Abstract
Formål
De fleste pasienter som lider av avansert lungekreft dø i løpet av få måneder. For å utnytte nye terapiregimer vi trenger bedre metoder for vurdering av en terapirespons.
Materiale og metode
I en pilotstudie vi prospektivt inkludert 36 pasienter med avansert NSCLC og SCLC (34 stadium IV , 2 stadium IIIB) hvorav 34 fikk standard platina-basert kjemoterapi /strålebehandling og to ble behandlet med en tyrosinkinasehemmer. Vi målte nivåene av ekstracellulære metylert
SHOX2
DNA (
mSHOX2
) i plasma før og under behandling før re-oppsetningen.
mSHOX2
analyse ble blindet med hensyn til kliniske data gjør det til en observasjonsstudie.
Resultater
Ifølge re-oppsetningen av 31 førstelinjepasientene, 19 pasienter ble klassifisert som ikke-respondere mens 12 pasienter var i responder gruppe. Vi observerte en tett korrelasjon mellom radiologiske data og endring av plasma
mSHOX2
nivå som tilsvarende for en terapi respons. En ROC-analyse viste en høy diskriminerende effekt for begge pasientgrupper allerede en uke etter behandling start (AUC 0,844). I tillegg er en Kaplan-Meier og Cox analyser avslørte en sterk sammenheng mellom overlevelse og plasma
mSHOX2
verdi p≤0.001 (hazard ratio 11,08) gi noen bevis for
mSHOX2
også være en prediktiv markør.
Konklusjon
lengdemåling av ekstracellulært plasma
mSHOX2
DNA gir informasjon om responsen på cytotoksisk behandling og tillater en tidlig vurdering av behandlingsrespons for lungekreftpasienter. Hvis bekreftet i en større studie dette ville være et verdifullt verktøy for å velge og guiding en cytotoksisk behandling
Citation. Schmidt B, Beyer J, Dietrich D, Bork jeg, Liebenberg V, Fleischhacker M (2015) Kvantifisering av Cell-Free
mSHOX2
Plasma DNA for terapi Monitoring i avansert stadium ikke-småcellet (NSCLC) og småcellet lungekreft (SCLC) Pasienter. PLoS ONE 10 (2): e0118195. doi: 10,1371 /journal.pone.0118195
Academic Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, UNITED STATES
mottatt: 16 september 2014; Godkjent: 06.01.2015; Publisert: 12 februar 2015
Copyright: © 2015 Schmidt et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Kirstin Diehl Stiftung. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Metanomics Health GmbH gitt støtte i form av lønn for forfattere [Volker Liebenberg], men hadde ikke noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. De spesifikke roller disse forfatterne er formulert i § «forfatter bidrag «
Konkurrerende interesser:. Volker Liebenberg har vært ansatt Metanomics Health GmbH fra 2010 til juli 2012. Metanomics Health GmbH er et 100% datterselskap av BASF kjemisk selskap og har ikke vært aktiv i forskning eller utvikling av DNA-relatert lungekreft biomarkører før eller under den tiden av Volker Liebenberg sysselsetting. Volker Liebenberg og Dimo Dietrich har vært ansatte og er aksjonærer Epigenomics AG, et selskap som har som mål å kommersialisere DNA metylering markør SHOX2. Volker Liebenberg og Dimo Dietrich er coinventors og egne patenter på metylering biomarkører og relaterte teknologier. Patenter: «Fremgangsmåte for amplifisering av nukleinsyrer» (WO2006113770), «A Method for overhenget Beskyttelse i DNA-amplifikasjon Systems Targeting Metylering Analyse oppnås ved et modifisert Forbehandling av nukleinsyrer» (WO2006040187). Disse patentene blir utnyttet kommersielt ved Epigenomics AG. Volker Liebenberg og Dimo Dietrich motta oppfinner kompensasjon fra Epigenomics AG. Michael Fleischhacker, Bernd Schmidt og Dimo Dietrich er coinventors av et patent. Patent: «Metoder for å vurdere behandlingsrespons av kreftpasienter og for behandling av kreftpasienter ved å analysere CpG metylering» (Application Nummer: 62076674, patentsøkt). Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Lungekreft er fortsatt et helseproblem, og i 2012 var det mer enn 409 000 nye lunge krefttilfeller i Europa [1]. De fem års overlevelse for lungekreft i alle ledd er 16% og bare litt bedre enn det var for 30 år siden [2]. I de senere årene har flere nye terapiregimer ble innført inkludert en rekke ulike multimodale behandlinger for pasienter med lokalt avansert, sent stadium og metastatisk sykdom [3]. Fremskritt i systemisk behandling ikke bare føre til en bedre overlevelse, men også til en reduksjon av kreftrelaterte symptomer og en høyere livskvalitet [4]. Ikke desto mindre, er det terapeutiske vinduet fortsatt liten, og det er viktig å ha en metode for tidlig respons evaluering for å velge den optimale behandlingen. Metoden for valg for vurdering av behandlingsrespons er en re-oppsetningen etter to til fire sykluser med systemisk behandling (dvs. etter 6 til 12 uker) med en avbildningsteknikk som CT, MR eller PET. Bortsett fra de høye kostnadene, er disse teknikkene er ikke svært følsom [5] [6]. Et alternativ ville være bruk av biomarkører som
Cyfra-21
,
SCCA
,
CEA Hotell og
CA-125
for NSCLC pasienter og
ProGRP Hotell og
NSE
for SCLC pasienter å relatere dem med terapi svar [7]. Dessverre er det ingen universell markør som nyttig for alle forskjellige lungekreft histologier og det er ikke nok bevis for noen av dem å bli rutinemessig brukt i klinikken.
Mandel og Metais var de første til å beskrive sin observasjon av tilstedeværelsen av ekstracellulære nukleinsyrer i mennesker [8]. Tumorassosierte genetiske endringer kan bli funnet i cellefrie nukleinsyrer isolert fra alle forskjellige kroppsvæsker [9,10] [11]. Ifølge vår nåværende kunnskap alle tumorassosierte endringer som finnes i tumorceller kan også påvises i ekstracellulære nukleinsyrer, inkludert epigenetiske forandringer assosiert med utviklingen av ondartede svulster. DNA metylering og cytosin metylering er et kjennetegn på pattedyr kromatin, spille en rolle i reguleringen av utviklingen, og er viktig i grunnleggende biologiske prosesser som embryogenese og celledifferensiering [12] [13]. Som sådan, regulerer DNA metylering gentranskripsjon og epigenetiske endringer i onkogener og tumorsuppressorgener og er av sentral betydning for kreftutvikling [14]. Nylig, metylering av
SHOX2
genet (
mSHOX2
) har blitt beskrevet som en roman og kraftig markør for tidlig deteksjon av pasienter med lungekreft basert på analyse av bronchial aspirates og plasma [15] [16] [17], evaluering av paramalignant og ondartede plevravæske [18], undersøkelse av nål aspirates for lungekreft iscenesettelsen [19] og som en prediktor for utfallet i NSCLC pasienter [20]. Denne studien ble utført for å evaluere i) om kvantitativ analyse av
mSHOX2
plasma DNA korrelerer med behandlingsrespons i lungekreftpasienter og ii) for å finne det beste tidspunktet for å utføre analysen av denne biomarkør.
