Abstract
Fettsyre syntase (FASN) uttrykk er forhøyet i flere kreftformer, og dette over-uttrykket er assosiert med dårlig prognose. Hemmere av FASN som orlistat, viser angivelig antitumor effekt mot kreft som over-express FASN, gjør FASN et lovende terapeutisk mål. Imidlertid har store variasjoner i FASN uttrykk nivåer i enkelte svulster blitt observert, og metoder for å forutsi FASN-rettet behandling utfallet før behandling er nødvendig for å unngå unødvendig behandling. I tillegg hvordan FASN effekten påvirker tumorprogresjon er fortsatt uklart. Her viste vi metoden for å forutsi FASN-rettet behandling utfallet bruker radiomerket acetat opptak og presenterte mekanismer for FASN hemming med menneskelig prostata kreft cellelinjer, for å gi behandling strategi FASN-målrettet terapi. Vi viste at svulsten opptak av radiomerket acetat reflekterte FASN uttrykk nivåer og følsomhet for FASN-rettet behandling med orlistat
in vitro Hotell og
in vivo
. FASN-rettet behandling var merkbart effektiv mot svulster med høy FASN uttrykk, som ble indikert av høy acetat opptak. For å undersøke mekanismer, etablerte vi FASN knockdown prostatakreftceller ved transduksjon av short-hårnål RNA mot FASN og undersøkt hva som kjennetegner ved analyser på morfologi og celle atferd og microarray-baserte genuttrykk profilering. FASN inhibering ikke bare undertrykkes celleproliferasjon men hindret pseudopodia dannelse og undertrykket celleadhesjon, migrering og invasjon. FASN hemning også undertrykkes gener involvert i produksjonen av intracellulære andre messenger arakidonsyre og androgene hormoner, som begge fremmer tumorprogresjon. Samlet våre data viser at opptaket av radiomerket acetate er en nyttig prediktor for FASN-målrettet terapi utfallet. Dette tyder på at [1-
11C] acetat positronemisjonstomografi (PET) kan være et kraftig verktøy for å oppnå personlig FASN-rettet behandling av ikke-invasiv visualisering av svulst acetat opptak og seleksjon av responsive svulster. FASN-målrettet terapi kan være en effektiv behandling for å undertrykke flere trinn knyttet til tumorprogresjon hos prostatakreft valgt av [1-
11C] acetat PET
Citation. Yoshii Y, Furukawa T, Oyama N, Hasegawa Y, Kiyono Y, Nishii R, et al. (2013) Fatty Acid syntase er et sentralt mål i flere Essential Kreft Funksjoner av prostatakreft: Opptak av radiomerket Acetat som en Predictor av målrettet terapi Outcome. PLoS ONE 8 (5): e64570. doi: 10,1371 /journal.pone.0064570
Redaktør: Juri G. Gelovani, Wayne State University, USA
mottatt: 03.02.2013; Godkjent: 15 april 2013; Publisert: 31. mai 2013
Copyright: © 2013 Yoshii et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Grants-i-Aid for Unge Forskere (B) fra Japan Society for Promotion of Science, Japan (JSP) (til YY). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
fettsyre syntase (FASN) er et nøkkelenzym i fettsyresyntese fra acetyl CoA, som uttrykkes ved høye nivåer i lever og fettvev, men i lave nivåer i andre vev i mennesker [1]. FASN er overuttrykt i mange humane kreftformer, inkludert prostata, bryst, lunge, ovarie, blære, mage, munnhulen og melanom, og over-ekspresjon er assosiert med dårlig prognose [2], [3]. FASN er blitt demonstrert å spille en viktig rolle i karsinogenese ved å beskytte celler fra apoptose [2].
