Abstract
Bakgrunn
Flere medlemmer av sink finger protein familie har nylig vist seg å ha en rolle i kreft initiering og progresjon. Sink finger protein 367 (
ZNF367
) er et medlem av sink finger protein familie og er uttrykt i embryonale eller foster erytropoide vev, men er fraværende i normalt voksent vev.
metodikk /hovedfunnene
Vi viser at
ZNF367
er overuttrykt i adrenocortical karsinom, ondartet feokromocytom /paragangliom og skjoldbrusk kreft i forhold til normalt vev og godartede svulster. Ved hjelp av både funksjonelle knockdown og ektopisk overekspresjon i flere cellelinjer, viser vi at
ZNF367
hemmer celledeling, invasjon, migrasjon og vedheft til ekstracellulære proteiner
in vitro Hotell og
in vivo
. Integrert genet og mikroRNA uttrykk analyser viste en invers korrelasjon mellom
ZNF367 Hotell og Mir-195 uttrykk. Luciferasepreparater analyser viste at MIR-195 direkte regulerer
ZNF367
uttrykk og at MIR-195 regulerer cellulær invasjon. Videre inte alpha 3 (
ITGA3
) uttrykk ble regulert av
ZNF367
.
Konklusjon /Betydning
Våre funn tatt sammen tyder på at
ZNF367
regulerer kreft progresjon
Citation. Jain M, Zhang L, Boufraqech M, Liu-Chittenden Y, Bussey K, Demeure MJ, et al. (2014)
ZNF367
hemmer kreft progresjon og er målrettet av MIR-195. PLoS ONE 9 (7): e101423. doi: 10,1371 /journal.pone.0101423
Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA
mottatt: 12 februar 2014; Godkjent: 06.06.2014; Publisert: 21.07.2014
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av egenutført forskning program for Senter for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Noen av medforfatterne er ansatt av et kommersielt selskap -SAIC Frederick INC, det er ingen interessekonflikt. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Vår kunnskap om biologiske hendelser som hemmer eller fremmer metastatisk spredning av endokrine kreft lokalt og til fjerne områder er begrenset [1]. Forstå de molekylære hendelser som er involvert i kreftutvikling har viktige implikasjoner for identifisering av mål for terapeutisk effekt. Genomisk, genetiske og epigenetiske tilnærminger har blitt brukt til å identifisere endringer i gener /trasé, transkripsjonsfaktorer, eller genet signaturer ved å sammenligne normal, primære svulster, og /eller metastasering. Imidlertid har disse analysene ikke ofte skilles mellom arrangører, hemmere eller passasjer markører i kreft initiering og progresjon, og sjelden definere en spesifikk mekanisme for feilregulert genuttrykk.
Endocrine kreft er en mangfoldig gruppe av maligniteter som utviser hele spekteret av biologiske oppførsel av ondartede svulster: lat vekst til hurtig progredierende kreft med dårlig overlevelse. Dermed endokrine kreftformer representerer en utmerket modell for å studere de molekylære faktorer som påvirker kreft initiering og progresjon. Identifisering av genetiske endringer som er felles for disse diversely oppfører endokrin tumortyper har vist seg å spille en viktig rolle i mange typer humane cancere. For eksempel
BRAF
mutasjoner er svært utbredt i skjoldbruskkjertelen og andre kreftformer, og er assosiert med mer aggressiv sykdom i skjoldbruskkjertelkreft [2], [3].
SDHB
mutasjoner ble først identifisert i familiær paragangliom, men ble senere funnet å være utbredt i nyrekreft og gastrointestinal stromal tumor, og nylig hypofysesvulster [2], [4], [5]. Dermed oppdager de molekylære endringer knyttet til endocrine kreft initiering og /eller progresjon er sannsynlig å spille en viktig rolle i en bred gruppe av humane kreftformer.
I denne studien fant vi ut mekanismen av genuttrykk regulering og funksjon av
ZNF367
i en rekke endokrine kreft (papillær skjoldbruskkjertelkreft, adrenokortikal karsinom, feokromocytom /paragangliom).
