Abstract
mikroRNA regulerer cellulære responser for ioniserende stråling (IR) gjennom translasjonell kontroll av målgener. Vi analyserte tidsserie endringer i mikroRNA uttrykk følgende γ-bestråling i H1299 lungekreftceller ved hjelp av microarray analyse. Betydelig endret IR-responsive microRNAs ble valgt basert på analyse av avviksanalyse, og spådde målet mRNA ble anriket i mitogen-aktivert protein kinase (MAPK) signal. Samtidig analyse av tidsserien mRNA og mikroRNA profiler avdekket at ekspresjon av MIR-26b ble regulert ned, og dens mål aktiverende transkripsjonsfaktor 2 (ATF2) mRNA ble regulert opp i y-bestrålte H1299-celler. IR i MIR-26b overexpressed H1299 celler kunne ikke fremkalle uttrykk for ATF2. Når c-Jun N-terminal kinase aktivitet ble hemmet ved hjelp SP600125, uttrykk for MIR-26b ble indusert etter γ-bestråling i H1299 celler. Fra disse resultatene, konkluderte vi med at IR-indusert oppregulering av ATF2 ble coordinately forsterket av undertrykkelse av Mir-26b i lungekreftceller, som kan forsterke effekten av IR i MAPK signalveien
Citation.: Arora H, Qureshi R, Park AK, Park Wyoming (2011) Coordinated Regulering av ATF2 av Mir-26b i γ-Bestrålet lungekreft celler. PLoS ONE 6 (8): e23802. doi: 10,1371 /journal.pone.0023802
Redaktør: Sangdun Choi, Ajou University, Korea
mottatt: 16 juni 2011; Godkjent: 26 juli 2011; Publisert: 25 august 2011
Copyright: © 2011 Arora et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette papiret støttes av en Korea Science and Engineering Foundation (KOSEF) stipend (M20706000020-07M0600-02010), og i grunn Research Laboratory (BRL) program gjennom National Research Foundation of Korea finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (2009 -0087452) og av Korea Healthcare Technology R D Project, departementet for helse, velferd og familiedirektoratet (A084022). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs blir transkribert ved RNA polymerase II, og binder seg til det 3′-ikke-translatert region (UTR) for å undertrykke translasjon av mål-mRNA [1]. På posttranskripsjonelt nivå blir microRNAs involvert i mange biologiske prosesser, inkludert utvikling [2], proliferasjon, celledød [3], og tumorigenesis [4]. Mange studier har analysert den transkripsjonelle regulering av mRNA og microRNAs i y-bestrålte celler for å forstå cellulære responser overfor ioniserende stråling (IR) [5], [6], [7].
mitogen-aktivert protein kinase (MAPK) reaksjonsveien spiller en viktig rolle i forskjellige biologiske prosesser, slik som apoptose, proliferasjon, differensiering, WNT signalisering, og p53-signalering. MAPK-signalisering er ofte deregulert i humane kreftformer, noe som fører til ukontrollert cellevekst og overlevelse [8]. IR kan indusere aktivering av MAPK veier å kontrollere celleoverlevelse i en celle måte typeavhengig [9]. IR-responsive aktiveringen av MAPK signalveier er relatert til cellevekst [10].
fleste cellulære signalveier kan reguleres ved transkripsjonen og posttranslational kontroll av gener. Den microRNAs MIR-7, MIR-4, MIR-79, MIR-2, og MIR-11 er involvert i Notch signalveier ved å målrette de regulatoriske sekvensmotiver i 3 «UTR av målgener [11]. MIR-15 og MIR-16 er involvert i Nodal signalveien [12]. Nuclear faktor kappa lys polypeptid genet forsterker i B-celler 1, en DNA-skader-signale mellommann, reguleres av MIR-9 og la-7 g respons på IR i lungekreft cellelinjer [7]. I denne studien har vi undersøkt tidsserien uttrykk profilen til microRNAs i y-bestrålt lunge kreft cellelinjer. Vi prøvde å identifisere IR-responsive microRNAs som regulerer uttrykket av MAPK signalnettverk gener gjennom samtidig analyse av mikroRNA og mRNA-profiler. Vi demonstrerte koordinert regulering av aktivering transkripsjonsfaktor 2 (ATF2), som er kodet av en MAPK signale gen, ved Mir-26b som svar på IR.