I de senere år, inhibitorer av FASN viser velig antitumoraktivitet [4]. Orlistat, en selektiv hemmer av FASN, er en av dem klar for klinisk bruk, spesielt siden orlistat er allerede brukt som en over-the-counter for fedme i USA og EU. Orlistat er rapportert å utøve antitumoraktivitet ved å indusere apoptose i tumorceller [3], [5]. Således er FASN-rettet behandling ventes å være effektiv mot FASN-uttrykkende tumorer. Imidlertid har store variasjoner i FASN ekspresjonsnivåer i enkelte tumorer observert ved patologiske studier [2], [6]. Derfor, når de vurderer bruk av FASN-rettet behandling, metoder for å forutsi terapeutisk utfall i enkelte svulster før behandling for å redusere unødvendig behandling.
For å nærme seg dette kravet, fokuserte vi på opptak av radiomerket acetat i tumorceller. Vi har tidligere rapportert opptak mekanisme av radiomerket acetat inn i tumorceller; cytosol-acetyl-CoA-syntetase, som konverterer acetat til acetyl-CoA, blir over-uttrykt i tumorceller og spiller en rolle ved inkorporering av radiomerket acetat og acetat inkorporert i tumorceller blir hovedsakelig brukt for fettsyresyntese i stedet for nedbrytning til CO
2 via trikarboksylsyre syklus eller aminosyre-syntese [7], [8]. Videre Yun et al. 2009 har også vist at acetyl CoA-syntetase er viktig i [1-
11C] acetat opptak og forbundet med acetat-avhengige fettsyresyntese [9]. Disse bevisene bety at acetat opptak mediert av acetyl CoA-syntetase er assosiert med fettsyresyntese i tumorer. Faktisk er det blitt rapportert at inhibitorer av FASN, inkludert orlistat, kan redusere radiomerkede acetat-inkorporering i fettsyrer i prostatakreftceller [5], [10]. Vāvere et al. har vist at radiomerket acetat opptak er korrelert med FASN uttrykk og [1-
11C] acetat, positronemisjonstomografi (PET), som kan en ikke-invasiv visualisere opptak av acetat, er et nyttig verktøy for å undersøke FASN uttrykk nivåer i xenograft av prostata kreft cellelinjer [10]. Disse studiene indikerer at radiomerket acetat opptak er en god surrogatmarkør for FASN ekspresjon i tumorer. Derfor kan radiomerket acetat opptak være en god prediktor for FASN-målrettet terapi utfall; Imidlertid er det fortsatt uklart om utfallet av FASN-rettet behandling kan forutsies ved opptak av radiomerket acetat. I denne studien undersøkte vi om radiomerket acetat opptak kan forutsi terapeutiske utfallet av FASN-rettet behandling ved hjelp av menneskelige prostata kreft cellelinjer for å demonstrere anvendelsen av [1-
11C] acetat PET som en prediktor for FASN-målrettet terapi utfallet. Så langt i kliniske studier, [1-
11C] acetat PET har blitt brukt for evaluering av ulike typer ondartet svulst [11] – [14]; dermed om forholdet mellom radiomerket acetat opptak og FASN-rettet behandling utfall er bevist, [1-
11C] acetat PET kan raskt brukes til å forutsi FASN-rettet behandling utfallet.
I tillegg mekanismene hvordan FASN effekten påvirker tumorprogresjon er ennå ikke tilstrekkelig ivaretatt, og derfor klarlegging av mekanismene er nødvendig for å forstå betydningen av FASN hemming og oppmuntre utnyttelse av FASN-målrettet terapi. I denne studien å undersøke mekanismer, etablerte vi FASN knockdown prostatakreftceller ved transduksjon av short-hårnål RNA (shRNA) mot FASN, som kan indusere gen-spesifikke stanse, og undersøkt hva som kjennetegner ved analyser på morfologi og celle atferd og microarray- basert genuttrykk profilering. Gjennom disse studiene, diskuterte vi det nye behandlingsstrategi for FASN-rettet behandling i prostatakreft.