ZNF367 plakater (også kjent som
ZFF29 Hotell og
CDC14B
) er et medlem av sink finger protein familie, med en unik Cys2His2 sink finger motivet, er uttrykt i embryonale eller føtalt erytroid vev, og er fraværende i annet normalt voksent vev [6], [7]. Nylig har flere sink finger-proteiner blitt funnet å være dysregulerte i kreft, for å fungere som tumor-suppressorer /promotorer, og for å bevirke resistens mot kjemoterapi [8] – [10]. Men rollen som
ZNF367
i kreft har ikke blitt undersøkt. Her rapporterer vi at
ZNF367
er overuttrykt i en rekke endokrine kreftformer, og at det hemmer
in vitro Hotell og
in vivo
vekst, cellular invasjon, migrasjon og vedheft . Videre
ZNF367
overekspresjon er assosiert med tap av MIR-195 uttrykk, som direkte retter seg mot
ZNF367
. Til slutt,
ITGA3
er redusert med
ZNF367
overekspresjon, etablere en MIR-195-
ZNF367 Anmeldelser –
ITGA3
akse som fungerer for å hemme kreft progresjon.
Metoder
Vevsprøver og dyrestudier
Vevsprøver ble anskaffet på en Institutional Review Board-godkjent klinisk protokoll etter å ha innhentet skriftlig informert samtykke (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01005654) . Vevsprøvene ble oppsamlet på tidspunktet for kirurgi, og de ble umiddelbart hurtigfrosset og lagret ved -80 ° C. Ett-hundre-og-fem menneskelige binyrebark (19 normal binyrebarken, 79 kortikale adenomer, 7 binyrebark karsinomer), 47 skjoldbruskkjertelen vev (8 normal, 39 papillær skjoldbruskkjertelkreft), og 68 (19 normale binyremargen, 28 godartede, 21 ondartet pheochromocytoma /paragangliom) vevsprøver ble anvendt i denne studien. All Diagnosen ble bekreftet av en endokrin patolog, og tumorprøver ble bekreftet å inneholde ≥ 80% tumorceller /kjerner. Diagnosen adrenocortical karsinom og ondartet feokromocytom /paragangliom var basert på tilstedeværelsen av brutto lokal invasjon og /eller fjernmetastaser og Weiss score på 3 for adrenokortikal karsinom. Normal binyrebarken og medulla ble samlet fra friske organdonorer ved hjelp av laser capture mikrodisseksjon under en Institutional Review Board godkjent protokollen. To offentlig tilgjengelige datasett av genom-wide genekspresjonsanalyser i binyrebark tumorprøver ble brukt for å evaluere
ZNF367
mRNA uttrykk (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-GEOD-10927 og https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-TABM-311).
The National Cancer Institute Animal Care og bruk komité godkjente protokoller for dyr omsorg og behandling i nåtiden studere. Enhver mus opplever betydelig unormale nevrologiske utfall, blødning fra enhver åpning, nedsatt bevegelighet, hurtig vekttap, svekkende diaré, grov pels, krum holdning, tung pust, slapphet, persistent recumbence, gulsott, anemi, selvpåført traumer, blir døende eller ellers blir ute av stand til å skaffe mat eller vann, eller med en svulst 2 cm eller større i diameter har blitt umiddelbart avlivet av CO
2 kammer.
cellelinjer, cellekultur, reagenser, siRNA og speil 195 transfeksjon
SW13 adrenocortical karsinom cellelinje (ATCC, Rockville, MD) ble dyrket og vedlikeholdes i DMEM media supplert med 1% insulin transferrin selen (ITS, BD Biosciences, San Jose, California) og 2,5% Nu -Serum i (BD Biosciences) i en standard fuktet inkubator ved 37 ° C i en 5% CO
2 atmosfære. Den BD140A adrenokortikal carcinoma-cellelinjen ble vennligst tilveiebrakt av Dr. Kimberly Bussey (TGEN, Pheonix, Arizona), og det ble dyrket i RPMI-medium supplert med 10% FBS (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% penicillin-streptomycin, og ett % L-glutamat. Det humane papillær skjoldbruskkjertelkreft (TPC-1) cellelinjen ble opprettholdt i DMEM supplert med FBS, penicillin (100 U /ml), streptomycin (100 ug /ml), Fungizone (250 ng /ml), TSH (10 IU /L ), og insulin (10 ug /ml). Humane embryonisk nyre (HEK293) celler ble opprettholdt i DMEM supplert med 10% FBS, 1% Pen-Strep (Gibco, Grand Island, NY) og 1% L-glutamat (Gibco). Alle cellelinjene ble godkjent av kort tandem repeat profilering 14. oktober 2012.