Resultater
For å forstå posttranskripsjonelt kontroll cellulære responser til IR etter microRNAs, ble genom-wide ekspresjonsprofilen av mikroRNA undersøkt i H1299 humane lungekreftceller ved 0, 4, 8, 12 og 24 timer etter behandling med 2Gy av γ-stråling. Den mikroRNA ekspresjonsprofilen ble analysert ved en-veis analyse av varians (ANOVA) for å velge IR-responsive microRNAs. Blant 328 mennesker microRNAs på microarray, uttrykket av 56 (17,1%: 30 oppregulert og 26 nedregulert) ble vesentlig endret i H1299 celler (p 0,05; Figur 1 og tabell S1). Fremstående forandringer ble observert 8 timer etter y-bestråling i de fleste av IR-responsive microRNAs.
reverstranskribert små RNA fra hvert tidspunkt ble merket med Cy5. Fargekoden representerer den relative ekspresjon av angitte microRNAs for hvert tidspunkt. En liste over alle microRNAs er tilgjengelig i tabell S1.
For å utforske den fysiologiske betydningen av IR-responsive mikroRNA, vi listet spådde målet mRNA av IR-responsive microRNAs og beriket signalveier ble valgt basert på berikelse og statistisk analyse av forventet target mRNA ved DIANA-mikrotiterplater-3.0. Blant de nevnte signalveier, fokuserte vi på de 10 banene basert på statistisk signifikans (tabell 1). Vi valgte spesielt MAPK signalveien for videre analyse fordi denne signalveien er avgjørende for å overleve som svar på DNA-skade [13].
For å validere regulering av MAPK signalveien ved IR-responsive microRNAs, vi meta-analyse mRNA uttrykk profiler av samme y-bestrålt H1299 celler fra våre publiserte datasett [14]. I samtidige analyse av mål-mRNA og IR-responsive mikroRNA, søkte vi to kriterier: 1) statistisk signifikante forandringer (p 0,05) i mRNA-ekspresjon ved γ-bestråling ved ANOVA-analyse og 2) den høye inverse korrelasjonsverdi (r -0,4 ) mellom mRNA og mikroRNA uttrykk. Som oppsummert i figur 2 og tabell S2, identifiserte vi 35 par av IR-responsive microRNAs og målet mRNA, inkludert 19 microRNAs og 23 ikke-overlappende mRNA for MAPK signalveien gener i H1299 celler.
validert uttrykk mønstre av IR-responsive microRNAs og målet mRNA for MAPK signalveien. Blant 35 parene, vi valgte og analysert fire (MIR-26b: ATF2, MIR-7: FOS, MIR-20a: MAP3K5, og MIR-128: PPARG) parene ved revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR, figur 3A , B, C og D). Som påvist i microarray datasett (figur 2), fant vi at ATF2, FOS, og MAP3K5 var opp regulert og PPARG ble nedregulert på IR eksponering. MicroRNAs som MIR-26b, MIR-7, og MIR-20a ble nedregulert, og MIR-128 var opp regulert ved IR eksponering. Ved real-time RT-PCR, viste vi at uttrykk mønstre av utvalgte IR-responsive microRNAs og målet mRNA ble godt matchet med de av microarray expression data.
Uttrykket av fire par mikroRNA og målrette mRNA som (A) MIR-26b: ATF2, (B) MIR-7: FOS, (C) MIR-20a: MAP3K5, og (D) MIR-128: PPARG) ble kvantifisert ved hjelp av real-time revers transkripsjon-polymerase chain reaksjon (RT-PCR) ved den angitte tid. Verdiene ble normalisert med glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) mRNA for mål-mRNA og U6B liten RNA for microRNAs. Alle verdier er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD) fra tredoble eksperimenter.
nedregulert IR-responsive microRNAs kan forsterke funksjonen til målet mRNA. For å teste forholdet mellom nedregulert IR-responsive microRNAs og målet mRNA, valgte vi de to ATF2 og Mir-26b blant 35 par for å demonstrere koordinert regulering mellom microRNAs og målet mRNA ved IR eksponering. En forutsagte mål ble identifisert for MIR-26b i posisjon 112 til 118 av den ATF2 3 «UTR, som vist i figur 3A. Overekspresjon av MIR-26b i H1299 celler kan undertrykke uttrykket nivået av ATF2 mRNA. I tillegg, ble proteinnivået av ATF2 redusert i MIR-26b-overuttrykt celler (figur 4A). I luciferasepreparater analyser, Mir-26b trykt oversettelsen av luciferase i konstruksjoner med 3 «UTR av ATF2, men ikke de uten 3’UTR (figur 4B). Den undertrykkende effekt av Mir-26b på ATF2 ble også observert i y-bestrålt H1299 celler (figur 4C), som ble påført inntil 12 timer etter IR eksponering.
