Abstract
I denne studien en mikroRNA (miRNA) signaturen ble identifisert i en gemcitabin motstandsdyktig bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom (PDAC) cellelinje modell (BxPC3-GZR) og denne signaturen ble videre undersøkt i avanserte PDAC vevsprøver fra Kreft Genome Atlas (TCGA) database. BxPC3-GZR viste en mesenchymale fenotype, uttrykte høye nivåer av CD44 og viste en svært signifikant deregulering av 17 miRNAs. Basert på relevans i forhold til kreft, en syv-miRNA signatur (MIR-100, MIR-125b, MIR-155, MIR-21, MIR-205, MIR-27b og MIR-455-3p) ble valgt for videre studier. En sterk korrelasjon ble observert for seks av de sju miRNAs i 43 avanserte vevsprøver i forhold til normal bukspyttkjertelen vev. For å vurdere den funksjonelle relevansen vi i første omgang fokusert på miRNA-125b, som er over-uttrykt i både BxPC3-GZR modell og avanserte PDAC vevsprøver. Knockdown av miRNA-125b i BxPC3-GZR og Panc-1 celler forårsaket en delvis reversering av mesenchymale fenotype og forbedret respons på gemcitabin. Videre RNA-seq data fra hver av 40 avanserte PDAC vevsprøver fra TCGA data base indikerer en negativ sammenheng mellom uttrykk for miRNA-125b og fem av seks mulige målgener (
BAP1
,
BBC3
,
NEU1
,
BCL2
,
STARD13
). Så langt, to av disse målgener,
BBC3 Hotell og
NEU1
, som er tumorsuppressorgener men ennå ikke studert i PDAC, synes å være funksjonelle mål for Mir-125b siden knockdown av miR125b forårsaket deres opp regulering. Disse mirnas og deres molekylære mål kan tjene som mål å forbedre følsomhet for kjemoterapi og redusere metastatisk spredning
Citation. Bera A, VenkataSubbaRao K, Manoharan MS, Hill P, Freeman JW (2014) En miRNA underskrift kjemoresistent mesenchymale Phenotype Identifiserer Novel molekylære mål forbundet med avansert kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE ni (9): e106343. doi: 10,1371 /journal.pone.0106343
Redaktør: Shrikant Anant, University of Kansas School of Medicine, USA
mottatt: 28 april 2014; Godkjent: 06.07.2014; Publisert: 03.09.2014
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Data Tilgjengelighet:. Forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Vi brukte data for vår analyse danne offentlig register – Kreft Genome Atlas (TCGA) Portal https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/. Dette gir en plattform for forskere å søke, laste ned og analysere datasett generert av TCGA. Den inneholder klinisk informasjon, genomisk karakterisering data, og høyt nivå sekvens analyse av tumor genomer
Finansiering:. Finansiering fra National Institutes of Health-RO1CA069122 til JWF, Veterans Affairs Merit Award 1I01BX000927 til JWF og William og Eula Owens medisinske forskningsstiftelse til JWF. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
PDAC fortsetter å ha den verste prognosen for noen solid tumor. I 2013 er det anslått at mer enn 45.000 nye tilfeller vil bli diagnostisert i USA med dødelighet til insidensratio nesten lik en [1]. Gemcitabin er den mest brukte kjemoterapi mot kreft i bukspyttkjertelen, men er betydelig metaboliseres i plasma og krever derfor høye doser som fører til toksisitet [2]. Mange PDAC er i utgangspunktet motstandsdyktig mot gemcitabin og responsive som regel utvikle resistens i løpet av behandlingen [3].
Det gjenstår å fastslå hvorvidt kjemoresistent fenotype er indusert som følge av terapi eller om det er en undergruppe av kreftceller i svulsten som er medfødt mer resistente mot terapi. Nyere bevis tyder på at de fleste solide tumorer, inkludert PDAC har en distinkt undergruppe av kreft stamceller (cscs). Resultatene tyder også på at cscs er iboende mer motstandsdyktig mot kjemoterapi og utnytte deres selvfornyelse potensial til å regenerere ny tumorvekst [4]. En tidligere studie forbinder cscs med epitelial til mesenchymal overgang (EMT) [5].