ZNF367 sirnas (s46962, s46963) og negative kontroll sirnas (AM4613) ble brukt ved en sluttkonsentrasjon på 80 nM (Applied Biosystems , Foster City, California). Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) ble benyttet for celle transfeksjon av siRNAs. Moden miRNA forløper, pre-MIR-195, og tilfeldig sekvens pre-MIR-negativ kontroll (Applied Biosystems) ved 5 nM ble transfektert inn i celler ved anvendelse av Lipofectamine SW13 RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA). For
ZNF367
overekspresjon i HEK293 celler, celler (8 × 10
5 i hver 6 brønn) ble transfektert med en
ZNF367
cDNA konstruere eller en tom vektor (OriGene, Rockville, MD ) ved hjelp av Lipofectamine 2000 transfeksjon reagens (Invitrogen).
Immunohistochemistry
Formalin-fiksert og parafininnstøpte vevssnitt ble de-paraffinized og deretter utvannet ved hjelp av xylen og etanol. Antigen gjenfinning ble gjennomført ved anvendelse av en 10% citrat-buffer pH 6,0 (Thermo Scientific, Lafayette, CO) i en trykkoker ved 120 ° C i 10 minutter. Vevssnitt ble inkubert med 6% hydrogenperoksyd for å slukke endogen peroksidaseaktivitet i 30 minutter (Dako, Carpinteria, CA), etterfulgt av inkubasjon med serum i en time (Dako, Carpinteria, CA). Primære anti-ZNF367 kanin polyklonalt antistoff (Sigma, St. Louis, MO; HPA015785) ved 5 ug /ml fortynning ble anvendt over natten ved 4 ° C. Anti-kanin sekundært antistoff ble anvendt (Dako Envision anti-kanin, Carpinteria, CA) i 1 time ved romtemperatur. Snittene ble utviklet ved hjelp av 3,3′-diaminobenzidin DAB som kromogen (Dako, Carpinteria, CA), og de ble kontra med hematoksylin. Snittene ble dehydrert og montert med vectamount monteringsmedium (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Den farging av ZNF367 ble evaluert ved lysmikroskopi (Nikon, Tokyo, Japan), og bildene ble skannet på 20X forstørrelse.
RNA forberedelse, revers transkripsjon og real-time kvantitativ PCR
RNA ble isolert ved anvendelse av TRIzol-reagens, i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA). Total RNA (200-500 ng) ble revers-transkribert ved hjelp av en høy kapasitet Reverse Transcription cDNA kit, og cDNA ble forsterket i henhold til produsentens instruksjoner (Applied Biosystems, Foster City, California). PCR-primere og prober for
ZNF367 plakater (Hs00400665_m1),
ITGA3 plakater (Hs01076873_m1), og
GAPDH plakater (Hs_99999905_m1) ble oppnådd fra Applied Biosystems.
Western blot
Lysates var forberedt med 1% SDS pluss 10 mM Tris [pH 7,5] buffer, og Western blot ble utført på 10% SDS-PAGE gel. Primære kanin polyklonale antistoffer, anti-ZNF367 (HPA015785, Sigma, MO, USA) og anti-ITGA3 (Sigma; SAB1100194) ble anvendt ved 5 ug /ml og 2 ug /ml, henholdsvis, og anti-GAPDH (SC-32233; Santa Cruz Bioteknologi Inc., Santa Cruz, CA) ble brukt på 1:1,000 fortynning. Sekundær anti-kanin-antistoff ble anvendt ved 1:5,000 fortynning (Cell Signaling, Danvers, MA).