Materiale og metode
pasienter
Vi prospektivt inkludert 36 pasienter som ble fortløpende henvist til vår poliklinikk for diagnostikk og behandling av lungekreft. Vi inkluderte pasienter med et sent stadium /avansert histologisk påvist lungesvulst (uavhengig av typ av lungekreft) som var kvalifisert for en chemo /radio-kjemoterapi og hadde signert skriftlig samtykke til å delta i denne studien. Når de kliniske data Wase kombinert med
mSHOX2
målinger vi innså at fem pasienter hadde fått en behandling før innmelding i vår studie. Alle andre 31 pasienter fikk en førstelinjebehandling. Detaljene i de kliniske data av alle pasientene er oppsummert i tabellene 1-3. Prøvene for histopatologisk diagnose ble oppnådd ved bronkoskopi og /eller computertomografi (CT). Alle unntatt én pasient fikk en standard platina-basert kjemoterapi og eventuelt en ekstra strålebehandling i henhold til gjeldende retningslinjer. [21]. Som en del av den diagnostiske opparbeidelse alle lungekreftpasienter blir screenet for EGFR mutasjoner. Pasienter UKH10 og UKH 031 demonstrerte en aktiverende EGFR mutasjon og ble behandlet med Erlotinib. pasientene ble re-iscenesatt av leger i den lokale svulsten styret basert på repeat-CT etter tre terapi sykluser. Responsen evaluering og tildeling av pasienten som respondere og non-respondere, henholdsvis ble utført i henhold til RECIST v1.1 kriterier. Studien er godkjent av Institutional Review Board (IRB) ved Universitetssykehuset i Halle /Saale. Informert samtykke (skriftlig) ble innhentet fra alle givere.
Utarbeidelse av plasmaprøver
Vi har fått 2 × 8,5 ml EDTA blod fra alle pasienter på den tiden diagnose (pre-terapi = grunnlinje), og hver gang de pasienter ble undersøkt for deres blodtellinger, eller når de fikk en kjemoterapi behandling (vanligvis i intervaller på 7 til 10 dager). Pasientene ble fulgt fram til slutten av tre terapi sykluser, dvs. tidspunktet for re-oppsetningen. Plasmaet ble fremstilt ved å spinne blodprøver (i løpet av 1 til 2 timer etter blodprøvetaking) i 15 minutter ved 500 X g. Etter nøye overføring av plasmaet supernatanten til et nytt rør prøven ble sentrifugert for andre gang i 15 minutter ved 2500x g. Alle prøver ble lagret i 3-4 ml porsjoner ved -80 ° C inntil bruk.
Sanntids kvantifisering av
mSHOX2
plasma DNA
Free-sirkulerende DNA fra 3,5 ml plasmaprøver ble isolert og bisulfite omregnet til Epi proColon Plasma Hurtig Kit (Epigenomics AG, Berlin, Tyskland). DNA isolering og bisulfite konverteringen ble utført etter instruksjon med mindre modifikasjoner. DNA ble til slutt eluert fra perlene med 68 ul elueringsbuffer. Sammen med pasientprøvene vi målt en kalibrator prøve (dvs. 5 ng kunstig metylert bisulfite konvertert DNA). Den følsomme og kvantitativ analyse av qPCR
mSHOX2
ble utført som tidligere beskrevet [16]) [18]. Hver prøve ble målt i seks PCR gjentak og en relativ metylering verdi (= PMR, prosent metylering referanse) for
mSHOX2
ble beregnet ved hjelp av tilpasset ΔΔCT metoden [16].
mSHOX2
DNA kvantifisering ble utført etter alt prospektivt innsamlede plasmaprøver var ferdig, det vil si noe som gjør denne analysen en observasjonsstudie.
statistikker
Forskjeller av metylering nivåer (PMR) i blodplasma fra reponders og non-respondere på grunnlinjen og oppfølgings tidspunkter 1-8 ble testet med uparede to-utvalgs Wilcox tester (Mann Whitney) gitt at PMR dataene ikke var normalfordelt. P-verdiene ble Bonferroni korrigert. Andre beskrivende dataegenskaper som ble brukt var median og median absolutt avvik (MAD). Responder Operatør Kjennetegn (ROC) kurver ble brukt til å visualisere evnen til
SHOX2
markør for å diskriminere mellom respondere og non-respondere på ulike tidspunkter. Total overlevelse ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier og univariate Cox regresjonsmodeller. Analysene ble utført med SPSS 21 programvarepakken (IBM, Armonk, NY) og henholdsvis R, [22].