(A) In Mir-26b transfektert H1299 celler, ekspresjon av mikroRNA ble bekreftet ved sanntids RT-PCR. Ekspresjonen av mRNA ATF2 i MIR-26b-transfekterte celler ble målt ved hjelp av sanntids-RT-PCR. De relative ATF2-ekspresjonsnivåer ble normalisert mot GAPDH og presentert som gjennomsnitt ± SD fra triplikate eksperimenter. Proteininnholdet av ATF2 ble også undersøkt ved western blot i mikroRNA-transfekterte celler. (B) Celler ble transfektert med den tomme Renilla luciferase reporter-genet (psiCHECK2) eller reporter-genet fusjonert med ATF2 3 «UTR. I tillegg ble cellene ko-transfektert med MIR-26b eller uten MIR-26b; Resultater er uttrykt som relative lysenheter (RLU) og ble normalisert med luciferase-aktiviteten uttrykkes konstitutivt ved psiCHECK2 vektoren. (C) Den relative uttrykk for ATF2 i MIR-26b transfektert og IR utsatt celler ved 4 (hvit), 8 (grå) og 12 (sort) timer hhv.
Deretter ønsket vi å bekrefte virkningen av MAPK-signalering på nedregulering av MIR-26b i y-bestrålte celler. Vi hemmet MAPK signalveien ved hjelp SP600125, en c-Jun N-terminal kinase (JNK) inhibitor, i y-bestrålt H1299 celler. Behandling med SP600125 ikke endre basal uttrykk nivået ATF2; Men induksjon av ATF2 på γ-bestråling ble markert blokkert i SP600125 behandlet H1299 celler inntil 12 timer etter IR eksponering (figur 5A). Ekspresjon av ATF2 krever aktivering av MAPK-signalering, som ble hemmet ved JNK ved den kjemiske inhibitor. Omvendt, ekspresjon av MIR-26b ble indusert ved behandling med SP600125 i H1299 lungekreftceller (figur 5B). Effektene av SP600125 på ekspresjonen av mRNA ATF2 og MIR-26b ble også bekreftet i A549 lungekreft cellelinjen (figur 5).
H1299 og A549-celler ble behandlet med 10 uM SP600125 i 30 minutter, og deretter utsatt for IR. De relative uttrykk for ATF2 mRNA (A) og MIR-26b (B) ble normalisert til ekspresjon kontrollnivå ved 0 timer i både kontroll og SP600125-behandlede celler ved 4 (hvit), 8 (grå) og 12 (svart ) timer. (C) Ioniserende stråling indusert uttrykk for ATF2, som nedregulert uttrykk for Mir-26b i y-bestrålt lungekreftceller.
Diskusjoner
Cellular respons på eksogene stimulering kan overvåkes ved endringer i genekspresjon, inkludert ekspresjon av microRNAs. IR kan indusere progressive forandringer i celleoverlevelse, vekst, proliferasjon og ved å påvirke genekspresjon. Tidligere rapporter har antydet at stråling kan forandre ekspresjonen mønster av gener [15], [16]. Vi analyserte mikroRNA profiler for å forstå mekanismen for mikroRNA-formidlede cellulære responser på IR, og til å identifisere regulering av MAPK-signalveien ved hjelp av IR-responsive microRNAs. I denne studien har vi belyst JNK-mediert transcriptional undertrykkelse av Mir-26b i y-bestrålt celler, som mikroRNA kan undertrykke oversettelse av målet ATF2 mRNA, et medlem av MAPK signalveien. Fra disse funnene, foreslår vi at den cellulære responsen til IR er coordinately regulert av samspillet mellom MAPK signalveien og mikroRNA.
