Abstract
Selv om Wnt signal har vist seg å være viktig for embryo morphogenesis og kreft patogenesen av flere vev, dens rolle i prostatisk utvikling og tumorigenesis er ikke godt forstått. Her viser vi at Wnt signale regulert prostata epitel forgrening morphogenesis og luminal epitelcelledifferensiering i utviklingen av rotte prostata organkulturer. Spesielt Wnt signal regulert spredning av prostata epitelceller stamceller. Vurdering av uttrykket nivåer av en Wnt sti transkripsjonen målet genet, Axin2, viste at Wnt veien ble aktivert i utvikling av prostata, men ble nedregulert i voksen. Kastrering resulterte i en oppregulering av Axin2 mens resulterte androgen erstatnings i en nedregulering av Axin2. Slike dynamiske endringer av Wnt aktivitet ble også bekreftet i en BAT-gal-transgene mus linje hvori β-galaktosidase reporter uttrykkes under kontroll av β-catenin /T-celle-faktor responsive elementer. Videre vurderte vi rollen som Wnt signal i prostata tumorigenesis. Axin2 uttrykk ble funnet oppregulert i de fleste menneskelige prostata kreft cellelinjer undersøkt. Videre er tilsetningen av en Wnt pathway inhibitor, Dickkopf 1 (DKK1), i dyrkningsmediet i betydelig grad hemmet prostatacancer cellevekst og migrasjon. Disse funnene tyder på at Wnt signal regulerer prostata epitel ductal forgrening morphogenesis ved å påvirke celledeling, og fremhever en rolle for Wnt veien aktivering i prostatakreft progresjon
Citation. Wang BE, Wang XD, Ernst JA, Polakis P, Gao WQ (2008) Regulering av epithelial Forgrening morphogenesis og kreft celle vekst av prostata ved Wnt signalnettverk. PLoS ONE 3 (5): e2186. doi: 10,1371 /journal.pone.0002186
Redaktør: Hernan Lopez-Schier, Centre de Regulacio Genomica, Spania
mottatt: 17 januar 2008; Godkjent: 07.04.2008; Publisert: 14. mai 2008
Copyright: © 2008 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Wnt signalveien er avgjørende i en rekke biologisk prosess inkludert nevrale mønster, planar polaritet, stamcelle vedlikehold og celledifferensiering [1]. Dette er blitt vist i en rekke systemer, via genetiske og biokjemiske metoder. Wnt signalisering innledes ved ekstracellulære proteiner, dvs. Wnts, ved binding til deres respektive frizzled familie av reseptorer. Signalet blir så omformet til p-catenin via en kaskade av signaloverførende molekyler i cytoplasma. β-catenin deretter trer inn i kjernen, danner et kompleks med TCF og transaktiverer nedstrøms målgener som regulerer eller deltar i forskjellige prosesser. Kompleksiteten i signale oppstår delvis fra de mange komponentene i denne veien, inkludert for eksempel 19 menneskelige Wnt ligander, en Wnt hemmende faktor (WIF), 5 utskilte frizzled relaterte proteiner (SFRPs) som kan beslaglegge Wnt ligander fra binding til sine beslektede reseptorer , 2 med lav tetthet lipoprotein-reseptor-relaterte proteiner (LRP5 /6) og 4 Dickkopf (DKK) proteiner som modulerer aktiviteten av reseptorer frizzled [1], [2].
i den kanoniske Wnt vei, og stabilisering translocalization av β-catenin til kjernen er et kritisk trinn i Wnt signale aktivering. I fravær av Wnt ligandbinding, er β-catenin rettet mot nedbrytning gjennom dets interaksjon med adenomatosis polyposis coli (APC) proteinet og Wnt signal er minimalt aktivert. Når APC er mutert, akkumulerer β-catenin i kjernen og Wnt signalering er konstitutivt aktiv [1]. Wnt signale nedstrøms program er dårlig forstått, og en meget nyttig nedstrøms gen som er spesifikt for denne veien er Axin 2, som ved transkripsjon og translasjon, virker som en negativ feedback regulator av Wnt siginaling veien, ved å hjelpe direkte β-catenin for nedbrytning i proteasomet [3], [4]. Stabilisering av β-catenin protein og heving av Axin2 transkript anses indikatorer på Wnt pathway aktivering [4].