EMT betegner en trans-differensiering program som er nødvendig for vev morfogenese i løpet av forskjellige cellulære utviklings progresjon [6]. EMT prosessen kan være regulert av et variert utvalg av cytokiner og vekstfaktorer, som for eksempel TGF-β, hvis virksomhet er deregulert i løpet av tumorprogresjon [7]. EMT induksjon i kreftceller resulterer i kjøp av invasive og metastatiske egenskaper. Studier viser også at EMT bidrar også til chemoresistance og at disse cellene har CSC markører [8]. Utviklingen av chemoresistance i kreftceller til kreft narkotika inkludert gemcitabin kan reguleres eller bidratt til av mikro-RNA (miRNAs). mirnas er små ikke-kodende RNA molekyler (22 nukleotider), som spiller viktige roller i transkripsjonell regulering av genekspresjon. Utviklingen av chemoresistance gjennom en økning i antall cscs har blitt tilskrevet endringer på nivået av miRNAs i bukspyttkjertelen og andre solide tumorer [9].
Nyere funn tyder på en innbyrdes forholdet mellom mirnas, EMT fenotype, cscs og chemoresistance [10], [11]. Studier tyder også på at mirnas spille en rolle i regulering av EMT prosessen [3], [11]. For eksempel har mirnas vist seg å kjøre EMT ved å regulere cadherin en og ytterligere EMT relaterte molekyler [12]. MiR-200A, MIR-200b og MIR-200c ble nedregulert i gemcitabin-resistente kreft i bukspyttkjertelen celler [13]. Studier tyder også på at re-uttrykk for MIR-200 familie av miRNAs opp regulert cadherin en og nedregulert ZEB1 og vimentin [14]. I tillegg har kreftceller med en EMT fenotype og som var resistente til gemcitabin viste nedregulering av la-7 medlemmer, [5], [15], [16]. In vitro studier av PDAC indikerer en sammenheng mellom EMT, invasivitet og motstand mot kjemoterapi og andre studier støtter forestillingen om at mirnas spille en rolle i disse prosessene ved å regulere genuttrykket [3], [11].
I denne studien vi søkt å identifisere en miRNA signatur for PDAC celler som innehar kjemoresistent og en mesenchymale fenotype (CRMP). Fordi pasienter med avansert PDAC tendens til å vise minimal respons på kjemoterapi vi videre fastslått hvorvidt denne miRNA signatur kan bli reflektert i sine tumorvev. Disse studiene viser at gemcitabin behandling induserer en populasjon av celler med CRMP in vitro, og at en miRNA signatur valgt for denne CRMP deles med svulster prøver fra avansert PDAC. Dessuten, denne studien var i stand til å begynne å etablere et funksjonelt relevansen av en over uttrykt miRNA (MIR-125b) fra denne signaturen og potensielle tumor suppressor målgener. Denne studien gir grunnlag for ytterligere dissekere rollene mirnas i CRMP. Disse mirnas og deres molekylære mål kan gi nye terapeutiske strategier for å eliminere en svulst celle befolkning som er generelt motstandsdyktig mot gemcitabin og eventuelt annen kjemoterapi.
Materialer og metoder
Material
gemcitabin innkjøpt fra LKT Laboratories, Inc. (St. Paul, Minnesota) ble løst opp i steril PBS-oppløsning. Revers transkripsjon reagenser og TaqMan real-time PCR Master-mix ble kjøpt fra Applied Biosystems /Life Technologies (Foster City, California). Alle andre kjemikalier ble hentet fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Cellelinjer
Den menneskelige bukspyttkjertelen adenokarsinom cellelinje BxPC3, CAPAN-2, ASPC-en og Panc-1 ble kjøpt fra ATCC og dyrket dem i DMEM medier (unntatt BxPC3) med 1% penicillin /streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS) i en fuktet inkubator inneholdende 5% CO
2 ved 37 ° C. BxPC3 ble dyrket i RPMI media med 1% penicillin /streptomycin og 10% FBS. Dette PDAC cellelinje BxPC3 ble midlertidig utsatt i fire timer hver syv dager med økende konsentrasjoner (50 ng til 1,5 mikrogram /ml) av gemcitabin over en seks ukers periode. Den resulterende gemcitabin resistent cellelinje betegnet som BxPC3-GZR. For vedlikehold, ble BxPC3-GZR celler utvidet i kulturmedium og frosset i porsjoner. For eksperimentene BxPC3-GZR-celler ble tint og tillates å utvide seg i kultur i to dager, og deretter behandlet med gemcitabin (1,5 ug /ml) i fire timer. Gemcitabin ble fjernet og BxPC3-GZR cellene ble høstet neste dag for eksperimenter inkludert kvalitetskontroll Western blotter for å vise at det oppkjøpte EMT fenotype ble opprettholdt.