Celleproliferasjon
Celler ble sådd ut ved en konsentrasjon på 2000 celler i en 96-brønns plate i seks paralleller. Den CyQUANT ™ analysesett (Invitrogen) ble brukt til å evaluere celle nummer, i henhold til produsentens instruksjoner.
klonogene analysen
HEK293 celler (8 × 10
5) ble transfektert med tom vektor eller
ZNF367
konstruere. Etter 24 timer ble cellene trypsinert, re-suspendert i media, og telles. Cellene ble på nytt utsådd i 6-brønners plater på 250, 500, og 1000 celler. Etter 10 dager, ble mediet fjernet fra brønnene og vasket to ganger med iskald PBS. Koloniene ble fiksert med 4% paraformaldehyd i 20 minutter og farget med 2 ml av krystallfiolett i 60 minutter på en gyngende plattform. Platene ble vasket tre ganger med PBS og lufttørket, og koloniene ble fotografert i FluorChem Imager (San Jose, California).
Cell invasjon og migrasjon analysen
Cellular invasjon og migrasjon var vurderes bruk av BD BioCoat Matrigel invasjonen Chamber (BD Biosciences) i henhold til produsentens protokoll. 1 x 10
5-celler ble sådd ut på innsatsene (8-um pore størrelse polykarbonat-membraner) med og uten et tynt lag av Matrigel basalmembran Matrix (BD Biosciences) strøk. Innsatsene ble plassert i bunnen brønner, med 10% serumholdig dyrkningsmedium som et kjemotiltrekkende. Platene ble inkubert i 48 timer ved 37 ° C. Celler som invaderte Matrigel matrise eller som migrerte gjennom porene uten Matrigel matrise til den nedre overflate av membranen ble fiksert og farget med Diff-Quik (Dade Behring, Newark, NJ) og tellet under et lysmikroskop i fire separate felter med Bilde J programvare (NIH, Bethesda, MD).
Cell vedheft analysen
SW13 celler ble transfektert med
ZNF367
siRNA og negativ kontroll. Etter 120 timers transfeksjon, ble cellene trypsinert, og 1 x 10
5-celler ble sådd i en 48-brønners plate inneholdende fem adhesjonsmolekyler (fibronektin, kollagen, kollagen IV, Laminin I, og Fibrinogen-) og inkubert ved 37 ° C i 90 minutter i henhold til produsentens instruksjoner (CytoSelect, Cell Biolabs, Inc., San Diego, California). Brønnene ble vasket to ganger med PBS, og 200 ul av fargeløsning ble tilsatt og inkubert i 10 minutter. Brønnene ble vasket to ganger med deionisert vann. Brønnene ble lufttørket, og 200 ul av ekstraksjon oppløsning ble tilsatt og inkubert i 10 minutter. Totalt 150 ul ble overført fra hver ekstraherte prøven til en 96-brønns plate, og absorbans målt ved 560 nm på en SpectraMax M5E mikroplateleser (Sunnyvale, California).
Genome-wide mRNA uttrykk mikromatriser
SW13 celler ble transfektert med
ZNF367
siRNA og negativ kontroll i tre eksemplarer. Etter transfeksjon ble total RNA ekstrahert ved hjelp av RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) kit, i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA revers transkripsjon, syntese, forsterkning, fragmentering, og terminal merking av 150 ng total RNA ble utført ved hjelp av Genechip WT Sense Target Merking og kontroll Reagenser (Affymetrix, Santa Clara, CA). Totalt 25 ng /mL av cDNA ble hybridisert til Affymetrix menneskelige genet 1,0 ST Array Genechip. Pathway analyse ble utført ved hjelp av bioinformatikk ressurser David (https://david.abcc.ncifcrf.gov, Frederick, MD).
I silico
identifisering av mikroRNA målretting ZNF367
MiR databaser (Target Scan (https://www.targetscan.org) og mirDB (https://mirdb.org/miRDB/) ble brukt til å identifisere mikroRNA som kan målrette
ZNF367
. Kandidat microRNAs spådd å målrette
ZNF367
ble deretter analysert for å fastslå om de var forskjellig uttrykt i adrenocortical carcioma og papillær skjoldbruskkjertelkreft.
