Abstract
Nylig fant vi at
ATP5J
ble over-uttrykt i vevsprøver fra pasienter med tykktarmskreft. Men
ATP5J
hos disse pasientene er fortsatt uklart hvilken klinisk betydning og funksjon av over-uttrykk for. Vi har undersøkt disse spørsmålene i denne studien. Våre resultater indikerer at uttrykk for
ATP5J
var signifikant høyere i kolorektal kreft vev enn i tilstøtende vev, og det var også betydelig høyere i metastatiske lymfeknuter enn i primær kreft vev (
P
0,05). En korrelasjon mellom
ATP5J
uttrykk og tumor differensiering ble oppdaget, men ingen sammenheng med kjønn, alder, T scenen, lymfeknutemetastaser, eller overlevelse status ble observert. Nedregulering av
ATP5J
uttrykk svekket evne til cellemigrering og økte følsomheten til 5-fluorouracil (5-FU) i celler av DLD1 cellelinje. Omvendt, oppregulering av
ATP5J
uttrykk forbedret cellemigrering og redusert 5-Fu følsomhet, noe som antyder at funksjonen av ATP5J i kolorektal kreft kan omfatte cellemigrering og 5-Fu følsomhet.
Citation : Zhu H, Chen L, Zhou W, Huang Z, Hu J, Dai S, et al. (2013) overuttrykk av
ATP5J
Gene korrelerer med cellemigrasjon og 5-Fluorouracil følsomhet i tykktarmskreft. PLoS ONE 8 (10): e76846. doi: 10,1371 /journal.pone.0076846
Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kina
mottatt: 18 februar 2013, Godkjent: 31 august 2013; Publisert: 04.10.2013
Copyright: © 2013 Zhu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (30700970 og 81272681), de grunnleggende forskning midler til sentrale universiteter og Program for Innovative Research team i Zhejiang-provinsen (2010R50046). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den nest vanligste kreftformen i USA og andre utviklede land [1,2], og forekomsten øker år for år i utviklingsland [3,4]. Som vi vet, kreftutvikling og utvikling av tykktarmskreft består av en rekke kompliserte prosesser de involverer flere gener og trinn. Selv om en økende mengde gener har blitt rapportert i litteraturen [5-7], søken etter nye gener som kan være relatert til kreftutvikling, utvikling, diagnose eller behandling av tykktarmskreft fortsetter. Derfor søkte vi Sage database og bekreftet gense kandidater av interesse ved revers transkripsjon polymerase chain reaction (RT-PCR). Til syvende og sist har vi identifisert et gen,
ATP5J
, som var over-uttrykt i tykk- og endetarmskreft.
En del av F
0, er ATP5J et protein som ligger i mitokondriene som er et lipid-løselig del av ATP syntetase [8]. Forløperen av ATP5J består av 108 aminosyrer, og det vil bli klippet av 32 aminosyrer [9]. Produktet inneholdende de gjenværende 76 aminosyrene er beholdt i mitokondriene for energioverføringen [9]. Tradisjonelt ATP5J har vært antatt å gjenvinne utvekslingen mellom uorganisk fosfor og ATP så vel som aktiviteten av ATPase som hemmes av oligomycin [10]. Nyere forskning har imidlertid vist at ATP5J er i stor utstrekning fordelt på overflaten av vaskulære endotelceller [11,12]. Derfor kan det også bli utskilt i blodet og sirkulert for å kombinere med den β subenheten av ATP syntetase lokalisert på overflaten av vaskulære endotelceller. Deretter kan aktiviteten av fosfolipase A2 inhiberes ved aktivering av den tilhørende signalveien, som vil bli fulgt av den hemming av syntesen av prostaglandin som fremmer vasokonstriksjon [12]. Recenetly har noen litteratur vist at
ATP5J
genet er overuttrykt i en rekke kreftformer, inkludert nyrecellekreft og leverkreft [13,14]. Men funksjonen av over-uttrykt
ATP5J
i kreft fortsatt ikke er dokumentert.