Western blot analyser og immunfluorescens farging
Western blot analysen ble utført som beskrevet tidligere [17]. Primære antistoffer ble brukt var som følger: E-cadherin og Neu1 fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA); CD44, beta-aktin og PUMA (
BBC3
) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA), vimentin fra Life Technologies (Carlsbad, California). Pepperrotperoksidase-konjugert sekundære antistoffer ble kjøpt fra Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). For immunfluorescens (IF) farging ble cellene dyrket på runde dekkglass i en 24-brønns plate. Fikse og farging, etterfulgt av å ta bilder ble utført som beskrevet tidligere [18].
Matrigel Cell Invasion Analyser
invasiv oppførsel av celler ble analysert ved Matrigel invasjonen analysene som beskrevet tidligere [17], [18].
uttrykket profilering av miRNAs
Total RNA inkludert små ikke-kodende miRNA ble isolert fra BxPC3 og BxPC3-GZR hjelp mirNeasy kit (Qiagen) i henhold til produsentens prosedyrer. Expression analyse av miRNA i begge styre BxPC3 og BxPC3-GZR celler ble utført ved LC Sciences (Houston, Texas) bruker en proprietær μParaflo microfluidic biochip teknologi. Vesentlige endringer i miRNA uttrykket ble analysert ved t-test som tilbys av LC Sciences (Houston, Texas). Bare de mest signifikante endringer av både over og under uttrykt mirnas ble vurdert for videre analyse (tabell 1).
revers transkripsjon og TaqMan kvantitativ PCR
TaqMan gen-uttrykk analyser ( life Technologies, Carlsbad, CA) ble anvendt for å kvantifisere uttrykket nivåer av både mRNA og modnes miRNA. Total RNA ble ekstrahert ved Mirvana (Life Technologies, Carlsbad, CA) RNA isolering kit og etterfulgt av revers transkribert i en reaksjonsblanding inneholdende tilfeldige heksamerprimere (for mRNA RT-PCR) og MIR-spesifikke stem-loop RT-primere (for miRNA RT- PCR). Kvantitativ PCR ble utført i tre eksemplarer med reaksjoner som inneholder forsterkede cDNA og TAQMAN primere i Universal Master Mix uten AmpErase UNG (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) ved å følge produsentens protokoll. Alle mRNA-data og miRNA Dataene er uttrykt i forhold til 18S og U6 henholdsvis ved TaqMan PCR utført på de samme prøvene, med mindre annet er angitt. Brett uttrykk ble beregnet ut fra tre eksemplarer av C
T-verdiene etter de to
-ΔΔC
T-metoden.
Stall cellelinje generasjon for MIR-125b knockdown
Gemcitabin resistente BxPC3-GZR og Panc-1 celler ble brukt i MIR-125b slå ned studien. System Biovitenskap s (SBI, Mountain View, California) miRZipTM anti-sense mirnas er stabilt uttrykt RNAi hårnåler som hemmer miRNA aktivitet. Den miRZip shRNAs produsere korte, enkle rådet anti-mirnas som kompetitivt binder deres endogen miRNA mål og hemmer dens funksjon. De miRZip kort hårnål RNA klonet inn SBI er pGreenPuroTM shRNA uttrykk vektor, en forbedret tredje generasjon HIV-baserte uttrykk lenti-vektor. Den lentiviral vektor inneholder de genetiske elementer som er ansvarlige for emballasje, transduksjon, og stabil integrering av det virale konstruksjonen i genomisk DNA, indusere ekspresjon av anti-miRNA effektor-sekvens. For produksjon av høy titer av viruspartikler, brukte vi ViraPowerTM Lentiviral Support Kit (Invitrogen, Carlsbad, California) ansette LipofectamineTM 2000 (Invitrogen) for trans de miRzip vektorer i HEK-293T celler. Fordi infiserte celler som stabilt uttrykker GFP og puromycin, så vel som anti-miRNA klonet inn i miRZipTM vektor, benyttet vi puromycin for å selektere for den infiserte celler som inneholder miRzip. Etter screening isolert vi BxPC3-GZRΔmiR-125b eller Panc-1ΔmiR-125b celler. På lignende måte også genererte vi Zip styring i begge cellelinjer med miRZipTM vektor. For å bestemme narkotika følsomhet ble cellene behandlet med angitte konsentrasjoner av gemcitabin i 96 timer og MTT analysene ble utført som tidligere beskrevet [19].