Luciferase assay
Wild-type
ZNF367
3’UTR ble klonet inn i GoClone konstruksjon (Bryter Genomics, Menlo Park, California). mutant~~POS=TRUNC konstruere av
ZNF367
3’UTR ble oppnådd ved å innføre mutasjon i de tre første nukleotidene av frø regionen (143-150, GCTGCTA – CGAGCTA). for MIR-195 Wild-type
ZNF367
3’UTR eller mutant
ZNF367
3’UTR og den tomme 3’UTR vektor med pre- MIR-195 eller pre-NC ble co-transfektert inn SW13 celler (Bryter Genomics). Normaliserings metode for transfeksjon effektivitet i luciferase reporter analysen ble i henhold til anbefaling av koblingsanlegg Genomics (Menlo Park, California) med tom vektor brukt som positiv kontroll for transfeksjon. Den tomme 3’UTR vektoren inneholder et konstituerende promoter (finnes på alle UTR konstruerer) og luciferase genet (RenSP). Denne konstruksjonen tjente som en positiv kontroll for transfeksjon. Celler ble sådd ut i 24-brønners plater og ko-transfektert med 5 nM av MIR-195 eller den negative kontroll (Applied Biosystems), 0,12 ug av vektoren (Bryter Genomics), og 0,75 ul Lipofektamin (Invitrogen). Den luminescens ble lest etter 24 timer med Lysbryter analysesystem, ved hjelp av en SpectraMax M5E mikroplateleser.
In vivo
xenograft analysen
atymiske nakne hunnmus (fem til seks uker gamle, kroppsvekt: 20-22 g) ble hentet fra Frederick National Laboratory til kreftforskning dyrefasiliteter (Frederick, MD). Etter 48 timers transfeksjon med
ZNF367
siRNA og den negative kontroll, tre millioner celler ble resuspendert i 100 ul DMEM og Matrigel (1:01), og de ble injisert i flanken av atymiske nakne mus .
Statistiske analyser
Kontinuerlig data er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD) eller standard feil av gjennomsnittet (SEM). Den Kruskal-Wallis test ble brukt for å sammenligne nonparametric data fra tre eller flere grupper. Den t-test eller Mann-Whitney test ble brukt for å sammenligne forskjellene mellom to grupper for parametriske og parametriske variabler, henholdsvis. Pearsons korrelasjonstest ble anvendt for å identifisere korrelasjoner mellom to grupper. En
p
-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Statistisk analyse ble gjennomført ved hjelp av grafen Pad Prism 5.0 statistisk programvare.
Resultater
ZNF367
er overuttrykt i kreft
ZNF367
si overuttrykt i adrenokortikale karsinom, papillær thyroid kreft, ondartet og pheochromocytoma /paragangliom, sammenlignet med benigne og normale vevsprøver for hver tumortype (p 0,05; figur 1). ZNF367 protein ekspresjon var til stede i kjernen og cytoplasmaet. Det var sterkere ZNF367 flekker i kjernen enn i cytoplasma i hvert kreft prøve (adrenocortical kreft, papillær skjoldbruskkjertelkreft og ondartet feokromocytom /paragangliom). For å bekrefte forhøyet uttrykk for
ZNF367
i adrenocortical karsinom i et større prøvesett, analyserte vi uttrykk profilering data fra offentlig tilgjengelige datasett deponert i genuttrykk studenter. I to uavhengige genom-wide genuttrykk datasett,
ZNF367
ble overuttrykt i adrenocortical karsinom sammenlignet med binyrebark adenom og prøver normalt vev (p 0,001; figur S1). Disse funnene tyder på at
ZNF367
er overuttrykt i en rekke kreftformer, med konsistente resultater på tvers av ulike analyser og genomiske plattformer brukes.
(A og B) Expression nivå i normal binyrebarken, godartet binyrebark adenomer og binyrebark karsinomer; (C og D) normale binyremargen, godartede og ondartede feokromocytom /paragangliom vevsprøver; og (E og F) normal skjoldbruskkjertelen og papillære prøvene thyroid kreft vev. Y-aksen på hver graf representerer prosentandelen av mRNA uttrykk ved hjelp av to
∧-ΔCt * 100% metode ± SEM. * P 0,05, ** p 0,001, *** p 0,001 (Kruskal-Wallis test). Representative immunhistokjemi bildene er fra normal, godartede og ondartede kreftprøver på 20X forstørrelse.