Ifølge innledningen av det humane proteinet ATLAS (https://www.proteinatlas.org/ENSG00000154723 /normal), kan ATP5J protein uttrykkes i mange normale vev eller organer, inkludert tykktarm og endetarm. Våre foreløpige data også bekreftet dette fenomenet. Enda viktigere, våre data viste at
ATP5J
ble over-uttrykt i tykktarmskreft sammenlignet med normalt vev. Målet med denne studien var å undersøke den kliniske betydningen og funksjonen til over-uttrykk for
ATP5J
i kolorektal kreftceller. Våre resultater viste at
ATP5J
ble over-uttrykt i vevsprøver fra pasienter med tykktarmskreft og at det var en sammenheng mellom
ATP5J
uttrykk og tumor differensiering. Videre over-uttrykk for
ATP5J
forbedret cellemigrasjon og indusert motstand mot 5-fluorouracil (5-FU) i kolorektal kreft celler.
Materiale og metode
Samling av ferske vevsprøver
Denne studien ble godkjent av Sir Run Run Shaw sykehus og Zhejiang University etisk komité (NO.20100823). Ferske kreft vevsprøver ble hentet direkte fra operasjons eksemplarer av 72 sammenhengende pasienter som hadde gjennomgått kirurgiske reseksjoner for primærinnsidere sporadiske kolorektal adenokarsinomer ved Institutt for kolorektal inngrep, Sir Run Run Shaw Hospital, Hangzhou, Zhejiang, Kina, mellom september 2010 og mars 2011 . Skriftlig informert samtykke for vev samlingen ble innhentet fra alle pasienter før sine kirurgiske prosedyrer. Ingen av disse pasientene hadde hatt noen preoperativ kjemoterapi eller strålebehandling. Den tilstøtende vev ble samlet inn fra mer enn 5 cm unna kreftvev.
Pasienter og klinisk datainnsamling
Parafin deler av prøver fra totalt 79 pasienter med intakt kliniske data som ble diagnostisert med kolorektal kreft mellom juli 2006 og juni 2007 kl vårt sykehus ble samlet for immunhistokjemisk farging. Gjennomsnittlig oppfølging av disse pasientene var 52,6 måneder, og den generelle overlevelsesraten var 73,4% ved siste oppfølging. Blant disse 79 tilfellene ble kreftvev og relative par normalt tilstøtende vev studert i 51 tilfeller, og vevsprøver fra metastatiske lymfeknuter ble studert i 26 saker. Alle deler var forberedt for immunhistokjemi på lysbilder som ble brukt for å sammenlikne
ATP5J
uttrykk mellom ulike vev.
Celler og cellekultur
Menneskelig tykktarmskreft cellelinjer DLD1, RKO, SW620, SW480, og Colo320 ble kjøpt fra Institute of Cell Research i Shanghai, Kina. Den normale menneskelige fibroblast cellelinje (NHFB) ble hentet fra Global Bioresource Senter American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Cellene ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplementert med 10% (v /v) varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS), 1% glutamin og 1 x antibiotika-antimykotisk blanding (Invitrogen, Beijing Kontor, Beijing , Kina). Alle celler ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet inkubator inneholdende 5% CO
2, og vil bli brukt for RT-PCR-analyse. I tillegg vil DLD1 samt SW620 celler som senere skal brukes for en rekke andre forsøk.
Revers transkripsjon PCR
Den friske vevsprøver på 100 ug ble homogenisert ved anvendelse av en kvern med flytende nitrogen etterfulgt av lysis med TRIZOL reagens (Invitrogen Beijing Office, Beijing, Kina). Dyrkede celler som er nevnt ovenfor, som ble direkte lysert ved hjelp av TRIZOL-reagens etter behandling. RNA ble ekstrahert følge produsentens instruksjoner. En mikrogram RNA fra hver prøve ble revers-transkribert til cDNA ved hjelp av tilfeldige heksamer som revers transkripsjon primere (Applied Biosystems Shanghai Office, Shanghai, Kina). Så typisk polymerase chain reaction (PCR) for
ATP5J
genet ble utført. Den menneskelige
GAPDH
-genet ble anvendt som en intern kontroll for å normalisere mRNA beløp. Sekvensene til primerne var som følger: 5′-TCAGCCGTCTCAGTCCATTT-3 «og 5′-CCAAACATTTGCTTGAGCTT-3» for
ATP5J
; 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 «og 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3» for
GAPDH
.