Mirna og transkriptom profilering av tumor data fra Kreft Genome Atlas (TCGA)
miRNA:
nivå 3.1.1.0 miRNA sekvensdata fra TCGA data portalen ble lastet ned for 43 tumorprøver med en normalt vev. En datamatrise ble fremstilt ved å kombinere rå lese tellingene av 1046 mirnas fra 44 [43 tumor og en normal] prøver. Basert på antagelsen om at miRNA sekvensdata følge en negativ binomial fordeling [20], [21] lese teller var størrelse-faktor normalisert ved hjelp DESeq versjon 1.10.1 [22] pakke i R-versjon 2.15.3. Normalisert lese count data ble brukt til å beregne log2 ganger endring mellom tumor og normale prøver
transkriptomet.
Nivå 3.1.1.0 RNA sekvens data fra TCGA data Portalen ble lastet ned i 40 tumorprøver med en normalt vev som kontroll. Vi brukte RSEM programvare for å bestemme mengden av transkripsjoner fra RNA-Seq data. RSEM øvre kvartil normalisert lese teller data fra 41 (40 svulster og 1 normal) vevsprøver ble brukt til å beregne log2 ganger endring mellom tumor og normale prøver.
Statistisk analyse
Studentenes uparet t- test ble brukt for å sammenligne enkelte konsern midler. En p-verdi på 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle verdier i tallene og teksten ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD
Resultater
Generering av en kreft i bukspyttkjertelen CRMP cellelinje modell
PDAC cellelinje BxPC3 ble midlertidig utsatt til økende konsentrasjoner av gemcitabin over en seks ukers periode. Den resulterende gemcitabin resistente BxPC3-GZR celler ble sammenlignet med foreldre BxPC3 celler for forskjeller i morfologi, som reaksjon på gemcitabin, ekspresjon av mesenchymale, epiteliale markører og CD44. Sammenligninger for morfologi viser at foreldre BxPC3 cellene vokste i tettpakkede områder og viste en flat og avrundet utseende, karakteristisk for en epitelial som morfologi; mens, BxPC3-GZR celler vokste som løst forbundet celler med en spindel-lignende morfologi som er karakteristisk for en mesenchymale fenotype (Fig. 1A). Følsomheten til behandling med gemcitabin ble sammenlignet mellom BxPC3-GZR og foreldre BxPC3 celler. BxPC3-GZR celler viste mer enn en dobling nedgang i respons til gemcitabin i forhold til sine foreldre celler BxPC3 (Fig. 1C). For å avgjøre om BxPC3-GZR celler er også krysse motstandsdyktig mot en annen kjemoterapeutisk forbindelse, ble cellene behandlet med paclitaxel og MTT analysene ble utført. Mens BxPC3-GZR celler viste mer enn en dobbelt reduksjon i følsomheten for gemcitabin, disse cellene viste bare en beskjeden reduksjon i følsomheten for paclitaxel (fig. S1). Disse observasjonene tyder på at ulike signalveier kan være ansvarlig for resistens mot ulike medikamenter. En nylig studie med side populasjon av PDAC celler med egenskaper av kreft stamceller og som ble valgt for resistens til gemcitabin ikke var resistente mot 5-FU [23]. Western blot-analyse av cellene innsamlet ved hver uke i løpet av seks uker for å øke gemcitabin behandling viste at nivået av epiteliale markør E-cadherin gradvis redusert med samtidig økning i nivåene av mesenchymal markør vimentin og stamcelle markør CD44 (Fig. 1B) .
