 ± 1,32% cellepopulasjonen var i sent stadium av apoptose (øverst til høyre). I 5-Fu behandlingsgruppen, den apoptotiske cellen befolkningen (nederst til høyre og øverst til høyre) var 3,65 ± 0,81%. I Gyp behandlingsgruppen, 20.6 ± 1.63% cellene var i den fasen av apoptose (
p
0,01
vs
kontroll). Mens i 5-Fu + Gyp gruppe, 42,15 ± 0,67% cellene var i apoptotiske scenen (
p
0,01
vs
kontroll og 5-Fu alene).
(A) Celle apoptose ble påvist ved Annexin V-PE /7-AAD-analyse etter 5-FU og /eller Gyp behandling i 24 timer i SW-480-celler. (B) Ekspresjonsnivået av kaspase 3, caspase 9, Bcl-2 og spaltet PARP-i SW-480-celler ble påvist ved western blotting. (C) Nuclear kondens og cellemorfologi endring i SW-480 celler etter 5-Fu samtidig behandling med Gyp ble observert ved bruk av Hoechst 33342 farging. Forsøkene ble gjort uavhengig i tre eksemplarer per eksperimentell punkt, og representative resultater ble vist. Alle data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD av tre paralleller og
p product: * 0,05,
p
** 0,01 versus kontroll.
Western blotting ble utført for å analyse potensialet mekanisme jobbet i 5-Fu og Gyp utløst apoptose. Som vist i figur 2B, 5-Fu + Gyp sterkt forbedret kaspase 3, caspase 9 og PARP-spaltning og ned-regulert ekspresjon av anti-apoptotiske protein Bcl-2 i SW-480 celler (
p
0,01 eller
p
0,05
vs
kontroll)
Morfologiske endringer indusert av 5-Fu og Gyp på SW-480 celler
fig 2C. viser morfologiske endringer etter fem-Fu og /eller Gyp behandling ved hjelp av Hoechst 33342 farging. Svakt blå og homogene celler ble observert i kontrollgruppen; 5-Fu eller Gyp behandlede celler viste liten forbedring av Hoechst 33342 flekker; mens i 5-Fu + Gyp gruppe celler utøves bemerkelsesverdig endringer: kondensert kromatin, fragmentert Punktum blå atom fluorescens. I tillegg til fase bildene viste at cellene i 5-Fu + Gyp behandlingsgruppen var krympet til unormal rund type, og celletall ble også reduseres betraktelig.
Effekter av 5-FU og /eller Gyp på celle syklus distribusjon
Flowcytometri analysere i figur 3A viser at sammenlignet med kontrollgruppen (G0 /G1-fasen, 33,8 ± 1,06%, S-fase, 28,25 ± 0,59%, og G2 /M-fase, 37,94 ± 0,65 %), var det en oppsamling av cellepopulasjon i G0 /G1-fase (51,56 ± 1,08%,
p
0,01
vs
kontroll) og S-fase (36,6 ± 0,91%
p
˂ 0,05
vs
kontroll) etter fem-Fu behandling. Gyp indusert en opphopning av cellepopulasjon i G0 /G1-fasen (45,97 ± 1,06%,
p
0,01
vs
kontroll). I 5-Fu + Gyp behandlingsgruppen, var det flere celler i G0 /G1-fasen (56,58 ± 0,57%,
p
0,01
vs
kontroll) og S-fase (38,78 ± 0,46%,
p
0,05
vs
kontroll). En lignende tendens ble også funnet etter 5-FU, Gyp eller 5-FU + Gyp behandling i 48 timer.
(A) Celle syklus fordeling etter 5-FU og Gyp behandling. (B) Ekspresjon av fosfo-p53, fosfo-CDK2 og cyclin E etter 5-FU og /eller Gyp behandling i SW-480-celler ble påvist ved western blotting. Forsøkene ble gjort uavhengig i tre eksemplarer per eksperimentell punkt, og representative resultater ble vist. Alle data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD av tre paralleller og
p product: * 0,05,
p
** 0,01 versus kontroll.
uttrykk for fosfor-p53, fosfor-CDK2 og cyclin E i SW-480 celler etter 5-Fu og /eller Gyp behandling ble oppdaget av western blotting. Som vist i figur 3B, 5-Fu + Gyp merkbart øket ekspresjon av fosfo-p53, men redusert ekspresjon av cyclin E og fosfo-cdk2 (
p
0,01 eller
p
0,05
vs
kontroll) etter 24 og 48 timers inkubasjon
DNA skade respons indusert av 5-Fu, Gyp og 5-Fu + Gyp
Som beskrevet i. metodene, flowcytometri analyse ble utført for å undersøke effekten av 5-Fu + Gyp behandling på DNA fragmentering i SW-480 celler. Figur 4A viser at nivået av DNA-fragmentering i kontrollgruppen var 4,66 ± 1,55%. Etter å ha blitt behandlet med 5-Fu, Gyp eller 5-Fu + Gyp i 24 timer, var det en økende trend (8,2 ± 0,48%, 15,4 ± 2,74%, og 45,15 ± 1,63%, henholdsvis) på DNA-fragmentering nivåer. Graden av DNA fragmentering i 5-Fu + Gyp behandlede gruppen var signifikant økt (
p
0,01
vs
kontroll og 5-Fu alene). Et lignende fenomen ble funnet etter 48 timers inkubasjon og DNA fragmentering ble økt til 64,65 ± 3,62% (
p
0,01
vs
kontroll og 5-Fu alene) etter fem-Fu + Gyp behandling når DNA-fragmentering i kontroll, 5-Fu, og Gyp alene gruppen var 4,2 ± 0,81%, 20,85 ± 2,70% og 24,80 ± 1,96%, henholdsvis.