Immunhistokjemisk farging
Farging ble utført ved hjelp av en MaxVision kit (Maixin Biol, Fuzhou , Kina). Kort fortalt ble 4-mikrometer tykke seksjoner kuttet fra formalinfiksert, parafininnstøpte vevsblokker, montert på polylysin belagt lysbilder, avvokset i xylen, og rehydrert gjennom en gradert serie av etanol løsninger. Etter deparaffinization, ble objektglass ble behandlet med 3% hydrogenperoksyd i metanol-løsning i 10 minutter for å stanse endogen peroksidase-aktivitet, ble deretter antigen-henting behandling utført ved 121 ° C (autoklav) i 5 minutter i 10 mM natriumsitratbuffer (pH 7,4) . Uspesifikke bindinger ble blokkert ved behandling av lysbilder med 10% normalt geiteserum i 10 minutter. Deretter ble platene inkubert med ATP5J antistoff (Cell Applications, San Diego, CA, 1: 8000 fortynning) over natten ved 4 ° C. Deretter ble objektglassene inkubert med en dråpe av MaxVision reagens i 30 minutter ved romtemperatur. Fargeutvikling ble utført under anvendelse av 0,05% diaminobenzidin og 0,03% hydrogenperoksyd i 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, i 5 minutter. Til slutt ble lysbilder kontra med 1% Meyers hematoxylin. Som en negativ kontroll ble vevssnitt behandlet med normalt serum i stedet for ATP5J antistoff.
Evaluering av flekker
Alle seksjonene ble bedømt blindt under et lysmikroskop. Celler med klar struktur og brun-gule granulat som var høyere enn bakgrunnen ble betraktet som positive; ellers ble celler betraktes som negative. For hvert bilde, ble 5-10 høy forstørrelse felt (× 400) undersøkt. Da objektglassene ble bedømt i henhold til prosentandelen av positive celler: 0 (mindre enn 5%), 1 (5-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%), eller 4 (76- 100%). Samtidig lysbilder ble scoret i henhold til fargeintensitet: 1 (yellowy), 2 (brun-gul), eller 3 (brun) [15]. Sluttresultatet ble beregnet som summen av disse to score.
Western blot-analyse
Cellene ble vasket med kald PBS og underkastet lysis i Laemmlis lyseringsbuffer. Like mengder av lysatet ble separert ved anvendelse av 10% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og deretter overført til Hybond forsterket kjemiluminescens (ECL) membraner (Amersham Bioscience, England). Membranene ble deretter blokkert med PBS-buffer inneholdende 5% lettmelk og 0,05% Tween-20 i 1 time eller over natt ved 4 ° C, vasket tre ganger med PBS inneholdende 0,05% Tween-20 (PBST), og inkubert med ATP5J antistoffet i minst en time ved romtemperatur. Etter å ha blitt vasket med PBST igjen, ble membranene inkubert med konjugert sekundære antistoffer og utviklet med en chemiluminescence deteksjon kit (ECL kit, Amersham Bioscience, England). Kanin anti-human ATP5J antistoff ble kjøpt fra Cell Applications. β-actin ble brukt som en lasting kontroll.
Konstruksjon av plasmid som uttrykker
ATP5J
En pOTB7 plasmid som inneholder
ATP5J
sekvensen ble kjøpt fra Invitrogen (Clone ID 3357779).
ATP5J
sekvensen ble klonet inn i en p △ E1sp1A plasmid hjelp EcoRI /XhoI enzymer. Deretter ble det videre fordøyd og klonet inn i en pcDNA3.1 (+) plasmid hjelp BamHI /HindⅢ enzymer for å få en ny plasmid som heter pcDNA3.1 (+) /ATP5J. Etter uttrykk for
ATP5J
ble bekreftet, ble denne nye plasmid brukt for den neste delen av studien.