dysregulering av Wnt signalisering er også assosiert med cancer patogenesen til forskjellige vev [5], [6]. Genetiske endringer i APC-genene bevirker predisposisjon for kolorektal kreft (Groden, Cell, 1991), og de tumor suppressor funksjon av APC /onkogen virkning av Wnt reaksjonsveien er klart vist i APCmin transgene mus hvor mange adenomer dannes i tarmen [7]. Rollen Wnt veien i prostata tumorigenesis har nylig fått økt oppmerksomhet, men er fortsatt ikke godt forstått. Nyere studier har rapportert at visse wnt ligander slik som Wnt1 er uttrykt i prostata kreftcellelinjer, og ser ut til å være forhøyet i noen humane prostata tumorvevet [8]. Spesifikke Wnt pathway hemmere som WIF1 ser ut til å bli nedregulert i en betydelig andel av prostatakreft prøvene [9]. Prostata spesifikt delesjon av APC-genet i mus resulterer i dannelsen av adenokarsinom [10]. I tillegg har interaksjon mellom β-catenin og androgenreseptoren (AR) blitt vist å forbedre AR-mediert transkripsjon [11], som spiller en kritisk rolle i løpet av prostatakreft progresjon. Belyse hvordan Wnt signal regulerer prostatahyperplasi utvikling og tumorigenesis ville rette for utvikling av nye terapeutiske midler for behandling av prostatakreft.
I et forsøk på å forstå hvilken rolle Wnt signal i prostata epitel utvikling, utførte vi organkulturer utvikle prostata fremstilt fra tidlig postnatal rotter for å fastslå effekten av modulering av Wnt signalveien på prostata epitel forgrening morphogenesis. Vi fant at Wnt aliserte regulert prostatisk epitelcelledifferensiering gjennom å påvirke proliferasjon av prostata epiteliale progenitorceller. I tillegg TaqMan RT-PCR-analyse viste at flere vanlige studert prostatakreftcellelinjer og xenotransplantater viste aktivering av Wnt pathway. Videre Dickkopf1 (DKK1), en Wnt pathway inhibitor [12] – [14], inhiberte signifikant prostatakreft cellevekst og migrasjon. Disse funnene sammen tyder på at aktivering av Wnt pathway spiller en avgjørende rolle under prostata utvikling, og etterveksten og at hemme Wnt veien kan være av terapeutisk verdi i behandling av prostatakreft progresjon.
Resultater
Wnt signal regulerer prostata epitel forgrening morphogenesis
prostata epitel forgrening morphogenesis i gnager i hovedsak skjer etter fødselen av ekspansjon og videre forgrening fra epiteliale primodia [15], [16]. Denne prosessen kan rekapitulert i en praktisk organkultur system [17], [18]. For å undersøke om Wnt signal spiller en rolle i prostata epitel forgrening morphogenesis, behandlet vi organkulturer av postnatal dag 2 (P2) rotte ventral prostata med en Wnt ligand, Wnt3a, eller en potent Wnt signal hemmer, DKK1 [12]. Som vist på fig. 1, prostata i kontrollkulturer viste omfattende forgrening med ikke bare primære og sekundære kanaler, men også høyere, fine greiner etter 7 dager i kultur (Fig. 1a). Imidlertid vevet i kulturene behandlet med Wnt3a ved en konsentrasjon på 50 nM vises avstumpet, forstørrede ductal tips (pil på fig. 1B) og et redusert antall tertiære, fine grener. Prostata behandlet med DKK1 400 nM, de prostata dukket opp mindre i størrelse og hadde færre epiteliale grener. Men i motsetning til Wnt3a-behandlede prostata, DKK1 behandlet prostata manglet forstørrede duktale tips (Fig. 1C). Kvantifisering av disse kulturene ved å måle diametrene av de dyrkede prostata og ductal spisser og å telle forgreningspunkter disse kulturene viste statistisk signifikante forskjeller mellom kontrollkulturer og kulturer behandlet med Wnt3a i alle aspekter 3 (fig. 1 D-F). Disse resultatene tyder på at både aktivering og hemming av Wnt signal påvirke negativt prostata epitel forgrening morphogenesis, og fremheve viktigheten av nøyaktig regulert Wnt signal for en god utvikling av prostata.