Resultater
Tildelingen av de 36 prospektivt inkluderte pasientene i respondere og non-respondere, henholdsvis var helt uavhengig av
mSHOX2
analyse. Tretti en pasienter fikk en førstelinjebehandling (tabell 1 og 2), mens fem pasienter hadde blitt behandlet før innmelding i studien (Tabell 3). Alle bortsett fra to pasienter viste en villtype
EGFR
gen og fikk en standard platinabasert kjemoterapi, mens de to pasientene med en aktive
EGFR
mutasjon ble behandlet med TKI. Syv av disse 31 pasientene viste en baseline PMR verdi ≤ 1% som antas å være den grad av teknisk /biologisk variasjon. De kliniske data fra de 31 pasientene er oppsummert i tabellene 1 og 2. Alle pasienter som klinisk reagerte på terapien viste en reduksjon av deres
mSHOX2
plasma-DNA (fig. 1). I denne gruppen av respondere en nedgang på
mSHOX2
DNA ble sett i de fleste pasienter som allerede på tidspunktet for første blodprøvetaking (dvs. dag 7-10 etter behandling start). Median PMR verdier av pasienter som responderte på behandlingen var 4,06% ved start og falt til 0,62%, 0,12%, 0,05% ved blod trekker 1, 2 og 3 etter terapi start. I motsetning til 8/19 av de ikke-responderende pasienter viste en reduksjon av
mSHOX2
etter behandlingsstart, men
mSHOX2
nivåer endret ikke så mye som i de responderende pasienter (fig. 1). Faktisk median
mSHOX2
verdier i denne gruppen av ikke-respondere var 26,45% ved start og falt til 6,86%, 7,78%, 7,96% ved blod trekker 1, 2 og 3 etter terapi start. Ingen av de ikke-responderende pasienter som demonstrerte en
mSHOX2
verdi på ≥ 1% pre-terapi (varierer fra 1,1% til 362%) viste en vedvarende reduksjon under 1% PMR. (Fig. 1) .Dette observasjon gjelder også for pasient UKH 010 som demonstrerte en aktiverende EGFR mutasjon, men ikke svare på det TKI behandling (Tabell 3).
Pasientene inkludert i dette tallet er begrenset til de med en baseline mSHOX2 verdi på minst 1% PMR. Den første blodprøvetaking (x = 0) er poenget med diagnosen, dvs. før behandling og definerer grunnlinjen metylering av SHOX2. For første åtte blodet trekker Bonferroni korrigert p-verdier fra uparede to sample Wilcox tester er gitt nederst.
De PMR verdiene beregnes som relative mengder av
mSHOX2
genet sammenlignet med ß-aktin referanse genet (
ACTB
).
SHOX2
locus er ofte forsterket i lungesvulster (Schneider et al BMC Cancer 2011) og denne kopien nummer variasjon fører til
mSHOX2
PMRS over 100% i pasienter med svært høye nivåer av frie sirkulerende svulst DNA.
median PMR for
mSHOX2
ved baseline var 4,06% for de 12 responders og 26,45% for de 19 ikke-respondere, men denne forskjellen er ikke signifikant. Interessant, ROC kurven analyser for de 24 pasienter med PMR ≥ 1% viste at utgangsverdier
mSHOX2
ikke diskriminere mellom respondere og non-respondere (arealet under kurven 0,593), mens en diskriminering av disse to pasientpopulasjoner basert på verdiene som ble oppnådd etter starten av behandlingen viste en høy sensitivitet og spesifisitet allerede begynner ved blod tegner en med en AUC på 0,844 som økte til 1,000 ved blod trekke 7 (fig. 2). Klassifiseringen av pasientene som respondere og non-respondere er basert på CT-skanner som gullstandarden som ble utført av den lokale svulsten styret og var helt uavhengig av
mSHOX2
målinger.