Cell transfeksjon og stabil koloni utvalg
For transfeksjon ble cellene sådd ut i 24-brønns plater ved en densitet på 1×10
5 celler per brønn og tillatt å vokse over natten til 90-95% konfluens. Den neste dag ble cellene transfektert med en blanding av 0,8 ug ATP5J shRNA plasmid (Origene, USA), pcDNA3.1 (+) /ATP5J plasmid, eller negativ kontroll-plasmid (Origene, USA) pluss 2 ul Lipofektamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) i 100 mL serumfritt medium i henhold til produsentens instruksjoner. For å fremstille stabilt transfekterte celler etter transfeksjon med det tilsvarende plasmid, ble 10 ug /ml puromycin (Roche, Mannheim, Tyskland) tilsatt ved 48 timer til mediet (DMEM + 15% FBS). Cellene ble etterlatt i selektivt medium i 2 uker; etter dette tidspunktet de ble trypsinert og recultured i selektivt medium for forplantning.
Celleviabilitet analysen
Celleviabilitet ble bestemt ved hjelp av en MTT analysen (3- (4,5 dimetyltiazol-2-yl) -2 , 5 difenyltetrazoliumbromid; Sangon, Shanghai, Kina). Kort sagt ble celler (5×10
3 pr brønn) sås i 96-brønns plater for observasjon på en rekke tidspunkter. Deretter ble 100 ul av MTT-oppløsning (10 mg /ml) ble tilsatt til hver brønn, og inkuberingen ble fortsatt i 4 timer før mediet ble fjernet. Deretter ble 100 ul dimetylsulfoksid (DMSO) påført til hver brønn for ytterligere 10 minutter. Til slutt, er verdien av OD
570 nm ble bestemt; denne verdien representerer celle levedyktighet. Hvert eksperiment ble utført i fire paralleller, og ble gjentatt minst to ganger.
Cell klonogene assay
1000 Cellene ble dyrket i 10 cm skåler med normal kulturmedium i en inkubator inneholdende 5% CO
2 ved 37 ° C i 14 dager. Individuelle kolonier (mer enn 50 celler pr koloni) ble fiksert og farget med en oppløsning inneholdende 0,25% krystallfiolett flekken og 20% etanol i 20 minutter. Koloniene ble telt ved hjelp av Optimas programvare (Media Cybernetics LP, Silver Spring, MD, USA). Hvert forsøk ble utført i triplikat, og ble gjentatt to ganger.
Strømningscytometri-analyse
Cellene ble trypsinisert og vasket én gang med kald PBS. Deretter ble cellene fiksert med kald 70% etanol over natten ved 4 ° C. Tretti minutter før de ble analysert, ble propidiumjodid (PI) farging utført som beskrevet tidligere [16-18]. Flowcytometri ble utført i Core Lab på Sir Run Run Shaw Hospital.
sårhelende analysen
Cell migrasjon ble undersøkt ved hjelp av en ripe sårhelende analysen. -Celler (5×10
5 per brønn) ble sådd ut i seks-brønns plater og tillatt å holde seg i 24 timer. Cellene ble behandlet med 10 ug /ml mitomycin C (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i 3 timer, vasket med PBS, deretter bare såret med en pipettespiss. Friskt komplett medium ble tilsatt, og cellene ble tillatt å lukke såret i 48 timer eller mindre. Fotografier av den samme stilling såret ble tatt ved tilsvarende tidspunkter. Eksperimentet ble utført i tre eksemplarer.
Cellemigrering assay
Cellene ble trypsinisert og resuspendert i DMEM inneholdende 1% FBS ved en tetthet av 1×10
6 celler /ml. I alt ble 100 ul av cellesuspensjonen sådd ut på en 24-brønners Transwell (Costar, Corning, NY). DMEM (600 ul) inneholdt 10% FBS ble plassert i det nedre kammer. Etter inkubering i 24 timer ble celler som er igjen i det øvre kammer fjernes forsiktig med en bomullsdott, og membranen ble kuttet av ved hjelp av en operasjonskniv. Den siden som vender mot det nedre kammer ble farget med 0,05% krystallfiolett flekken, og de festede celler ble tellet under et lysmikroskop. Forsøket ble gjentatt tre ganger.
Statistisk analyse
Sammenheng mellom
ATP5J
uttrykk og kliniske egenskaper ble vurdert ved hjelp av korrelasjonsanalyse, og forskjeller mellom gruppene ble vurdert ved hjelp av Wilcoxon matchet-pair test eller ANOVA hjelp SPSS15.0 programvare (SPSS Inc., Chicago, USA).