ATF2 er en cAMP-respons element-binding (CREB) protein med en grunnleggende leucine glidelås (bzip) domene, gjennom hvilke ATF2 samhandler med andre bzip proteiner som juni, FOS, CREB, og ATF1 [17], [18]. DNA-skade og pro-inflammatoriske cytokiner kan indusere aktivering av ATF2 transkripsjonen aktivitet av JNK [19]. Rollen til forskjellige signalisering i aktivering av ATF2 er også illustrert ved heterodimere partnere i ATF2, som også er aktivert i en stimulus-spesifikk måte. Dermed kan en bestemt stimulus føre til ulike ATF2 komplekser, og dermed aktivere eller undertrykke forskjellige sub-sett av målgener [20].
Mir-26b er en intronic mikroRNA bosatt i intron IV av CTDSP1, C-terminal domene liten fosfatase 1. transkripsjonen kontroll av verts CTDSP1 mRNA er ikke fullt ut forstått, men mange mulige bindingsseter eksisterer for transkripsjonsfaktorer slik som CREB i KODE transkripsjonsfaktorbindende analyse [21]. ATF2 kunne undertrykke transkripsjon av målgener gjennom dimerisering med andre bzip transkripsjonsfaktorer. Overekspresjon av bzip proteiner slik som ATF2 og CREB forandret genekspresjon i humane myometriske celler [22]. Meta-analyse på denne microarray datasett i GEO (GSE1059) avslørte nedregulering av CTDSP1 i ATF2-overexpressed celler. Vi trenger videre studier vedrørende transkripsjonen kontroll av Mir-26b ved ATF2 i lungekreftceller; imidlertid, JNK-aktivitet og ekspresjon av ATF2 trykt ekspresjon av MIR-26b er utført i denne studien.
Dereguleringen av MAPK-signalveien kan induseres ved hjelp av IR-indusert skade på DNA [23]. I foreliggende studie ble det funnet at MAPK-signalisering er indusert i y-bestrålt H1299-celler, som kan mediere overlevelsen av H1299 lungekreftceller ved IR-eksponering. Videre aktivering av MAPK signale førte til nedregulering av MIR-26b, som støtter opprettholdelsen av ATF2 aktivitet etter tur. Fra disse resultatene, kan vi vise at eksponering av H1299 lungekreftceller til IR indusert MAPK signal fulgt av undertrykkelse av Mir-26b uttrykk, noe som førte til frigjøring av ATF2 mRNA fra posttranslational undertrykkelse av Mir-26b. Vi foreslår at Mir-26b formidler koordinere regulering av ATF2 og MAPK signalveien som svar på IR.
Materialer og metoder
Cell kultur
H1299 humane lungekreftceller var opprettholdt i RPMI 1640 og A549-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, og 2 mM L-glutamin [begge cellelinjer ble kjøpt fra ATCC]. De dyrkede celler ble enten utsatt for 2 Gy av stråling ved hjelp av en 4-MV lineær akselerator (Clinac 4/100, Varian, Palo Alto, CA, USA) eller venstre ubestrålte som en negativ kontroll. Den spesifikke JNK inhibitor SP600125 ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). H1299 cellene ble inkubert med 10 pM SP600125 i 30 minutter, og deretter utsettes for IR- (2 Gy) fulgt av total-RNA isolert ved indikerte tider.
mikroRNA mikromatrise
mikroRNA fra hver cellelinje var utvinnes ved hjelp av Mirvana mikroRNA isolasjon kit (Ambion, Austin, TX, USA) i henhold til produsentens protokoller. Purified microRNAs ble merket med Mirvana mikroRNA Array Merking Kit og koblet til Cy5 Post-merking Reactive Dye (Amersham, GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ, USA). De merkede Prøvene ble vasket og hybridisert i to eksemplarer til Mirvana mikroRNA Bioarrays (Ambion) ved hjelp av Mirvana mikroRNA Bioarray Essentials Kit. Fluorescensstyrkene ble behandlet og målt ved hjelp av Genechip skanner 3000 7G (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Nivåene av mikroRNA hybridisering ble bestemt med GenePix Pro 6.0-programvare som anbefalt av produsenten. Bakgrunnen justerte intensitet for hvert mikroRNA ble underkastet en global varians stabilisering normaliseringsprosedyre [24]. Alle data er MIAME kompatibel og rådata har blitt deponert i en MIAME kompatibel database (GEO) (sjonsnummer – GSE30075).