Materialer og Metoder
Cell Dyrking
Menneskeprostatakreftcellelinjer, LNCaP ( CRL-1740), PC3 (CRL-1435), 22Rv1 (CRL-2505), og DU145 (HTB-81) ble oppnådd fra American Type Culture Collection. Celler ble inkubert i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 i luft ved 37 ° C. RPMI 1640-medium (Gibco, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum og antibiotika ble anvendt for vekstmedium. Eksponentielt voksende celler ble anvendt for forsøkene. Cellene ble trypsinert, og antallet levedyktige celler ble regnet med trypan blått fargestoff-eksklusjon metoden.
Cell Opptak Study of [
14C 1-] Acetate
In Vitro
Cell opptak av [
14C 1-] acetat i LNCaP, PC3, 22Rv1, og DU145 cellene ble undersøkt. Celler ble sådd ut ved 1 x 10
5 i 1 ml vekstmedium per brønn i 24-brønners plater og preinkubert i 24 timer før opptak studien. Etter preinkubering ble mediet fjernet, og 500 ul vekstmedium inneholdende 37 kBq av [1-
14C] acetat (2,07 GBq /mmol) (GE Healthcare, Pollards, UK) tilsatt til hver brønn, og cellene ble inkubert i 1 time ved 37 ° C. Mediet ble deretter fjernet, og cellene ble vasket to ganger med iskald PBS. De resulterende cellene ble lysert med 500 ul 0,2 N NaOH i 2 timer ved værelsestemperatur, og radioaktiviteten av lysatet og væskescintillator (ACSII; GE Healthcare) blandingen ble målt med en Tri-Carb væske-scintillasjons-teller (PerkinElmer, Wallac, Turku, Finland). Celler ble behandlet på samme måte som før cellelysering ble telt ved bruk av trypan-blått-utelukkelse metode.
Western Blot analyse
FASN ekspresjonsnivåer ble undersøkt ved western blot-analyse. Prøvene ble lysert med lyseringsbuffer inneholdende protease inhibitor cocktail (Sigma, Saint Louis, MO, USA) og proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved Bio-Rad proteinanalysesett (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese ble utført med 20 ug protein i hver prøve ved anvendelse av 4% -15% mini-Protean TGX prefabrikerte geler (Bio-Rad). Kanin anti-FASN primær antistoff (sc-20140, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), kanin anti-β-aktin primær antistoff (IMG-5142A, IMGENEX, San Diego, CA, USA), og geit anti- kanin IgG sekundært antistoff (G21234, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ble brukt. Band ble påvist med ECL Plus Western blotting Detection System (GE Healthcare) og intensitet ble beregnet ved densitometri ved hjelp av Image J programvare (National Institutes of Health).
celleviabilitet etter Orlistat Behandling
Effect av orlistat behandling
in vitro
ble undersøkt med LNCaP, PC3, 22Rv1, og DU145 cellene. Celler ble sådd ut ved 1 x 10
4 i 100 ul vekstmedium per brønn i 96-brønners plater. Etter preinkubering i 24 timer ble mediet erstattet med vekstmedium inneholdende 0 uM, 12,5 uM, 25 uM, 50 uM, 250 uM eller 500 pM orlistat (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA). Konsentrasjonen av orlistat ble besluttet basert på tidligere studier [3], [5]. Orlistat ble oppløst i etanol og tilsatt i vekstmediet til å inneholde mindre enn 0,02% etanol ved slutt. Etter 48 h-inkubering med medium inneholdende orlistat, ble cellenes levedyktighet analysert ved CellTiter-Glo luminiserende cellenes levedyktighet assay (Promega, Fitchburg, WI, USA) i henhold til produsentens protokoll. CellTiter-Glo reagens ble tilsatt direkte til kulturbrønnene, og inkubert i 10 minutter med risting. Luminescence ble spilt inn med en plateleser (SpectraMax M5, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). I løpet av 48-timers inkubasjon med orlistat ble mediet oppdateres i 24 timer etter start av behandling.