Hele montere ventral prostata ble fremstilt fra P2 rotter og holdt i 7 dager i serumfritt medium i fravær (A) eller nærvær av 50 nM av Wnt3a (B), eller 400 nM av DKK1 (C). Lignende mønster ble konsekvent sett i 3 gjentatte eksperimenter av 5-6 prostata organer per gruppe i hvert enkelt eksperiment. Merk at tilsetning av enten Wnt3a eller DKK1 til kulturen resulterte en endring i epitel forgrening morphogenesis. Kvantifisering av kulturer ved å måle diameteren av de dyrkede prostata (D) og de ductal tips (E) ved hjelp av Axiovision programvare og forgreningspunktene (F) ble utført ved å analysere 4 tilfeldig valgte kulturer per gruppe. Data er uttrykt som gjennomsnitt + SEM (t-test, sammenlignet med kontrollkulturer). Bar, 400 mikrometer.
Wnt signal påvirkninger celleproliferasjon og differensiering i utvikling av prostata epitel
prostata epitel består hovedsakelig av basal og luminal celler sammen med en mindre bestand av nevroendokrine celler [19]. Den basale celler som uttrykte p63 [20], cytokeratin 14 (CK14) og CK5 og antas å inneholde progenitor-cellepopulasjonen [21]. Luminal celler uttrykker CK8 eller CK18, og er generelt post-mitotisk og terminalt differensierte celler. I gnagere, nesten alt epiteliale celler er stamceller og formerer seg til P5 når noen av progenitorceller gjennomgå mitose terminal og differensiere til luminal celler som uttrykker bare CK8 eller CK18 [19]. For å avgjøre om modulering av Wnt signal påvirker differensiering av stamceller i luminal celler, utførte vi immunhistokjemi på deler av prostata organkulturer ved hjelp av basal og luminal cellemarkører, p63 og CK8 hhv. Som vist på fig. 2, flere p63-positive celler ble observert i den ductal region av Wnt3a-behandlede kulturer (fig. 2B) enn kontrollkulturer (fig. 2A). I motsetning til dette, færre p63-positive celler var tilstede i DKK1-behandlede kulturer (fig. 2C). Cellene som ble merket med DAPI nukleær farging i epitelet, men negativ for p63, representere de differensierte luminal-celler, som ble bekreftet ved CK8 immunfarging (data ikke vist). Celletall fra tilfeldig valgte kulturer av de 3 gruppene viste at prosentandelen av basale celler i løpet av den totale epiteliale cellepopulasjon innenfor et gitt individ ductal enhet var signifikant høyere i Wnt3a-behandlede kulturer sammenlignet med kontrollkulturer (fig. 2D). I motsetning til Wnt3a handling, forholdene mellom basalceller i forhold til totalt epitelceller var signifikant lavere i DKK1-behandlede kulturer enn den i kontrollkulturer (fig. 2C). Immunfarging ved hjelp av en CK8 antistoff viste et komplementært mønster: Wnt3a resulterte i en reduksjon i antallet celler, mens luminal DKK1 førte til en forbedret antall luminal-celler (data ikke vist). Endringen i basal vs. totalt epitelceller var ikke tilskrives celledød som TUNEL merking bare oppdaget minimal, bakgrunnssignaler med ingen forskjell mellom de tre gruppene av kulturer (data ikke vist).
vevsdelene ble kontra med DAPI (blå). Mens P63 positive celler (lilla) representerer basal celler hvor stamceller bor, de blå celler (piler) som er negative til p63 i Epitel er differensierte luminal celler. (D) Kvantifisering av p63-positive celler i løpet av de totale epitelceller. Data ble samlet inn fra tilfeldig utvalgte 22-27 duktale enheter fra deler av organkulturer per gruppe, og er uttrykt som gjennomsnitt + SEM (t-test). Legg merke til at mens Wnt3a førte til en betydelig økning i antallet av basalceller, DKK1 resulterte i en reduksjon i basalceller. Bar, 50 mikrometer for AC.