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
ATP5J
var over-uttrykt i kliniske kolorektal kreft vev
I Sage database (http:. //cgap.nci.nih.gov/SAGE/AnatomicViewer), søkte vi etter en rekke kandidat gener de ble uttrykt forskjellig i tykk- og endetarmskreft. Flere interessante gener ble identifisert, inkludert tetraspanin TM4-C, oligophrenin 1, ATP5J, transmembrane glykoprotein A33 forløper, DHRS9, cytidindeaminase, uroguanylin, og dual-spesifisitet fosfatase 1. Men våre primære resultater fra RT-PCR viste at bare uroguanylin var redusert og at
ATP5J
var over-uttrykt i kolorektal kreft (figur 1A). De andre gener var uendret eller umulig å oppdage i vårt eksperiment (data ikke vist). Fordi uttrykk for uroguanylin og dens funksjon i tykktarmskreft er avklart i en tidligere rapport [19], men ikke for
ATP5J
genet, sistnevnte ble valgt som den unike mål i vår studie.
(A) RT-PCR resultatene for
ATP5J Hotell og
uroguanylin
gener. (B) immunhistokjemisk farging resultater for tilstøtende vev og kreftvev. (C) immunhistokjemisk farging resultater for tilstøtende vev, kreftvev, og metastatisk lymfeknute vev.
For å bekrefte uttrykk for
ATP5J
i tykktarmskreft, vi videre analysert uttrykket av
ATP5J
mRNA ved RT-PCR i friske tumorvev og tilstøtende normalt vev fra de 72 sammenhengende pasienter (tab 1). Resultatene indikerte at positive prosenter av RT-PCR for
ATP5J
i vev fra pasienter med kolorektal kreft nådd ca 54,17%, som var lik mellom tykktarmskreft og endetarmskreft. Men uttrykk for
ATP5J
var signifikant høyere i kolorektal kreft vev enn i normalt vev mellom PCR-positive pasienter (tabell 1,
P
0,01). Våre immunhistokjemisk farging resultater fra parafinsnitt av en annen 51 pasienter som er nevnt i
Pasienter og kliniske data innsamling
seksjon indikerte et lignende resultat, men med en høyere positiv ratio (figur 1B og tabell 1,
P
0,05). Videre farging resultatene viste også at
ATP5J
uttrykk var betydelig høyere i metastatiske lymfeknuter enn på barnekreftvevet (figur 1C og tabell 2,
P
0,05).
ATP5J tilstand
sak nr.
Positive tilfeller
Positive tilfeller «fordeling av ATP5J uttrykk i tumor vs. nærliggende vev
P
verdi
T
* En
*
T = A
T En
mRNA ved PCR7239 (54,2%) 32 (82,1%) 6 (15,4%) 1 (2,6%) 0.01Protein av IM
* 5149 (96,1%) 32 (65,3%) 15 (30,6%) 2 (4,1%) 0.05Table 1. Tilstanden ATP5J uttrykk i kolorektal svulsten og omkringliggende vev product: * T:. svulst; A: tilstøtende; . IM: immunhistokjemisk farging CSV ned CSV ATP5J i MLN
*
sak nr
MLN T
MLN = T
MLN T
P
verdi
Positive25 (96,2%) 12 (46,2%) 8 (30,8%) 5 (19,2%) 0.05Negative1 (3,8%) – 1 (3,8%) Tabell 2. Tilstand av ATP5J uttrykk i kolorektal tumor og metastatisk lymfe noder product: * MLN. metastatisk lymfeknuter CSV ned CSV
sammenheng mellom over-uttrykk for
ATP5J Hotell og kliniske funksjoner hos pasienter med tykktarmskreft
for å analysere forholdet mellom løpet uttrykking av ATP5J og kliniske patologiske kjennetegn ved pasienter med kolorektal kreft, parafinsnitt fra 79 pasienter, som nevnt i § av
pasienter og klinisk datainnsamling
, ble samlet. Immunhistokjemisk farging ble utført på følgende lysbildene og resultatet ble beregnet som nevnt ovenfor. Ifølge disse score,
ATP5J
uttrykket kan videre deles inn i to rekker: svak (≤4) og sterk ( 4). Deretter korrelasjonsanalyse ble gjort ved hjelp av SPSS programvare; resultatene ble vist i Tabell 3. Blant de børsnoterte kliniske funksjoner, bare grad av differensiering hadde en sammenheng med
ATP5J
uttrykk. Kjønn, alder, T scenen, lymfeknutemetastaser, samt overlevelse status viste ikke en sammenheng med
ATP5J
uttrykk. Resultatene indikerte at
ATP5J
uttrykk i godt differensierte svulster var svakere enn i dårlig eller moderat differensierte svulster (
P
0,05).