Implantasjon av xenotransplantater inn Mus
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr i National Institute of Radiologisk Sciences (Japan). Protokollen ble godkjent av dyreetikk komité i National Institute of Radiologisk Sciences (Japan) (Permit Number: M40-01). NOD.CB17-Prkdc scid /J hannmus (4 uker gamle) ble oppnådd fra Charles River Laboratories (Yokohama, Japan). Før eksperimentene ble musene holdt uforstyrret i minst 1 uke. For
in vivo
studier, vi brukte tre representative cellelinjer i form av FASN uttrykk; LNCaP (høy FASN uttrykk), PC3 (lav FASN uttrykk), eller DU145 (veldig lav FASN uttrykk). For å oppnå xenograft-modeller, tumorceller ved 3 x 10
7 for LNCaP og 1 x 10
7 for PC3 og DU145 ble subkutant injisert inn i mus høyre skulder med matrigel (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA).
In Vivo
biofordeling
for biodistribusjon studie ble mus med xenografttumorer intravenøst injisert med 37 kBq [
14C 1-] acetat i 100 ul saltvann inn i halevenen, og ble avlivet på 10 minutter eller 30 minutter etter injeksjon (4 mus per gruppe). Organer av interesse (tumor, muskel, lunge, lever, milt, bukspyttkjertel, nyre og prostata) og blod ble oppsamlet, og vekten av hvert organ ble målt. Organer ble spaltet i 1 ml Soluene 350 (PerkinElmer) ved 50 ° C i 2 timer. Aliquoter av hydrogenperoksyd (30% vekt /volum), 2 x 100 ul, ble tilsatt sekvensielt til prøvene for å bleke. Scintillation medium (Hionic-Fluor, PerkinElmer) ble tilsatt før telling radioaktiviteten i en Tri-Carb væskesintillasjonsteller (PerkinElmer). Biodistribusjon data ble beregnet som% ID /g (gjennomsnitt ± SD).
Small-Animal PET avbildning med [1-
11C] Acetate
For å bekrefte biodistribusjon av opptak av radiomerket acetat i xenograft modeller, ble små dyr PET avbildning med [1-
11C] acetat utført. [1-
11C] acetat ble syntetisert som tidligere rapportert [15]. Radiokjemisk renhet var 99%. Dynamiske PET skanninger av 60-min varighet (12 × 5 min) ble utført ved hjelp av et lite dyr PET system (Inveon, Siemens Medical Solutions, Malvern, PA, USA). Hver mus ble injisert intravenøst med ca. 18,5 MBq av [1-
11C] acetat via halevenen mindre enn 1,5% isofluran anestesi. Kroppstemperaturen ble opprettholdt av en lampe og varmepumpe under skanningen. Bilder ble rekonstruert ved hjelp av en 3D maksimal a posteriori hjelp Inveon Acquisition arbeidsplassen programvare (Siemens Medical Solutions).