ZNF367
hemmer celledeling, invasjon, migrasjon og vedheft
Fordi
ZNF367
er overuttrykt i endokrin kreft, undersøkte vi effekten på celleproliferasjon, invasjon, og migrasjon, hendelser som er nødvendige for kreft progresjon.
ZNF367
ble uttrykt i adrenocortical karsinom (SW13, BD140A), papillær skjoldbruskkjertelkreft (TPC-1), og HEK293 cellelinjer. Derfor brukte vi både
ZNF367
knockdown og overekspresjon tilnærminger for å bestemme effekten av
ZNF367
på celleproliferasjon, invasjon, og migrasjon. SiRNA knockdown oppnådd opptil 80% knockdown av ZNF367 mRNA og protein uttrykk i forhold til siRNA negativ kontroll (figur S2).
ZNF367
knockdown i SW13 celler, økt celleproliferasjon (30-40% )
in vitro Hotell og (3,5 ganger)
in vivo product: (p 0,05, figur 2).
ZNF367
knockdown også økt cellulær invasjon og migrasjon (p 0,05, figur 3A). Gitt den dramatiske effekten av
ZNF367
på cellular invasjon og migrasjon i SW13 celler, ble effekten av
ZNF367
knockdown på cellular invasjon og migrasjon også evaluert i BD140A, TPC-en, og HEK293 celle linjer. Knockdown hadde en lignende virkning på cellulær invasjon og migrering av BD140A, TPC-1, og HEK293-cellelinjer (p 0,05; figur 3, B-D). Effekten av
ZNF367
på cellevekst, invasjon, og migrasjon ble også bekreftet av overekspresjon
ZNF367
i HEK293 celler.
ZNF367
overekspresjon redusert cellulær invasjon, migrasjon, og kolonidannelse i forhold til den tomme vektor kontroll (figur 3E-G).
(A)
ZNF367
knockdown øker celleformering . Y-aksen representerer relative fluorescerende enheter (RFU), og X-aksen angir dager etter transfeksjon. * P 0,05 i forhold til den negative kontroll. Feilfelt representerer ± SD. (B)
ZNF367
knockdown øker tumorvekst in vivo. SW13-celler ble transfektert med den negative kontroll (n = 4) og siRNA (n = 4) i den høyre og venstre flanke av hver mus. Etter 48 timers transfeksjon, 3 x 10
6-celler ble injisert i atymiske nakne mus, og tumorvekst ble målt ukentlig. Y-aksen representerer tumorvolumet og X-aksen ukene av tumormåling etter flanke injeksjon. * P 0,05 og feilfelt representerer ± SD
ZNF367
overekspresjon reduserer cellulær invasjon og migrasjon.. (A) SW13, (B) BD104A, (C) TPC-1, og (D) HEK293-cellelinjer. Etter transfeksjon ble cellene sådd ut i en Boyden kammer i 48 timer. Cellene ble farget og telles i 4 felt. Det venstre panelet viser den representative bildet (12,5X) fra siRNA knockdown og negative kontrollgrupper. Høyre panel viser kvantitativ måling av invadert og migrerte celler i knockdown og den negative kontroll. * P 0,05 og feilfelt indikerer ± SD.
ZNF367
overekspresjon synker koloni nummer, cellular invasjon, og migrasjon i HEK293 celler. (E) Western blot av
ZNF367
overekspresjon i HEK293 og SW13 celler (tom vektor, XL4). GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. (F) Representant klonogene bilde for celler med ektopisk
ZNF367
uttrykk og den tilsvarende kontroll (tom vektor, XL4). (G) Cellular invasjon og migrasjon redusert med
ZNF367
overekspresjon i HEK293 celler. Den kvantitative måling av invaderte og migrerte celler per gruppe (HEK293-HEK293-Empty vektor eller
ZNF367
) er representert i søylediagram på høyre panel. (H) Den ekstracellulære protein feste SW13 celler med
ZNF367
knockdown. Celler ble transfektert med
ZNF367
siRNA og negativ kontroll siRNA, og ble platet inn i klebe plater og inkubert i 90 minutter. Y-aksen representerer absorbans ved 540 nM av celler adherente til hvert protein. Feilfelt representerer ± SEM. * P 0,05, *** p. 0,001
Fordi mobilnettet invasjon og migrasjon krever celle adhesjon til ekstracellulære matrise, vurderte vi effekten av
ZNF367
knockdown på mobilnettet vedheft til ekstracellulære matrix proteiner. Vi fant økt cellulær adhesjon, med
ZNF367
knockdown, til Laminin jeg (to-tre ganger høyt) og fibrinogen (tre-seks-fold høy) (p 0,05, figur 3H). Disse proteinene er kjent for å fungere for å forbedre mobilnettet vedlegg til basalmembran eller ekstracellulære matrise via integrin reseptorer, som tillater kreft celle adhesjon og migrasjon.