Only pasienter med baseline PMR ≥ 1% ble inkludert. Den første blodprøvetaking (tid 0) er det punktet før behandling (= baseline metylering). Blood trekker 1-8 ble tatt under behandling i intervaller på 7 til 10 dager.
En Kaplan-Meier analyse, inkludert de 31 pasientene (dvs. 24 pasienter med et PMR ≥ 1% pluss 7 pasienter med et PMR ≤ 1%) viste en sterk sammenheng mellom overlevelse og en CT-basert tildeling av pasienter i responder og ikke-responder. Hazard ratio i denne beregningen er 18 og P-verdi ≤ 0,00003 (data ikke vist). Interessant er det en tilsvarende sterk sammenheng mellom overlevelse og PMR av
mSHOX2
. Når PMR verdier fra alle 36 pasienter ble brukt for en Kaplan-Meier analyse kunne vi vise at selv plasma
mSHOX2
utgangsnivået viste en trend mot betydning (Fig. 3). På blod tegne en denne forskjellen nådde statistisk signifikans som kan tolkes som bevis på at denne markøren har også en prediktiv verdi.
Median plasma
mSHOX2
verdi ved baseline var 2,88% PMR, mens median en uke etter behandling start var 2,16% PMR.
Diskusjoner
på grunn av flere kraftige legemidler [23] og innføring av en målrettet terapi for molekylært utvalgte undergrupper av pasienter som pasienter med en
EGFR
aktivering mutasjon, imponerende forbedringer i behandlingen av lungekreftpasienter ble oppnådd [24]. I tillegg har mer effektive vedlikeholdsregime vist gunstige effekter for pasienter med avansert stadium NSCLC. Det er også en overlevelse fordel for pasienter som behandles med andre kjemoterapi sammenlignet med beste støttebehandling og kliniske studier teste nye kombinasjoner i den andre linjen setting for refraktær sykdom ble igangsatt [25] [26]. For å velge den beste behandling, en rask, bestemt og følsom metode for vurdering av en terapi responsen er av avgjørende betydning. Standard prosedyre for avanserte stadium lungekreftpasienter etter induksjonsbehandling er en CT scan for å vurdere tumorrespons [21]. Bortsett fra omkostningene, følsomheten av denne avbildningsteknikk er ikke svært høy, og den inter-observatør variasjoner i måling av tumorstørrelsen er utsatt for feiltolkning av tumorrespons [27].
I de siste årene flere biomarkører har blitt testet for sin nytteverdi som en indikator for terapi overvåking. Blant dem var åtte immunhistokjemiske biomarkører, ingen som kunne forutsi kjemoterapi respons og overlevelse, og det var bare en svak sammenheng mellom markør nivå og behandlingsrespons [28]. Neuron spesifikk enolase (
NSE
) ble anvendt for å overvåke SCLC pasienter og ble funnet å være bare nyttig for pasienter med en økt før behandling [29]. Nivåene av laktat dehydrogenase og kromogranin A korrelerte ikke med behandlingsrespons [30]. Et langsgående måling av løselig interleukin 2 reseptor viste en reduksjon i serumkonsentrasjonen i løpet av en behandling, men var ikke tegn til sykdomsremisjon [31] og tymidinkinase var ute av stand til å skille mellom de ulike gruppene av responslungekreftpasienter [32]. Det er noen flere biomarkører for terapi overvåking i lungekreftpasienter som
Cyfra 21-1 Hotell og nucleosome nivåer som kan være bedre egnet, men ingen av dem er rutinemessig brukt i klinikken [33] [34] [35] [36]. I tillegg er det et økende antall gener som er vist å være hyper- eller hypomethylated i lungekreftpasienter som kan være nyttige som biomarkører [37]. De mest analyserte genene som
p16
,
DAPK
,
APC
,
RASSF1A
,
MGMT
,
FHIT
,
RARß og GSTP1