In Vivo
Orlistat Behandling
Terapeutiske effekter av orlistat ble også undersøkt med svulst xenograft mus. Mus med veletablerte tumorer (0,6-0,9 cm lengste diameter) ble randomisert til orlistat-behandlings- og kontrollgrupper (5 dyr /gruppe). Orlistat (240 mg /kg /dag) ble injisert i.p. daglig i 2 uker. Behandlingen dosen ble fastsatt på grunnlag av tidligere studier [3], [5]. Orlistat ble oppløst i 33 ul etanol og fortynnet med 66 pl saltløsning like før injeksjon. Som en kontroll ble ekvivalente mengde hjelpestoff injisert på samme måte. Musene ble veiet, og tumorstørrelsene ble målt ved anvendelse av presisjons calipers 3 ganger ukentlig. Tumor volum ble beregnet ved hjelp av ligning: tumorvolumet = lengde × bredde
2 × π /6
RNA interferens (RNAi) Eksperimenter
I denne studien å undersøke eksakte mekanismene hvordan. FASN effekten påvirker tumorprogresjon, vedtok vi FASN knockdown LNCaP celler etablert av transduksjon av shRNA mot FASN, som kan bringe stabil langsiktig genet spesifikke stanse [16]. FASN knockdown LNCaP celler ble etablert av transduksjon av Mission lentiviral transduksjon partikler (SHCLNV-NM 00410, Sigma) bærer ekspresjonskassetter som koder shRNAs som genererer små interfererende RNA mot FASN, i henhold til produsentens protokoll. Fem kloner av shRNAs mot FASN (TRCN3125, 3126, 3127, 3128 og 3129) ble brukt og cellelinjer transfektert med hver shRNA ble etablert (betegnet FASN-RNAi 3125, 3126, 3127, 3128. og 3129 celler, henholdsvis). Non-targeting shRNA (SHC002V, Sigma) ble brukt som en negativ kontroll (kontroll-RNAi celler). -Celler (1 x 10
4) ble sådd ut i 100 pl vekstmedium per brønn på 96-brønners plater og inkubert over natten. Mediet ble deretter byttet til vekstmedium inneholdende hexadimethrine bromid (Sigma) ved en endelig konsentrasjon på 8 ug /ml for å forbedre effektiviteten transduksjon. Lentiviral partikler (5-50 ul, 0,5-5 infeksjonsmultiplisitet) ble tilsatt, og platene ble inkubert over natten. Deretter valgte vi stabile Transduktantene uttrykker shRNAs med puromycin. Expression nivåer av FASN mRNA ble undersøkt ved QRT-PCR for å kontrollere effektiviteten av knockdown. For QRT-PCR, cellelyse, RNA isolering, revers transkripsjon og real-time PCR ble utført ved bruk av TaqMan genuttrykk Cells-til-CT kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. Genekspresjon ble analysert ved bruk av TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems) for β-aktin (Hs99999903) og FASN (Hs00188012) med StepOne real-time PCR Systems (Applied Biosystems). FASN mRNA ble kvantifisert ved sammenlignende C
T metode med β-actin uttrykk som en endogen kontroll [17].
Cell Proliferation, morfologi, migrasjon og invasjon
Cell atferd var undersøkt med FASN-RNAi 3128 og 3129 og kontroll-RNAi LNCaP celler. For celleproliferasjonsanalyse, ble cellene sådd ut på 96-brønners plater ved 5 x 10
3 celler /100 ul vekstmedium. Etter tidsforløp inkubasjon, ble celleproliferasjon bestemt av CellTiter-Glo lysende analyser. Cellemorfologi ble observert ved bruk av et invertert mikroskop (MDI 4000B, Leica, Solms, Tyskland). Time-lapse bilder ble kjøpt opp hver 2 timer ved 10 × forstørrelse i 5 dager ved hjelp av en motorisert invertert mikroskop (IX 81, Olympus, Tokyo, Japan) er utstyrt med en scene topp inkubator (Tokai Hit, Fujinomiya, Japan) og data ble analysert med Fluoview programvare (Olympus). For migrasjon og invasjon analyser, CytoSelect 96-brønn celle migrasjon og invasjon analyser (Cell Biolabs, San Diego, CA, USA) ble brukt i henhold til produsentens protokoll. Celler ved 4 x 10
4 celler /100 ul i serumfritt medium ble plassert i den øverste vel og 150 ul medium inneholdende 10% føtalt bovint serum ble anbragt i den nedre brønnen, og cellene ble tillatt å migrere eller invadere i 24 timer før analyse. Top (ikke-migrerende eller ikke-invaderende) celler ble fjernet, bunnen (trekkende eller invaderende) celler ble farget med fargestoff løsning og fluorescens ble tatt opp med en plateleser ved 480 nm /520 nm.