A. Morfologiske forskjeller mellom foreldre BxPC3 og chemoresistance mesenchymale BxPC3-GZR celler. B. Western blot viser at BxPC3-GZR celler har en EMT fenotype, som er demonstrert ved økt uttrykk av vimentin og en reduksjon av E-cadherin og uttrykke stamcelle markør CD44. C. MTT-analyse som sammenligner veksten av foreldre BxPC3 og BxPC3-GZR ved 96 timer etter behandling med forskjellige konsentrasjoner av gemcitabin. D. Western blot sammenligne uttrykket av CD44, E-cadherin, Zeb-en og vimentin etter fire passasjer av BxPC3 og BxPC3-GZR. E og F. immunfluorescens konfokal mikroskopi bilder viser differensial uttrykk for CD44 og vimentin i BxPC3 og BxPC3-GZR celler.
Enda viktigere, har vi også overvåkes og sammenlignet uttrykket nivåer av samme proteinene av BxPC3 og BxPC3-GZR celler som der utvidet og gått for etterfølgende generasjoner i kultur. Stabiliteten av BxPC3-GZR fenotype ble bekreftet i korttidskulturer med BxPC3-GZR celler som viser et lavere nivå av E-cadherin, oppregulering av ekspresjonen vimentin og forhøyet ekspresjon av stamcellemarkører CD44 (Fig. 1D). Etter avtale med Western blot data, immunfluorescens analyse indikerte en mye sterkere farging av både CD44 og vimentin i BxPC3-GZR celler i forhold til foreldre BxPC3 motstykke (Fig. 1E, F).
Identifisering av en miRNA signatur assosiert med CRMP i PDAC
studier indikerer at ulike mirnas som MIR-100, MIR-21, la-7, speil 34a og Mir – 200c spille avgjørende rolle i å regulere tumorigenesis og chemoresistance i forskjellige krefttyper, inkludert bukspyttkjertelen kreft [24] – [26]. Undersøkelser viste også en rolle for mirnas i utvikling av medikamentresistens i en rekke forskjellige maligniteter [11]. Uttrykket nivået av miRNA ble sammenlignet i BxPC3 og BxPC3-GZR celler ved μParaflo microfluidic chip miRNA profilering. Etter beregning og eliminere ikke-signifikante mirnas (i form av uttrykk), ble en stor betydning miRNA profil etablert som aner BxPC3-GZR celler fra foreldre BxPC3 celler (fig. 2,
Tabell 1
). Denne profilen viste de fleste betydelige ni mirnas som ble opp regulert i BxPC3-GZR celler sammenlignet med BxPC3 (MIR-125b, MIR-155, MIR-100, MIR-4324, MIR-21, MIR-15b, MIR-25, speil 424 *, MIR-99b) og åtte som ble nedregulert (MIR-1246, MIR-205, MIR-4443, MIR-30d, MIR-27b, MIR-4485, MIR-378 *, MIR-455-3p).
A. Heat kartdata analyse av miRNA microarray-analyser som sammenligner BxPC3 foreldre celler og medikamentresistente BxPC3-GZR celler. Bare mirnas ble valgt som hadde betydelig over eller under uttrykt i forhold til foreldre celler (høy fold endringer basert på log2 verdier og svært lave p-verdier) ble tatt for videre validering. De statistiske verdiene er representert i
Tabell 1
. B. Validering av miRNA microarray data ble gjort for åtte forskjellig uttrykt mirnas bruker TaqMan qPCR analyse. I hver cellelinje, ble ekspresjonsnivået av angitte miRNA forhold mellom paren BxPC3 celler og BxPC3-GZR celler. RNU43 eller U6 ble anvendt som en intern kontroll miRNA. C. TCGA av data analyse som viser at 6 av de 7 mirnas validerte for å bli deregulert i BxPC3-GZR celler viste også differensial-ekspresjon i tumorprøver fra pasienter med fremskreden PDAC. Vevsprøver fra 43 pasienter med avansert PDAC ble analysert for miRNA uttrykket i forhold til normal bukspyttkjertelen vev.