ble brukt som et middel til å oppdage lungekreft eller som prognostisk faktor, men ingen av dem hadde blitt brukt til terapi overvåking. Interstingly, alle disse metylering markører kan ikke bare påvises i vevet, men ble også funnet i ekstracellulære nukleinsyrer isolert fra bronkial lavage supernatanter, oppspytt, plasma eller serum [37]. Målet med denne analysen var å svare på spørsmålet om en kvantitativ måling av
mSHOX2
plasma DNA ved hjelp av en real-time PCR er et nyttig verktøy for å følge avanserte stadium lungekreftpasienter som får cellegift /radio-kjemoterapi. Derfor innrullert vi alle kvalifiserte pasienter som ble fortløpende tatt opp til vår poliklinikk. Vi vurderte denne tilnærmingen en proof-of-prinsippet studier og på grunn av dette vi var mer interessert i å inkludere så mange pasienter som mulig i stedet for å etablere en enhetlig pasient kohort. Som en konsekvens av histologisk fordeling av pasientene inkludert i denne analysen ikke samsvarer nøyaktig de tallene som er oppgitt i litteraturen [38].
Våre resultater viser at en kvantitativ bestemmelse av plasma
mSHOX2
DNA synes å være anvendelig for overvåkning av et behandlingsrespons for avansert stadium lungekreftpasienter. Turn-over frekvensen av celle-fri DNA er ganske høy som halveringstiden av ekstracellulære nukleinsyrer ble bestemt til å være mindre enn seks timer i en dyremodell [39]. Dette samsvarer godt med vår observasjon av en rask og sterk nedgang på plasma
mSHOX2
DNA hos pasienter som responderte på behandlingen som gjelder for overvåking av NSCLC og SCLC pasienter likt. En ekstra fordel med denne metoden er at dette også gjelder for pasienter med en svært lav pre-terapeutisk
mSHOX2
verdi. Vi demonstrerte at en
mSHOX2
måling tatt en uke etter starten av en behandling er i stand til å skille mellom respondere og ikke-respondere med en meget høy spesifisitet. Hvis dette resultatet kan verifiseres i en stor studie, leger har mulighet til å bytte behandling eller reserve pasienter fra en ugyldig terapi. I tillegg brukte vi data fra alle 36 pasienter, dvs. inkludert pasienter med
mSHOX2
baseline verdi på null og andre linjer pasienter for en Kaplan-Meier overlevelseskurve analyse. Interessant, vi viste at pasienter med baseline plasma
mSHOX2
nivå under medianen hadde en litt lengre overlevelsestid. Når ble utført denne analysen på blod tegne en etter behandlingen starte denne forskjellen mellom pasienter som responderte på behandlingen og ikke-respondere var statistisk signifikant med en p ≤ 0,001. Spørsmålet om pasienter med en svært lav
mSHOX2
grunnverdi oppfører seg annerledes enn pasienter med høy (ere)
mSHOX2
nivå og om det kan være mulig å definere en pre-terapeutisk cut-off verdi som har en prediktiv betydning må bli besvart i en stor studie som vil bli gjennomført i en multisentrisk tilnærming.
fra våre resultater kan vi konkludere med at målinger av plasma
mSHOX2
nivå er en refleksjon av det kliniske forløpet av sent stadium lungekreftpasienter som får en systemisk behandling. En slik analyse gir en raskere og mer følsom bestemmelse av tumorrespons og terapi overvåking enn en CT scan. Enten måling av ekstracellulære
mSHOX2
DNA i plasma kan også ha en prediktiv verdi må bli demonstrert i fremtidige studier.
Takk
Vi erkjenner sterkt deltakelse av pasientene i denne studien, og ved hjelp av Dana Reinicke og Ute Völker. De Epi proLung BL Refleks Analysene ble vennlig levert av Epigenomics.