Gitt at Wnt3a og DKK1 behandlinger førte til en forbedret og redusert antall P63 positive celler, henholdsvis, som i hovedsak består av stamfedre på dette tidlige utviklingsstadiet, vi søkte å avgjøre om Wnt3a og DKK1 vil påvirke spredning av stamceller i disse prostata organkulturer ved hjelp av brom-deoxyuridine (BrdU) og Ki67 immunhistokjemi. Som vist i figur 3, etter en 3-dagers behandling, var mer prolifererende celler observert i kulturer behandlet med Wnt3a (fig. 3C, D), og færre prolifererende celler i kulturer behandlet med DKK1 (fig. 3E, F), sammenlignet til kontrollkulturer (fig. 3A, B). Celletall utført fra tilfeldig utvalgte felt indikerte at det var en 1,63 ganger økning i antall Ki67 positive celler i Wnt3a behandlet prostata organer sammenlignet med (Fig. 3G) kontrollkulturer. I motsetning til dette, var det en signifikant reduksjon i antall Ki67-positive celler i DKK1-behandlede prostata organer (Fig. 3G). I samsvar med BrdU innlemmelse analyser, vår Ki67 immunhistokjemi i 7-dagers kulturer viste også lignende celleproliferasjon fremmende og hemmende effekter ved Wnt3a og DKK1 henholdsvis (Fig. 3 H). For å forstå hvordan celleproliferasjon er regulert av Wnt signal under prostata utvikling, undersøkte vi uttrykk mønstre av flere cyclin gener i en egen microarray studie for å utvikle muse prostates. Vi fant ut at cyclin B2 uttrykk var betydelig høyere på P4 enn P19 og 10 uker gamle mus (ca. 4- og 8 ganger i henholdsvis) og at foreningen av cyclin B2 med tidlig utvikling var mye sterkere enn de andre cykliner (data ikke vist). For å bekrefte hvorvidt den forhøyede spredning, basert på Ki67 farging, sett i organkultur kan være delvis mediert av cyclin B2, utførte vi TaqMan RT-PCR analyse av disse kulturer. Som vist på fig. 3I, uttrykk for cyclin B2 var omtrent 118,8 ganger høyere og ca 4,5 ganger lavere i organkulturer behandlet med Wnt3a og DKK1 hhv. Samlet utgjør disse funnene tyder på at Wnt signal regulerer terminal differensiering av basal celler i luminal celler ved å kontrollere spredning og /eller vedlikehold av epiteliale stamceller.
(AF) Vist er anti-BrdU antistoff (B, D, F) og DAPI (A, C, E) dobbel merking av P3 rotte ventral prostata organkulturer opprettholdes i 3 dager i fravær (A, B) eller nærvær av 50 nM av Wnt3a (C, D) eller 400 nM av DKK1 (E, F). (G). Kvantifisering av BrdU-positive celler i en gitt synsfelt på 434 pm x 322 pm. (H) Kvantifisering av Ki67-positive celler i P2 prostata kulturene opprettholdt i 7 dager, som var normalisert til kontrollkulturene. Celler (for G og H) ble utført fra tilfeldig valgte visuelle felt av 5 organkulturer per gruppe, og data ble uttrykt som middel + SEM (t-test). Legg merke til at mens Wnt3a betydelig forbedret stamcelle spredning, DKK1 hemmet stamcelle spredning. (JEG). Ekspresjonsnivået endring av cyclin B2 i P2 rotte prostata organkulturer .. Data ble samlet fra 4 organkulturer holdes i 2 dager per gruppe, og er uttrykt som gjennomsnitt + SEM (t-test). Merk at uttrykk for cyclin B2 ble oppregulert ved wnt3a, men nedregulert ved DKK1. Bar, 100 mikrometer for AF.