DNA microarray analyse
Gene uttrykk profilering ble undersøkt ved DNA microarray analyse med FASN-RNAi 3128 og kontroll-RNAi LNCaP celler. Totalt RNA ble isolert fra celler med et Micro-til-Midi total RNA rensing system (Invitrogen). Integriteten av total RNA ble evaluert ved hjelp av en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Low Input Hurtig Amp Merking Kit, en farge (Agilent Technologies) ble brukt til å forberede Cy3-merket target cRNA i henhold til produsentens instruksjoner. Merkede CRNAs ble hybridisert med en SurePrint G3 Menneskelig GE 8 × 60K Mikromatriser (Agilent Technologies). To separate hybridiseringer ble utført for hver prøve. Array bildene ble tatt med en DNA microarray Scanner (Agilent Technologies), og data ble analysert ved hjelp Feature Extraction programvare (Agilent Technologies) for å få bakgrunnskorrigerte signal intensiteter. Data ble videre analysert med GeneSpring GX programvare (versjon 11.0, Agilent Technologies). Etter datafiltrering, mRNA forskjellig uttrykt i målceller versus kontroller ble vurdert av Fishers eksakte test, etterfulgt av flere korreksjoner ved hjelp av Benjamini og Hochberg falske funnrate (FDR) -metoden. Gensettene med en FDR
q
-verdi 0,05 ble ansett for å være betydelig. DNA microarray data finnes i Gene Expression Omnibus database under sjonsnummer (GSE39183).
Statistical Analysis
Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD.
P
verdier ble beregnet ved variansanalyse (ANOVA) for sammenligning mellom flere behandlingsgruppene. Statistisk analyse av tumorvolumer ble utført ved gjentatt ANOVA, etterfulgt av post-hoc Tukey test.
P
verdier. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
In Vitro
Studier
Vi har undersøkt forholdet mellom opptak av radiomerket acetat, FASN uttrykk, og følsomhet overfor orlistat behandling
in vitro
med LNCaP, PC3, 22Rv1, og DU145 cellelinjer (fig. 1). [1-
14C] acetat opptaket etter 1 time er vist i fig. 1A, øvre. Høyt opptak av [1-
14C] acetat ble observert i LNCaP-celler, mens det i PC3 og 22Rv1 var lavere, og at det i DU145 var meget lav (
P
0,05). FASN uttrykk viste en trend som utfyller det som ble observert i opptaket av [1-
14C] acetat (fig 1A, lavere.): LNCaP celler viste høyere FASN uttrykk i forhold til de andre cellelinjer (
P
0,05) (fig. 1C, øvre).
(A) Opptak av [1-
14C] acetat (øverst) og nivåer av FASN uttrykk (lavere) i LNCaP, PC3, 22Rv1, og DU145 cellene. Gruppene med ulike alfabeter er signifikant forskjellig (
P
0,05). (B) Prosent celleviabilitet etter orlistat behandling i LNCaP, PC3, 22Rv1, og DU145 cellene. Cellelevedyktighet er angitt som en prosentandel av det med 0 uM orlistat behandling. Stjernene viser statistisk signifikans versus behandling med 0 mikrometer for hver cellelinje (*
P
0,05). (C) Forholdet mellom opptaket av [1-
14C] acetat og FASN uttrykk (øvre), forholdet mellom% celleviabilitet etter orlistat behandling på 12,5 mikrometer og opptak av [1-
14C] acetat (i midten), og forholdet mellom% celleviabilitet etter orlistat behandling på 12,5 mikrometer og FASN uttrykk (lavere). Verdier fra seks uavhengige eksperimenter er vist. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD.