Variabel
sak nr
Svak
Sterk
P Vaule
GenderFemale358270.281Male441529Age 65 yr286220.271≤65511734T stageT1,2196130.789T3,4601743DifferentiationWell4116250.045Poor /moderate38731Histologic LNM
* Absent3612240.408Present431132Survival statusSurvival5818400.538Died21516Table 3. Sammenheng mellom ATP5J uttrykk og patients’clinical funksjoner product: * LNM. lymfeknutemetastaser CSV ned CSV
Påvisning av
ATP5J
uttrykk i tykktarm kreft cellelinjer
det var vanskelig å avklare underliggende funksjon av ATP5J i tykktarmskreft avhengig bare på de kliniske analyser. Flere molekylærbiologiske undersøkelser var nødvendig for dette formålet. Derfor vår oppmerksomhet ble flyttet fra pasienter med kolorektal kreft til cellelinjer. For å forstå uttrykk for
ATP5J
i kolorektal kreft cellelinjer ble fem kolorektal kreft cellelinjer samlet (DLD1, RKO, SW620, SW480, og Colo320), og den normale menneskelige fibroblast (NHFB) ble brukt som normalt cellekontroll. Først må vi oppsamlet mRNA produktet fra disse cellelinjene og utført RT-PCR som beskrevet tidligere. Disse resultatene viste at ATP5J mRNA ble overuttrykt i hele colon cancercellelinjer, men ikke i NHFB (figur 2A). Vi så utført Western blotting på protein prøver av disse cellelinjene. Resultatene viste et lignende fenomen. ATP5J protein ble over-uttrykt i fire tykktarmskreft cellelinjer (unntatt RKO) sammenlignet med NHFB (figur 2B). Basert på disse resultatene, vi valgte hovedsakelig DLD1 celler for neste del av vår studie; DLD1 viste en moderat grad av
ATP5J
uttrykk, som var praktisk for å observere nedregulering samt oppregulering av genuttrykk i samme cellelinje ved hjelp av molekylære teknikker.
(A) RT-PCR-resultater for ATP5J mRNA. (B) Western blotting resultater for ATP5J protein.
nedregulering av
ATP5J
uttrykk svekket celle migrasjon og økt 5-Fu følsomhet i DLD1 celler
Først vi nedregulert
ATP5J
uttrykk i DLD1 cellene gjennom stabil transfeksjon med et plasmid som uttrykker shRNA targeting ATP5J. Etter koloniseleksjon ble Western blotting utført (figur 3A). Uttrykket av ATP5J ble nedregulert dramatisk i klone 4 og marginalt i klone 9. Vi valgte klone 4 for videre studier og definerte det som ATP5J shRNA /4. I mellomtiden, klon 2 fra styre shRNA ble benyttet som vektor kontroll (Vector), og villtype DLD1 (WT) ble anvendt som en mock-kontroll.