Statistiske og bioinformatikk analyse
For å identifisere microRNAs som uttrykk nivåer endret seg vesentlig gjennom hele tidsforløpet, anvendte vi en-veis ANOVA-analyse. Vurderer sammenhengen strukturen innenfor sett gjentak [25] i Mirvana mikroRNA Bioarrays, utførte vi enveis ANOVA analyse på 328 menneskelige microRNAs. DIANA (https://diana.cslab.ece.ntua.gr/), som integrerer mennesker og mus microRNAs inn pathways å forutsi mikroRNA mål [26], ble utført i første omgang å identifisere veier.
RNA forberedelse og kvantitativ real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert fra cellelinjer ved hjelp av TRIzol-metoden, og deretter revers transkribert til komplementære DNA ved hjelp av Superscript II revers transkriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og oligo- (dT) 12-18 primere i henhold til produsentens protokoll. Den kvantitative RT-PCR for angitte gener ble utført i en reaksjonsblanding inneholdende SYBR Premiks Ex Taq (Takara Bio Inc., Shiga, Japan). Kvantifisering av microRNAs ble utført ved hjelp av TaqMan mikroRNA analyser (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. Prøvene ble analysert ved anvendelse av ABI PRISM 7000 sekvens deteksjonssystem (Applied BioSystems). Alle PCR ble utført i triplikat, og spesifisiteten av reaksjonen ble bestemt ved å smelte kurve analyse ved dissosiasjon stadium. Vi syntetisert spesifikke primere for ATF2 (forover: 5′-AGATTTATTAATTTTTCTGTGCTCAA-3 «; omvendt: 5» ACACCCCCATTTATTAAAACACC-3 «), FOS1 (forover: 5′-TGTGTTCCTGGCAATAGTGTG-3′; omvendt: 5»-CAATGAACATTGATGTTGAAGAAA-3 «), MAP3K5 (frem: 5»-GCAGCAGCTATTGCACTTCA-3 «; omvendt: 5′-TGGTCACATTTTGGTTTTGTTC-3′) og PPARG (forover: 5»-CCTGCAGGAGATCTACAAGGA-3 «; omvendt: 5′-GGTGTCAGATTTTCCCTCAGA-3»). Den relative kvantitative metode ble brukt for den kvantitative analyse. Kalibratoren ble i gjennomsnitt ΔCt fra ubehandlede celler. Den endogene kontrollen var glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) for gener og U6B for microRNAs.
Western blotting
Cellene ble høstet og lysert i NP-40 buffer inneholdende fenylmetylsulfonylfluorid og proteasehemmer Cocktail (Sigma, St. Louis, MO, USA). Proteinekstrakter ble deretter separert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese, og deretter overført til polyvinylidenfluorid membraner (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Membraner ble inkubert med en ATF2-antistoff (1:1000; Santa Cruz Biotechnology Inc.) i Tris-bufret saltvann Tween 20 buffer med ikke-fettholdig tørrmelk, og deretter inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (fortynning 1:5000; Bio -Rad). Immunreaktive bånd ble visualisert ved hjelp av West-Q-kjemiluminescenssubstrat Kit Plus (BIOTANG, Waltham, MA, USA).
konstruerer, transfeksjon, og luciferase assay
Forløperen fra Mir-26b ble klonet inn i pcDNA3 (Invitrogen) ved å genomisk DNA PCR med primere (forward: 5′-CCGGAATTCCGGATGGGAATTGGATACAT-3 «, omvendt: 5′-ATTGCGGCCGCAGCTACCCTGACCACTGCTGC-3»). De 3 «UTR av ATF2 ble klonet nedstrøms for Renilla luciferasegenet i psiCHECK2vector (Promega, Fitchburg, WI, USA). Den konstruksjon ble transfektert ved bruk av Fugene HD-reagens (Roche, Basel, Sveits) for sanntids RT-PCR, Western blotting, og luciferase-analyser. Luciferase analyser ble utført ved anvendelse av dual-Luciferase-analyse kit (Promega). Normalisering av Renilla uttrykk ble utført ved hjelp ildflue luciferase stede i psiCHECK2 vektoren.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Liste over utvalgte microRNAs fra H1299 celler.
doi: 10,1371 /journal.pone.0023802.s001 plakater (XLSX)
Tabell S2.
Selected mRNA: mikroRNA par av MAPK-signalveien, basert på anrikning analyse.
doi: 10,1371 /journal.pone.0023802.s002 plakater (XLSX)
Takk
Forfatterne takker medlemmene av Park laboratorium for diskusjon samt H.-S . Shin og H.-J. Jeon for mikroRNA mikromatriser.