Basert på relevans i forhold til kreft og chemoresistance, syv av disse miRNAs ble valgt for videre studier. Real Time-PCR bruker TaqMan analyser ble gjort for å validere over- eller under uttrykt mirnas identifisert av miRNA arrays (Fig. 2B). Endelig har vi identifisert fire av de over-uttrykt mirnas (MIR-125b, MIR-155, MIR-100, MIR-21) og tre under uttrykt mirnas (MIR-27b, mir-205, og MIR-455-3p) av miRNA mikromatriser ble validert ved real-Time PCR (fig. 2B).
den miRNA signatur fra CRMP cellelinje modellen er også påvist i kliniske prøver fra pasienter med avansert PDAC
for å etablere den potensielle relevansen av validerte CRMP miRNA signatur med mirnas funnet i avansert PDAC, hele transkriptom analyser (miRNA og mRNA-seq, uttrykk nivåer) ble utført med PDAC pasientprøve data fra TCGA datasett. I TCGA database er det totalt 43 PDAC pasientprøver inneholdende ekspresjonsnivå av mirnas med en normal pankreas vev. Førti av disse pasientenes vevsprøver hadde data for både mRNA og miRNA uttrykket nivåer. En sammenligning av de over og under uttrykt mirnas i TCGA med de i vår miRNA utvalg er presentert i
Tabell 2
. Som vist i
tabell 2
, av de sytten mirnas omfatter de mirnas abnormt deregulerte i BxPC3-GZR (9 løpet uttrykt og 8 under uttrykt) miRNA data for 14 av disse var tilgjengelig i TCGA analyser og for alle sju av validerte miRNAs. En ytterligere sammenligning ble gjort på seks-miRNA signatur validert fra tabelldata, og som var det matchende data for avanserte PDAC prøver. En analyse av disse data er vist i figur 2C. Interessant var det en signifikant sammenheng med vanlige uttrykk nivåer av miRNAs i avanserte PDAC vevsprøver med den validerte CRMP miRNA signatur for fem av de seks mirnas (Fig. 2C,
Tabell 2
). Det er viktig å merke seg at MIR-125b data for de tumor prøver er gitt som både MIR-125b-1 og MIR-125b-2-isoformer, mens i cellelinjer vi bare bestemmes MIR-125b-en isoform (betegnet som speil 125b). Interessant, ble forløperne til Mir-125b-1 og MIR-125b-2 isoformer kjent å stamme uavhengig av forskjellige kromosom loci selv om deres modne sekvenser og målene er samme [27]. De mest bemerkelsesverdige mirnas løpet uttrykt i både BxPC3-GZR og kliniske prøver var MIR-100, MIR-21, MIR-125b-1, MIR-125b-2, mens MIR-205, MIR-27b og miR455 ble under uttrykt.
MIR-125b spiller en rolle i regulering av CRMP i PDAC
Innledende studier ble gjennomført for å avgjøre om de mirnas identifisert i BxPC3-GZR celler og som var felles for kliniske prøver spilt en rolle i CRMP. MIR-125b som var vanligvis i løpet uttrykt i både avanserte PDAC kliniske prøver og i BxPC3-GZR celler (Fig. 2) ble valgt for disse analysene. For videre studier, ble tre PDAC cellelinjer (ASPC-1, CAPAN-2, Panc-1) i tillegg til BxPC3 screenet for uttrykk nivåer av EMT markører sammen med MIR-125b og MIR-30d (Fig. 3 A, B) . MiR-30d ble benyttet for sammenligning av differensiell ekspresjon av miRNA ettersom det viste lik ekspresjonsnivået i begge paren (BxPC3) og resistente celler ved qPCR-analyse. I disse cellelinjene epiteliale markør E-cadherin er omvendt relatert til ekspresjon av MIR-125b; mens den mesenchymale markør vimentin og stamcelle markør CD44 ble proporsjonalt relatert til ekspresjon av MIR-125b (fig. 3A, B). Disse data foreslår videre at EMT fenotype kan reguleres delvis av den konstituerende uttrykk for MIR-125b i CAPAN-2 og BxPC3 cellene vise en epitelial som fenotype og uttrykker lave nivåer av MIR-125b; imidlertid ASPC-1 og Panc-1 celler er mesenchymale like og viser høyere nivåer av MIR-125b (fig. 3 A, B). I tillegg har vi også overvåket uttrykk for MIR-125b i BxPC3 celler ved behandling med gemcitabin. Data viser at 72 timers behandling med gemcitabin indusert ekspresjon av MIR-125b i BxPC3-celler på en doseavhengig måte (fig. 3C). Derfor er disse funnene tyder på at både chemoresistance og mesenchymale fenotyper er regulert av differensial uttrykk for MIR-125b.