Dynamiske endringer av Wnt signalaktivering under prostata utvikling, etter kastrering og følgende androgen erstatning
For å gi ytterligere støttende bevis for rollen som Wnt signalering i opprettholdelsen av prostata epiteliale progenitorceller, utførte vi kvantitativ RT-PCR ved anvendelse av Axin2 som en indikator for aktivering av Wnt signalering med prostatavev stilles ved forskjellige tidspunkter av utviklingen. Vi fant at Axin2 nivået var høyest på P2, men falt over tid som prostata modnet (fig. 4A). Disse data tyder på at Wnt signal er mer aktive på de tidlige stadier av utviklings prostata, i samsvar med en høyere stamceller befolkning enn i fullt utviklede prostata der flertallet av epitelcellene er terminalt differensiert luminal celler.
(A ) En gradvis nedregulering av Axin2 fra nyfødt til adulthood.nbsp, (B) Axin2 ble oppregulert etter kastrering, men tilbake til normale lave nivåer etter androgen erstatning. Data ble samlet inn fra 4-6 prøver per gruppe, og er uttrykt som gjennomsnitt + SEM (t-test, sammenlignet med normale voksne prostatakjertler). Forkortelse: N, normal prostata; C3, 3 dager etter kastrering, C17; 17 dager etter kastrering; C14 + T. 14 dager etter kastrering + 3 dager etter behandling med testosteron.
Tidligere studier har vist at den del av basalcellerommet i løpet av de totale epitelceller i prostata epitelet er endret ved kastrering og hormonell erstatnings [22 ]. Kastrering-indusert androgen uttak er kjent for å utarme ca. 90% av det epiteliale innhold [23] og resulterer i anriking av det basale /stamcellepopulasjonen. Androgen erstatnings i sin tur fører til proliferasjon av stamceller og deres differensiering til luminal-celler, noe som resulterer i prostata re-vekst tilbake til sin normale størrelse [24]. Vi utførte kvantitativ real-time RT-PCR for å sammenligne uttrykk nivåer av Axin2 i prostata høstet fra normale mus, mus etter 3 dager og 17 dager etter kastrering og mus etter 3 dager med testosteron erstatning etter kastrering. Som vist på fig. 4B, Axin2 nivåene var 1,5 ganger og 1,7 ganger høyere i prostata 3 og 17 dager etter kastrering, henholdsvis, men falt 3 dager etter testosteron erstatning. Disse data fra både utvikling og regrowing prostata indikerer at Wnt signal er positivt korrelert til basalcellenummer og omvendt korrelert med differensiering av stamceller i luminal celler i prostata.
Vi neste undersøkt en BAT-gal transgen muselinje der β-galaktosidase reporter uttrykkes under kontroll av β-catenin /Tcell faktor responsive elementer [25]. Denne musen linje har vist seg å være
bona fide
in vivo indikatorer på Wnt /β-catenin signalering, som tillater visualisering av den generelle status av Wnt aktivering i celler i et gitt vev. Undersøkelse av vevssnitt fremstilt fra prostata ved forskjellige trinn inkludert P5 (u-prostata, Fig. 5A-C), voksen (modne prostata, fig. 5D-F)), etter kastrering (fig. 5G-I) og følgende androgen erstatnings (fig. 5J-L), indikerte at antallet β-galaktosidase-positive celler var mye høyere i utviklings prostata, prostata enn voksne (28,7 ± 6,9 /kanal, n = 10 vs. 1,92 ± 0,4 /kanal, n = 13 fig. 5 M). Kastrering førte til en forhøyet antall β-galaktosidase-positive celler (5,2 ± 0,7 /kanal, n = 13), men androgen erstatnings resulterte i et lavere tall som var ekvivalent til det normale nivået hos voksne prostata (2,3 ± 0,5 /kanal, n = 15, fig. 5 M). I tillegg har vi funnet at Wnt aktivitet ble utelukkende sett i epitelceller, hovedsakelig i basal-celle hvor forløperceller bor. I tillegg dobbel merking av disse vev seksjoner med anti-p63-antistoff, et basal-cellemarkør, og anti-β-galaktosidase antistoff viste at i den voksne, det store flertallet av β-galaktosidase-positive celler ble ko-merket med anti- p63 antistoff (pilene i fig. 5A-L og N), men i postnatal prostata, det var merk antall β-galaktosidase-positive celler i luminal cellelag, som kan være på grunn av en mulighet for forsinket nedbrytning av β-galaktosidase-aktivitet i terminalt mitotiske celler som gått ut cellesyklus til å differensiere til luminal celler. Derfor er disse funnene ikke bare bekrefte dynamiske endringer av Wnt aktivitet i løpet av prostata utvikling og gjenvekst innhentet av TaqMan RT-PCR analyse av Axin2 uttrykk, men også gi ekstra støtte for foreningen av Wnt signalering med prostata basal celler hvor stamceller er generelt antas å bor.