(A) DNA-fragmentering ble oppdaget ved hjelp av flyt cytometri etter 5-Fu, Gyp og 5-Fu + Gyp behandling i SW-480 celler etter 24 og 48 timer. Histogrammer viste antall celle kanaler (vertikal akse) vs. PI fluorescens (horisontal akse). (B) Comet assay ble utført for påvisning av DNA skader etter 5-Fu samtidig behandling med Gyp. (C) Ekspresjonsnivået av Ser139-Histone H2A.X ble bestemt ved anvendelse av Western blotting. Forsøkene ble gjort uavhengig i tre eksemplarer per eksperimentell punkt, og representative resultater ble vist. Alle data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD av tre paralleller og
p product: * 0,05,
p
** 0,01 versus kontroll;
p
##
0,01 versus 5-Fu eller Gyp alene gruppen.
Comet assay og uttrykk for γH2A.X ble utført for å ytterligere bekrefte at DNA-skade ble forverret av 5-Fu kombinert med Gyp. Figur 4B viser at 5-Fu, Gyp og 5-FU + Gyp alle induserte varierende grad av DNA-skade sammenlignet med ubehandlet kontrollgruppe, og de mest signifikante en med flere celler produserte en stor hale av komet ble observert i 5-Fu + Gyp gruppe. Fig 4C viser at 5-Fu kombinert med Gyp forverret fosforylering av γH2A.X.
ROS akkumulering etter 5-Fu + Gyp behandling
Intracellulær ROS ble oppdaget av DCFH-DA flekker på seks og 12 timer etter forskjellige behandlinger. Som figur 5A illustrert, sammenlignet med kontrollceller i 5-Fu + Gyp-gruppen viste sterk DCF fluorescens ved 6 og 12 timer etter behandling, celle i Gyp-gruppen viste noen synlig DCF fluorescens ved 6 timer og litt forbedret etter 12 timer, mens ingen åpenbar fluorescens ble observert i 5-FU alene gruppe. For ytterligere å validere rolle ROS i anti-tumor effekt av 5-FU + Gyp, ble NAC tilsatt for å redusere den ROS nivå, og DNA-skade og celle apoptose ble analysert. Resultatene viste at NAC co-behandling effektivt undertrykt den intracellulære ROS produksjon med DCF fluorescens forsvant (Fig 5B). DNA skader forårsaket av 5-Fu + Gyp behandling ble delvis reddet av NAC (
p
0,01
vs
kontroll, figur 5C). 5-Fu + Gyp forårsaket celle apoptose ble også betydelig forhindret ved NAC (
p
0,01
vs
kontroll, figur 5D).
(A) Intracellulær ROS produksjon etter fem-Fu og /eller Gyp behandlingen ble oppdaget ved hjelp DCFH-DA farging. (B-D) Intracellulær ROS produksjon, DNA fragmentering og celle apoptose i SW-480 celler ble målt etter lagt NAC til kultur medium samtidig med 5-Fu og Gyp. Forsøkene ble gjort uavhengig i tre eksemplarer per eksperimentell punkt, og representative resultater ble vist. Alle data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD av tre paralleller og
p
** 0,01 versus kontroll;
p
##
0,01 versus 5-Fu + Gyp gruppe.
Rolle av p53 i 5-Fu + Gyp behandling
dreven produksjon av ROS kan skade DNA og provosere p53 aktivitet for å indusere cellesyklus arrest og apoptose [26,27]. Våre resultater p53 fosforylering ble betydelig økt etter 5-Fu + Gyp behandling (figur 3B). For ytterligere å undersøke rollen av p53 i 5-Fu co-behandlet med Gyp-indusert apoptose, pifithrin-α, en inhibitor av p53, ble tilsatt for å redusere ekspresjon av p53, og deretter intracellulær ROS nivå, DNA-skade og cellelevedyktigheten ble oppdaget. Fig 6A antyder at pifithrin-α bemerkelsesverdig reversert fem-Fu + Gyp-indusert celledød i SW-480 celler med celle levedyktighet ble økt fra 47,49 ± 2,1% til 79,22 ± 0,63% (
p
0,01
vs
kontroll). Imidlertid, samtidig behandling med pifithrin-α ikke påvirker den intracellulære akkumuleringen ROS og alvorlige DNA-skade forårsaket av 5-FU + Gyp behandling (Fig 6B og 6C).
(A) Cellenes levedyktighet, (B) intracellulær ROS produksjon og (C) DNA-skade ble detektert etter tilsatt pifithrin-α til kulturmediet samtidig med 5-Fu plus Gyp. Forsøkene ble gjort uavhengig i tre eksemplarer per eksperimentell punkt, og representative resultater ble vist.