A. Western blot analyser viser uttrykket nivåer av EMT markører i PDAC celler der MIR-125b uttrykk ble bestemt. B. TaqMan qPCR analyse som viser den relative uttrykk for miRNAs (MIR-125b og MIR-30d) i ulike PDAC celler. MiR-30d blir benyttet som en kontroll. C. Induksjon av MIR-125b uttrykk i BxPC3 ved behandling av gemcitabin. Kvantitativ PCR (TaqMan®) ble utført etter 72 timers inkubering med stoffet, for å overvåke nivået av ekspresjon MIR-125b i BxPC3 celler. Data viser at uttrykket av MIR-125b økes ved behandling av gemcitabin på en doseavhengig måte.
For å finne ut om MIR-125b uttrykk er direkte relatert til CRMP, vi slått ned uttrykket av MIR-125b ved hjelp Zip teknologi og stabile cellelinjer generert og analysert for ekspresjon av MIR-125b i både BxPC-GZR-Zip-Ctrl og i BxPC3-GZR-ΔmiR-125b celler (fig. 4A). Morfologi av MIR-125b knockdown-celler ble også vurdert og knockdown av MIR-125b restaurert epitel som morfologi (fig. 4A). TaqMan qPCR analyse indikerte en omtrentlig 80% knockdown av MIR-125b i BxPC3-GZR celler (Fig. 4B). Knockdown av anti-miR125b reversert EMT markører som vist ved den økte ekspresjon av epiteliale markør E-cadherin og den reduserte ekspresjon av mesenchymale markør vimentin og også redusert CD44 ekspresjon (Fig. 4C). Knockdown av MIR-125b redusert celle migrasjon (fig. 4D, E) og delvis reversert gemcitabin motstanden BxPC3-GZR celler (Fig. 4F).
A. Etablere Lenti virale basert stabile celler som uttrykker anti-MIR-125b i BxPC3-GZR (Zip-kontroll og MIR-125b knock-down). B. TaqMan qPCR analyser viser knockdown av MIR-125b i BxPC3-GZR-Zip ctrl celler i forhold til BxPC3-GZRΔmiR-125b celler. C. Expression of anti-MIR-125b (Zip-teknologi, SBI) reduserer uttrykk for EMT og stemness markør overvåkes av vestlige bolt analyser. Paneler D og E viser demping av cellevandring ved å banke ned MIR-125b uttrykk. Bilder ble tatt etter krystallfiolett farging av migrerte celler og dataene ble plottet som en graf (bar = 50 um). F. knockdown av MIR-125b øker respons på gemcitabin. BxPC3-GZR-Zip-Ctrl og BxPC3-GZRΔmiR-125b celler ble behandlet med gemcitabin ved forskjellige konsentrasjoner og MTT ble utført etter 96 timers behandling. G. knockdown av MIR-125b i Panc-1 celler. Lenti-viral basert stabile celler ble generert for å hemme MIR-125b uttrykk (Zip-teknologi,). TaqMan qPCR analyser ble utført for å måle uttrykket av MIR-125b i Zip-kontroll Panc-1 celler og slå ned celler (Panc-1 ΔmiR-125b). H. hemme MIR-125b reduserer CD44 og vimentin uttrykk mens opp regulerer uttrykket av E-cadherin. I. knockdown av MIR-125b øker responsen fra Panc-1 til gemcitabin. MTT-analyser ble gjort etter 96 timer med gemcitabin behandling. Statistisk signifikans verdier * p 0,05 og ** p 0,01 ble beregnet ved hjelp av student-t-tester
For å bekrefte at denne effekten av MIR-125b knockdown var ikke unikt for BxPC3-GZR celler. , MIR-125b ble også slått ned i Panc-1 celler. I likhet med det man ser i miRNA-125b knockdowns for BxPC3-GZR celler, Western blot og MTT assay data indikerte at knockdown av MIR-125b uttrykk i Panc-en celle delvis reversert mesenchymale fenotype (Fig. 4G, H) og forbedret respons på gemcitabin (fig. 4I).