Dobbelt farging av prostata-vev seksjoner med anti-β-galaktosidase (grønn i A, D, G, J) og anti-p63 (rød, i B, E, H, K) antistoffer, fremstilles fra mus av P5 (AC), voksen (DF), 14 dager etter kastrering (GI) og 14 dager etter androgen erstatnings (JL). Seksjonene ble kontra med DAPI (blå). Mens pilene angir celler som co-uttrykte p63 og β-galaktosidase, pilspiss (fig. 1 A-C) viser en celle som er p-gal positiv, men negativ p63 i utvikling av prostata. Legg merke til at β-galaktosidase-uttrykkende celler er plassert utelukkende i epitelet, og først og fremst i basal-celle i voksen prostata, selv om en merkbar nummeret til den blir sett i luminal cellelaget i utvikling av prostata. Bar, 50 mikrometer. (M) Kvantifisering av β-gal-positive celler pr epitelial duktalt enhet, som bestemmes i vevssnittene basert på DAPI kontra og tilstedeværelsen av en epitelial lumen. (N) legemer på β a-gal-positive celler mer enn totalt basal celler (p63-positive celler). Data ble samlet inn fra 14-20 tilfeldig utvalgte duktale enheter i avsnittene fra 4-5 prostates per gruppe, og er uttrykt som gjennomsnitt + SEM (t-test, sammenlignet med normale voksne prostata).
Hemming av Wnt signal fører til undertrykkelse av celleproliferasjon og migrasjon av prostata kreft celler
Aberrant Wnt signal har blitt observert i mange svulster [5], [6]. For å bestemme hvorvidt Wnt signalering spiller en rolle i prostatatumordannelse og tumorprogresjon, vurderte vi Wnt signal status i humane prostatacancercellelinjer og 2 humane prostata tumorxenografter ved å måle ekspresjonsnivåene av Axin2. Som vist på fig. 6, kvantitativ RT-PCR-analyse viste at Axin2 ble uttrykt på et høyere nivå i PC3, DU145 og LNCaP cellelinjer og menneskelige prostata svulst xenograft prøver (LuCaP35 og LuCaP77) [26], enn normale eller ikke-tumorigene menneskelige prostata epitelceller som Prec og BPH1 celler [27]. Derfor er Wnt signal oppregulert i prostatakreftceller i forhold til normal prostata epitelceller.
TaqMan RT-PCR analyse av Axin2 uttrykk i ulike menneskelige prostata epitelceller og kreftceller. Data ble samlet inn fra trillinger og er uttrykt som gjennomsnitt + SEM (t-test). Merk at Axin2 uttrykk er mye høyere i prostata kreft cellelinjer (LNCaP, Du145, PC3) og menneskelige prostata tumorxenotransplantater (LuCaP35, LuCaP77) sammenlignet med primær prostata epitelceller (PREC) eller ikke-tumorigenenic udødeliggjort prostata epitelceller (BPH1) .
Vi neste vurdert om Wnt3a eller DKK1 behandling ville påvirke veksten av PC3 celler. Ved å måle celleproliferasjon ved hjelp av
3H tymidin inkorporering, har vi funnet at behandling av kulturene med Wnt3a resulterte i en betydelig økning i celleproliferasjon (fig. 7A). I motsetning til dette, DKK1 behandling redusert celleproliferasjon på en doseavhengig måte (fig. 7A). Lignende resultater ble også observert i LNCaP celler (data ikke vist).