(A) Western blot resultat for ATP5J protein i forskjellige kloner av DLD1 celle etter stabil transfeksjon med de samme ATP5J shRNA plasmid. (B) sårhelende analysen for WT, Vector og ATP5J shRNA /4 DLD1 celler. Data representerer en av tre lignende eksperimenter (opprinnelig forstørrelse: x100). (C) Migrasjon av WT, Vector og ATP5J shRNA /4 DLD1 celler ble analysert ved hjelp av en 24-Transwell system. Bildene av migrerte celler ble tatt 24 timer etter utsåing (opprinnelig forstørrelse: x 100). Data representerer en av tre lignende eksperimenter. (D) kvantitative analyser av tre cellemigrerings analyser. Verdier representerer betyr ± SD. *
P
0,05; (E) apoptotisk forhold mellom WT, Vektor, og ATP5J shRNA /4 DLD1 celler etter behandling med 50 umol /L 5-Fu i 3 dager. Data representerer en av to lignende eksperimenter. Verdier representerer betyr ± SD. *
P
. 0,05
Resultatene av MTT analysen, cellesyklus ved flowcytometri, eller klone formasjon ved klonogene analysen viste ingen forskjeller i celleoverlevelse blant WT, Vector og ATP5J shRNA /4 grupper (data ikke vist). Men data fra sårhelende analysen indikerte at cellene i ATP5J shRNA /4 gruppen tok 48 timer til å lukke en ripe såret, mens cellene i WT og Vector grupper tok 48 timer for å helbrede en sår av tilsvarende størrelse (Figur 3B). Dette resultatet antydet at nedregulering av
ATP5J
svekket evne til cellemigrering i DLD1 celler. For å kvantifisere effekten av
ATP5J
nedregulering på celle migrasjon, en ytterligere migrasjon analysen ble utført. Resultatene av denne ytterligere analyse viste at antallet migrerte celler i ATP5J shRNA /4 gruppe ble signifikant redusert sammenlignet med både WT og Vector grupper (figur 3C og 3D,
P
0,05).
i tillegg ønsket vi å evaluere responsen av kreftceller til anti-kreft terapi etter ATP5J uttrykket ble endret. For dette formål, valgte vi 5-fluorouracil (5-FU) for neste studien, fordi det er en hyppig brukt anti-metabolitt kjemoterapeutisk medikament i tykktarmskreft. Våre resultater viste at de apoptotiske forholdet mellom ATP5J shRNA /4 gruppe var høyere enn for både WT og Vector grupper etter behandling med 50 umol /L 5-Fu i 3 dager (figur 3E, P 0,05). Dette resultatet antydet at nedregulering av
ATP5J
økte følsomheten DLD1 celler til 5-Fu.
For å bekrefte funksjonen ATP5J i den andre cellelinjen lenger, vi slått ned
ATP5J
ekspresjon i SW620-celler ved å bruke det samme plasmid som nevnt ovenfor. Etter koloni utvalg, identifiserte vi en klone der
ATP5J
uttrykk ble dramatisk nedregulert; vi heter det ATP5J shRNA /3 (Figur 4A). Resultatene fra både apoptose deteksjon og celle levedyktighet analyser antydet at ATP5J shRNA /3 gruppe avledet fra SW620 celler var mer følsomme for 5-Fu sammenlignet med WT og Vector grupper etter behandling med 50 mikromol /l 5-Fu i 3 dager (Figur 4B og 4C,
P
0,05). Dette resultatet er i overensstemmelse med våre tidligere data fra DLD1 celler og videre validerer funksjon av ATP5J i tykktarmskreftceller.
(A) Western blot resultat for ATP5J protein i forskjellige kloner av SW620 celle etter stabil transfeksjon med de samme ATP5J shRNA plasmid. (B) apoptotisk forhold på WT, vektor, og ATP5J shRNA /3 SW620-celler etter behandling med 50 umol /L 5-Fu i 3 dager. (C) cellenes levedyktighet analyser av WT, Vektor, og ATP5J shRNA /3 SW620-celler etter behandling med 50 umol /L 5-Fu i 3 dager. Data representerer en av to lignende eksperimenter. Verdier representerer betyr ± SD. *
P
. 0,05
Up-regulering av
ATP5J
uttrykk forbedret cellemigrasjon og redusert 5-Fu følsomhet i DLD1 celler
Deretter ønsket vi å bekrefte vår resultat ved bruk av en motsatt tilstand der
ATP5J
uttrykk ble videre oppregulert. For å oppnå dette målet, den pcDNA3.1 (+) /ATP5J plasmid ble stabilt transfektert inn i DLD1 celler. Etter koloni utvalg, ble Western blotting utført (figur 5A). Den ATP5J uttrykk var oppregulert dramatisk i kloner 2, 3 og 4. Vi tilfeldig valgte kloner 2 og 4 for videre studier og definert dem som ATP5J /A2 og ATP5J /A4, henholdsvis. I mellomtiden, klon 7 fra styre plasmid ble anvendt som vektor kontroll (Vector) og villtype DLD1 celler (WT) ble brukt som en mock-kontroll.