gene mål av MIR-125b
Siden mirnas handling ved enten undertrykkende eller spalte sine mål mRNA, gjennomførte vi genuttrykk analyse av flere kjente nedstrøms mål fra Mir -125b. Flere studier indikerte at mRNA-mål for Mir-125b er
BBC3 plakater (PUMA),
ITCH
,
BAK1
,
BCL2
,
NEU1
,
PPP1CA
,
PPP2CA product: [28] [29];
STARD13 plakater (DLC2) [30];
AP1M1
,
STK11IP
,
PSMD8
,
TBC1D1
,
TDG
,
MKNK2
,
DGAT1
, BAP1,
GAB2
,
SGPL1 product: [28]. Vi analyserte tumor kliniske data for disse ovenfor mRNA-ekspresjonsnivåer (Fig. 5). RNA-seq fra TCGA viste at uttrykk for noen av disse genene (
BAP1
,
BBC3
eller PUMA,
BCL2
,
NEU1
,
STARD13
) er negativt korrelert med uttrykk for MIR-125b. Vi analyserte både det generelle uttrykket utviklingen av den målrettede genene i PDAC prøver fra den TCGA databasen (fig. 5A), så vel som ekspresjonsnivået av målrettet gen i forhold til ekspresjon av miRNA-125b innenfor de samme tumorprøver (Fig . 5B). Deretter har vi overvåket uttrykket nivået av p53 oppregulert modulator av apoptose (PUMA). Puma også kjent som Bcl-2-bindende komponent 3 (BBC3) er en pro-apoptotisk protein og er medlem av Bcl-2-protein familien [31], [32]. Puma er involvert i både p53-avhengig og apoptose-uavhengig reaksjonsvei indusert av en rekke signaler [33]. Nyere studier indikerer også at
NEU1
produkt Neu1 salidase er viktig i reguleringen av integrin mediert signalisering β4-, som fører til undertrykkelse av kreft metastase [34]. Men en egen studie indikerer at Neu1 salidase forbedrer EGFR-signalering, og dermed kan være svulst fremme [35]. Dagens funn sammen med web-baserte miRNA mål scan data tyder på at Mir-125b direkte rettet mot de 3’UTRs av PUMA (BBC3) og Neu1 (Fig. 6. F, G). Til støtte for dette, mRNA uttrykk for
BBC3 plakater (PUMA) og
NEU1
ble omvendt korrelert med uttrykk for MIR-125b (fig. 6A) i BxPC3-GZR celler.
A. Target mRNA uttrykk profil analyser for MIR-125b. Bestemt uttrykket kjente MIR-125b mål (
BBC3 plakater (PUMA),
BCL2
,
STARD13
,
BAK1
,
BAP1
,
ITCH Hotell og
NEU1
). B. En direkte co-forhold av mål-mRNA og MIR-125b ekspresjonsnivået ble målt i den samme tumor fra pankreatisk adenokarsinom [PDAC] pasientens prøve. Først panel forklarer de ulike kvadrantene som inkluderer oppregulering (+ Ve tegn) eller nedregulering (- Ve tegn) av mRNA og miRNA uttrykket nivåer. Andre paneler representerer uttrykk nivå av forskjellige mRNA (
BBC3, Neu1 og BAK1
) sammenlignet med uttrykk for MIR-125b i samme svulst.
A. PUMA (
BBC3
) og Neu1 er mest fremtredende mRNA mål av MIR-125b. De TaqMan qPCR analysene ble utført for å validere kliniske data. QPCR resultatene indikerer uttrykket nivået av forskjellige mRNA (
BBC3, Neu1 og BAK1
) som er direkte mål av MIR-125b forhold mellom BxPC3 foreldre celler og resistente GZR celler. B. Sammenligning av mRNA uttrykk nivå av
BBC3, Neu1 og BAK1
i BxPC3-GZR celler og stabile BxPC3-GZR celler som uttrykker anti-MIR-125b. C. Western utsletter analyse for å overvåke uttrykk nivå PUMA og Neu1 i BxPC3, BxPC3-GZR, og MIR-125b knockdown celler. D og E. hemme MIR-125b gjenoppretter BBC3 og Neu-1 uttrykk i Panc-1 celler, qPCR (D) og Western blot (E). F, G. Arter bevaring og tilpasning av frø sekvens i 3’UTR av
BBC3 Hotell og
NEU1
mRNA med MIR-125b sekvens ble overvåket ved hjelp Targetscan gratis web-basert programvare.
Deretter sammenlignet vi uttrykk for tre ulike potensielle Mir-125b målgener PUMA (
BBC3
) (mest under uttrykt gen i pasientprøver),
NEU1
og
BAK1 plakater (oppregulert genet) mRNA mellom BxPC3 foreldre og BxPC3-GZR celler (fig. 6B).