For å undersøke om Wnt signal påvirker også prostatakreft cellemigrasjon eller cellemotilitet, utførte vi celle migrasjon eksperimenter med PC3 celler. Som vist på fig. 7B, tilsetning av Wnt3a i kulturmediet resulterte i en forbedret antall migrerte celler, mens DKK1 hemmet cellemigrering, sammenlignet med kontrollkulturen. I motsetning til behandling av BPH1 celler i hvilke uttrykk Axin2 var lav eller ikke detekterbar (fig. 6) med DKK1, ingen hemmende virkning på cellemigrering ble observert (data ikke vist). På den annen side, enten trypanblått-farving, eller FACS sortering ved hjelp av annexin 5 immunofarging avslørte ikke økt celledød i de DKK1-behandlede kulturer (data ikke vist). Disse resultatene tyder på at Wnt signalering bidrar til økt celle motilitet, noe som igjen kan bidra til invasivitet og /eller metastasering av prostatakreftceller.
(A) Tritiert thymidin-inkorporering i PC3 kulturer i fravær eller nærvær av Wnt3a eller DKK1. Selv om høy konsentrasjon av Wnt3a (10 nM) forbedret PC3 celleproliferasjon, DKK1 inhibert PC3 proliferasjon på en doseavhengig måte. (B) Regulering av PC3 celle migrasjon av Wnt signalering. Data ble samlet inn fra 6-8 kulturer pr gruppe og er uttrykt som gjennomsnitt + SEM (t-test). Merk at Wnt3a økte antall migrerte celler, mens DKK1 hemmet celle migrasjon.
Diskusjoner
Rolle Wnt signal under prostata utvikling
I denne studien har vi undersøkt hvilken rolle Wnt signalveien i prostata først fra et utviklingsbiologi perspektiv og deretter som en forlengelse, i et tilgrensende patogene prosessen, dvs. tumorigenesis.
ex vivo
postnatal prostata vev kultur eksperimenter ikke bare gir praktisk overvåkning av effekter av vekstfaktorer eller hemmende midler på tidlig prostata utvikling, men også gjør det mulig å gjennomføre eksperimenter selv når tilførselen av reagenser er ganske begrenset. Dette systemet har vært brukt tidligere i å belyse rollen som androgene hormoner, komponenter vev og ulike nye veier i prostata forgrening morphogenesis og tidlig utvikling [17], [18], [28] – [30]
Vi har direkte undersøkt hvilken rolle Wnt signal under prostata utvikling ved å bruke både Wnt signal stimulerende og hemmende faktorer, henholdsvis Wnt3a og DDK1,. Tilsetning av Wnt liganden, Wnt3a, resulterer i økt celleproliferasjon og en reduksjon av luminal epitelcelle-differensiering, mens behandling med Wnt pathway inhibitor, DKK1, forbedret celledifferensiering og redusert celleproliferasjon. Modulering av celleproliferasjon ved Wnt signalering kan tilskrives delvis til endrede nivåer av cyclin B2, som cyklin-molekyler som tidligere er rapportert å spille en rolle i prostata celleformering [31], [32]. Disse dataene sammen tyder på at kravet til Wnt signal i prostata forgrening morphogenesis er tett og delikat regulert som både økt og redusert Wnt aktivitet kan påvirke prostata forgrening morphogenesis i ex vivo kulturer. Videre vår analyse av messenger RNA nivåer av Axin2 og β-galaktosidase uttrykk i BAT-gal transgene mus som indikatorer på Wnt pathway aktivitet i postnatal prostata foreslår også at Wnt veien er mer aktive i å utvikle prostata enn modne prostata.