ZNF367
regulerer ITGA3 uttrykk
Vi var interessert i å identifisere genet (e) og sti (er) reguleres av
ZNF367
, gitt effekten av
ZNF367
på cellular invasjon, migrasjon og vedheft, og fordi det er en transkripsjonsfaktor forutsagt for å regulere genekspresjon. Ved hjelp av genom-wide mRNA uttrykk analyse i celler transfektert med
ZNF367 Hotell og negative kontroll sirnas identifiserte vi to kandidatgener (
ITGA3, etter Serpin peptidase hemmer, klade B (ovalbumin), medlem 9 [ ,,,0],
SERPINB9
]) muligens reguleres av
ZNF367
basert på å bruke flere avgrensninger (FDR 0,25, fold-endring 1,5, felles for alle siRNA knockdown, og sterk sammenheng i uttrykk i menneskelig svulst prøver) (Figur S3).
ITGA3
ble valgt som en lovende kandidat for videre studier fordi det spiller en betydelig rolle i cellulær adhesjon og invasjon og ble validert å bli oppregulert opp til 2,5 ganger med
ZNF367
knockdown (p 0,05, figur 4A) [11]. Videre ITGA3 mRNA-ekspresjon ble inverst korrelert med ZNF367 mRNA-ekspresjon i humane tumorprøver binyrebark (r = – 0,37, p = 0,015; figur 4B). ITGA3 protein uttrykk ble også økt med siRNA knockdown av
ZNF367 plakater (Figur 4C). På den annen side, overekspresjon av
ZNF367
redusert
ITGA3
ekspresjon sammenlignet med tom vektor (figur 4D-E). Disse dataene tyder på at
ZNF367
regulerer cellulær adhesjon, invasjon, og migrasjon gjennom sin virkning, i hvert fall delvis, på
ITGA3
uttrykk.
(A)
ZNF367
knockdown oppregulerer
ITGA3
uttrykk i SW13 celler. Feilfelt representerer ± SEM. (B) Korrelasjonen mellom
ITGA3 Hotell og
ZNF367
mRNA uttrykk i binyrebark tumorprøver. X og Y aksene representerer log 2-transformerte verdier. (C) Western blot kvantifisering av ITGA3 protein uttrykk med
ZNF367
knockdown. (D-E) ITGA3 uttrykk med ZNF367 overekspresjon. Feilfelt representerer ± SEM.
MiR-195 direkte rettet mot
ZNF367 Hotell og regulerer cellulær invasjon
For å forstå mekanismen som
ZNF367
uttrykket dysregulerte i kreft, postulerte vi at microRNAs kan være ansvarlig for
ZNF367
overekspresjon. Å identifisere kandidat microRNAs som kan målrette
ZNF367
, spørres vi Target skanning og miRDB databaser for microRNAs spådd å målrette
ZNF367
. Totalt 3 av 14 microRNAs, spådd å målrette
ZNF367, etter ble funnet å være forskjellig uttrykt i adrenocortical karsinom (tabell S1). Men bare MIR-195 var signifikant negativt korrelert med
ZNF367
uttrykk. (R = -0,44, figur 5A)
(A) Korrelasjonen mellom MIR-195 og
ZNF367
uttrykk i en adrenokortikal tumor. Pearsons korrelasjonskoeffisient er angitt med r med sin p-verdi. (B) Ektopisk overekspresjon av pre-MIR-195 resultater i nedregulering av
ZNF367
.