(A) Western blot resultat for ATP5J protein i DLD1 celler etter stabil transfeksjon med pcDNA3.1 (+) /ATP5J plasmid. (B) sårhelende analysen for WT, Vector, ATP5J /A2, og ATP5J /A4 celler. Data representerer en av tre lignende eksperimenter (opprinnelig forstørrelse: x100). (C) Migrations av WT, Vector, ATP5J /A2, og ATP5J /A4 celler ble analysert ved hjelp av en 24-Transwell system. Bildene av migrerte celler ble tatt 24 timer etter utsåing (opprinnelig forstørrelse: x 100). Data representerer en av tre lignende eksperimenter. (D) Kvantitativ analyse av tre celle-migrering analyser. Verdier representerer betyr ± SD. *
P
0,05. (E) apoptotisk forhold mellom WT, vektor, ATP5J /A2, og ATP5J /A4-celler etter behandling med 50 umol /L 5-Fu i 3 dager. Data representerer en av to lignende eksperimenter. Verdier representerer betyr ± SD og *
P
. 0,05
De data om celleoverlevelse, cellesyklus, og klone formasjon gitt resultater som ligner de som er beskrevet ovenfor. Det ble ikke observert forskjell mellom WT, Vector, ATP5J /A2, og ATP5J /A4 gruppene (data ikke vist). Den sårhelende analyse viste at cellene i de ATP5J /A2 og ATP5J /A4 grupper tok 44 timer for å stenge en ripe sår, mens cellene i de WT og Vector grupper tok 44 timer for å helbrede et sår av tilsvarende størrelse ( Figur 5B). Dette resultatet antydet at oppregulering av
ATP5J
forbedret cellemigrering i DLD1 celler. En ytterligere celle-migrering-analysen viste at antallet migrerte celler i ATP5J /A2 og ATP5J /A4-gruppene var signifikant økt sammenlignet med de i WT og Vector grupper (figur 5C og 5D,
P
0,05). I mellomtiden, etter behandling med 50 umol /L 5-Fu i 3 dager, den apoptotiske forhold mellom ATP5J /A2 og ATP5J /A4-gruppene var signifikant lavere enn for de WT og Vector gruppene (figur 5E, P 0,05), noe som indikerer at oppregulering av
ATP5J
indusert DLD1 celler til å motstå til 5-Fu.
Diskusjoner
Vår studie undersøkte status for
ATP5J
uttrykk i pasienter med kolorektal kreft, og våre resultater viste at
ATP5J
ble over-uttrykt i disse pasientene. Dette resultatet var motsatt den som i Sage database. Det kan være på grunn av forskjellen av prøvestørrelsen, så vel som utvalgsskjevhet. Ifølge våre data, var det flere ulike forhold av ATP5J uttrykk i tykktarmskreft, en av dem ble redusert. I tillegg er prøvestørrelsen som brukes av databasen var meget liten. Så det kan bli forstått at vi hadde en annen konklusjon om ATP5J uttrykk i tykk- og endetarmskreft. Videre ble resultatene oppnådd ved både mRNA og protein nivå og bør derfor være overbevisende.
Videre viste resultatene at graden av differensiering var korrelert med
ATP5J
uttrykk. I henhold til den publiserte litteratur, tumor differensiering var en prognose faktor for pasienter med kolorektal kreft [20,21]. Basert på dette,
ATP5J
uttrykk kan være korrelert med overlevelsen status, men våre data ikke viste denne sammenheng. Tilleggs våre resultater viste også at
ATP5J
uttrykk var høyere i metastatiske lymfeknuter sammenlignet med tilsvarende primær kreftvev, men det hadde ingen sammenheng med lymfeknutemetastase. Avviket kan skyldes for mange ukontrollerbare faktorer klinisk, snarere enn av forholdene i molekylærbiologiske studier, som ble kontrollert nøyaktig. Det kan også forårsakes av liten størrelse av inkluderte pasienter og trenger en undersøkelse med store prøver. Uavhengig av denne uenigheten, våre ytterligere resultater perspicuously indikerte at nedregulering av
ATP5J
uttrykk svekket celle migrasjon og økt 5-Fu følsomhet i DLD1 celler.