Association of wnt signal og prostata basal celler hvor stamceller er generelt antas å ligge
Våre funn fra organkulturer av utviklings prostata er forenlig med rollen som wnt signal i vedlikehold av stamceller i andre vev som tarmen [33], brystkjertel [34] og hematopoetiske system [35]. I tillegg korrelasjon av basale celler hvor stamceller er generelt antas å ligge med aktivering av Wnt reaksjonsveien er også observert i løpet av prostata re-vekst etter kastrering og hormonell erstatnings. Epiteliale progenitorceller i prostata er uavhengige av androgen for å overleve. Følgelig har tidligere undersøkelser vist at etter kastrering blir prostata epiteliale progenitor-cellepopulasjonen forbedret eller anriket [30], [36], [37] på grunn av apoptose av androgen-avhengige, terminalt differensiert luminal epitelial cellepopulasjon. Motsatt, når androgen erstattes prostata utløses for å re-vokse til sin opprinnelige størrelse som skyldes økt proliferasjon av progenitorceller og deres påfølgende differensiering til nye luminal celler. Bruke Axin2 som en molekylær indikator, fant vi at Wnt er oppregulert etter kastrering, men er nedregulert etter androgen erstatning, tilsvar pent med innholdet av stamceller i prostata. Ligner dynamisk mønster av Wnt aktivitet ble sett i BAT-gal transgene mus. Undertrykkelse av Wnt signalveien etter hormonerstatning, som antydet med nedregulering av Axin2 mRNA eller redusert antall β-galaktosidase-positive celler kan skyldes en interaksjon mellom β-catenin og AR pathway. β-catenin har vist seg i stand til å interagere med AR og fungerer som en ko-aktivator av AR [38]. Det er mulig at følgende ligandbindende, den aktive formen av AR, i tillegg til sin normale funksjon som en transkripsjonsfaktor for prostata utvikling, også binder og sequesters atom β-catenin, noe som fører til en reduksjon i bassenget av β-catenin tilgjengelig β-catenin-TCF transaktivering [38]. Som et resultat av redusert Wnt signalering, vil prostata progenitorceller så bli indusert til å differensiere til luminal celler. Samlet utgjør disse funnene gir støttende bevis for rollen som Wnt signal i stamcelle vedlikehold i prostata epitel.
Konsekvenser av Wnt signal i prostatakreft cellevekst
Økende bevis tyder på at Wnt Veien kan også bidra til å prostatakreft progresjon [39]. Flere Wnt ligand inkludert Wnt1 og Wnt2 er oppregulert i humane prostata tumorprøver [40], [41]. sFRP3 kan undertrykke prostata svulst celle vekst og invasjon [42]. Dkk3 har nylig blitt vist å bli nedregulert i humane prostata tumorprøver, og DKK1 behandling kan hemme prostata tumorcellevekst [43]. Mer i det siste, er det rapportert at adenokarsinomer dannes i en prostataspesifikt APC sletting musemodell [10]. Vår studie viser at Axin2 er forhøyet i flere menneskelige prostata kreft cellelinjer og xenograft menneskelige prostatakreft sammenlignet med normal menneskelig PREC og ikke-tumorigene udødeliggjort menneskelige prostata epitelceller, som gir ytterligere støtte for en onkogen rolle for Wnt veien aktivering i prostata tumorigenesis. I tillegg er våre opplever at DKK1 behandling hemmer betydelig prostatakreft cellevekst og migrasjon forsterker denne oppfatningen. På grunn av iboende vanskeligheter i forbindelse med produksjon og rensing av en stor mengde av DKK1 som kreves for in vivo xenograft eksperimenter, har den in vivo prostata kreft-xenograft eksperiment ikke blitt utført, men er garantert i fremtiden for å bekrefte den hemmende effekter på DKK1 på prostata tumorvekst og progresjon.
A kreft stamcelle-modellen er nylig blitt foreslått for mange krefttyper. I tilfelle av prostatakreft, kreft stamceller er de som antas å være uavhengig av androgen for å overleve. Gitt det faktum Wnt signalering er viktig for celle-proliferasjon og differensiering i løpet av normal utvikling og er forbundet med de basale celler hvor stamceller er generelt antas å ligge under re-vekst etter kastrering og androgen erstatning, ville det være interessant å bestemme om Wnt pathway er også forbundet med prostatakreft stamceller som kan spille en avgjørende rolle i androgen motstand og sent stadium prostatakreft progresjon.