ZNF367
mRNA uttrykk i SW13 celler transfektert med pre-MIR-195 og pre-negative kontrollen på 5 nM i 24 timer (presentert som en fold-endring i forhold til pre-negativ kontroll). Feilfelt representerer ± SEM. Høyre panel viser Western blot av ZNF367 protein fra SW13 celler transfektert med pre-MIR-195 og den negative kontrollen. (C) Pre-MIR-195 overekspresjon øker invasjon i SW13 celler i forhold til negativ kontroll. Høyre panel viser det midlere antall invaderte celler på y-aksen. (D)
ITGA3
mRNA-ekspresjon økes etter transfeksjon av MIR-195 og den negative kontroll i SW13-celler. Feilfelt representerer ± SEM. (E) Den bindingssetet av MIR-195 i
ZNF367
3’UTR, sammen med mutant konstruere i spådd frø regionen. I panelet til høyre, demonstrerer luciferase assay redusert luminescens i SW13 celler co-transfektert med MIR-195 og den negative kontrollen på 5 nM, med tom vektor, vill-type
ZNF367
3’UTR, eller MUT –
ZNF367
3’UTR vektor (mutert i de tre første nukleotidene av frøet sekvens). Luminescensen ble avlest etter 24 timers transfeksjon. Y-aksen representerer forholdet mellom
ZNF367
3’UTR til tom vektor. * P-verdi 0,05 sammenlignet med den negative kontroll. Feilfelt representerer ± SEM.
For å undersøke om MIR-195 regulerer
ZNF367
uttrykk, celler ble transfektert med pre-MIR-195 og pre-negativ kontroll (pre-NC) som viste redusert
ZNF367
mRNA og protein uttrykk (figur 5B). Videre overekspresjon av MIR-195 viste økt
ITGA3
mRNA uttrykk (to ganger) og celle invasjon i forhold til den negative kontrollen (p 0,05, figur 5, C-D). For å bekrefte at
ZNF367
er et direkte mål på MIR-195, utførte vi luciferase analyser for å fastslå om MIR-195 binder seg til 3’UTR av
ZNF367
mRNA. Vi observerte betydelig redusert luciferase aktivitet med MIR-195 overekspresjon i villtype 3’UTR forhold til negativ kontroll og mutert
ZNF367
3’UTR-transfekterte celler (p 0,01; figur 5E). Dermed disse observasjonene tyder på at Mir-195 regulerer negativt uttrykk for
ZNF367
av direkte rettet mot sin 3’UTR, noe som resulterer i redusert cellulær invasjon, den mest dramatiske effekten av
ZNF367 Hotell som vi observerte i våre funksjonelle studier.
Diskusjoner
Så vidt vi vet, er dette den første studien å karakterisere funksjonen til
ZNF367
i kreft. Vi fant at
ZNF367
ble overuttrykt i en rekke endokrine kreftformer (adrenokortikale karsinom, papillær thyroid kreft, ondartet feokromocytom /paragangliom) sammenlignet med benigne og eller normale vevsprøver. Funksjonell
in vitro Hotell og
in vivo
knockdown og overekspresjon studier viste at
ZNF367
regulerer celleproliferasjon, invasjon, migrasjon og vedheft. Vi brukte genom-wide genekspresjonsanalyser å identifisere kandidat gener som er regulert av
ZNF367
, og vi identifisert
ITAG3
som et gen som sannsynlig medierer effekten av
ZNF367
på mobilnettet vedheft, invasjon, og migrasjon. Videre, i silico analyse av menneskelig tumorprøve genom-wide genekspresjon analyse viste en invers sammenheng mellom
ZNF367 Hotell og
ITAG3
uttrykk. Til slutt viser vi at dysregulerte
ZNF367
uttrykk var assosiert med tap av MIR-195 uttrykk i tumorprøver og at dette mikroRNA rettet direkte
ZNF367 Hotell og regulerer cellulær invasjon, og gir en forståelse av mekanisme for dysregulerte
ZNF367
uttrykk. Basert på disse funnene, foreslår vi at det er en MIR-195-
ZNF367-ITAG3
akse som regulerer hormon kreft progresjon.
Dette er den første studien som karakterisere uttrykk og funksjon
ZNF367
i kreft.
ZNF367
knockout på mus har vist noen vesentlige avvik [12].