Fig. 1B viser% celleviabilitet etter orlistat behandling
in vitro
. Under lav dose av orlistat behandling på 12,5 uM, LNCaP-celler, som hadde vist den høyeste opptaket av [1-
14C] acetat og FASN uttrykk, viste en signifikant reduksjon i% celleviabilitet (
P
0,05;
R
2
= 0,97,
P
0,05) under lavdose orlistat behandling på 12,5 mikrometer (fig 1C, midtre og nedre).. Mens, var det ingen signifikant korrelasjon mellom% celleviabilitet, og opptak av [1-
14C] acetat og FASN uttrykk, henholdsvis under høydose orlistat behandling. Disse dataene viste høyere følsomhet for orlistat behandling i cellene med høyere FASN uttrykk og opptak av acetat.
Biofordeling og [1-
11C] Acetate PET Study med tumorbærende mus
for
in vivo
studier, brukte vi mus med LNCaP (høy FASN uttrykk), PC3 (lav FASN uttrykk), eller DU145 (veldig lav FASN uttrykket) svulster. Nivåer av FASN ekspresjon av hver tumor xenograft ble bekreftet før forsøket, som viste tilsvarende tendens til
in vitro
studien (Fig. S1). Først, for å undersøke absolutt opptak av radiomerket acetat i disse xenografttumorer, utførte vi biodistribusjon studien. Biofordelingen data ble oppnådd ved 10 minutter og 30 minutter etter injeksjon av [
14C 1-] acetat (fig. 2A). Tidspunkter for prøvetaking ble besluttet på grunnlag av en tidligere studie [10]. Biodistribusjon i blodet og normale organer viste et lignende mønster som i tidligere rapporter [18]. [1-
14C] acetat ble fjernet fra blodet i 30 minutter, sammenlignet med 10 min (fig. 2A, til venstre). På 30 min, LNCaP tumorer (0,27 ± 0,05% ID /g) viste 2,2 ganger høyere opptak av [1-
14C] acetat enn PC3 tumorer (0,13 ± 0,01% ID /g;
P
0,01) og 5,5 ganger høyere opptak enn DU145 tumorer (0,06 ± 0,01% ID /g;
P
. 0,001) (figur 2A, høyre). Tumor-til-blod og tumor-til-muskel-forhold på 30 min var også høyere i LNCaP tumorer sammenlignet med PC3 og DU145 tumorer (fig. S2). Neste, små dyr PET med [1-
11C] acetat ble utført for å bekrefte og supplere resultatene fra biodistribusjon studien. Som bildene viste, [
11C 1-] acetat viste klart svulst opphopning i LNCaP xenograft modell, mens moderat eller lav akkumulering av [1-
11C] acetat ble observert i PC3 og DU145 xenograft modell (Fig. 2B ). Derfor biodistribusjon og [1-
11C] acetat PET studier vist at opptak av radiomerket acetat reflekterer FASN uttrykk nivåer og kan skille svulster med høy FASN uttrykk fra svulster med lav FASN uttrykk.
(A) Biofordeling ved 10 min og 30 min i organer (til venstre) og hver tumor (til høyre). Dataene representerer% ID /g, uttrykt som middel ± SD. Gruppene med ulike alfabeter er signifikant forskjellig (
P
0,05). (B) Små dyr PET-bilder av [1-
11C] acetat på 30 minutter etter injeksjonen. Gule piler indikerer svulster. S = magen; L = leveren.
FASN-målrettet terapi
In Vivo
Vi videre undersøkt følsomheten FASN-rettet behandling med orlistat i hver svulst xenograft
i vivo product: (fig. 3). Fig. 3A viser tumorvolummåling. På dag 14 hadde tumorvolumet i LNCaP svulster behandlet med orlistat avtatt betydelig; 22,0 ± 6,2% av opprinnelig tumorvolum. I kontrast, PC3 og DU145 svulster behandlet med orlistat viste en progressiv økning i tumorvolum; 238,8 ± 46,6% og 367,1 ± 99,5% av opprinnelig tumorvolum, respektivt. Fig. 3B viser tumorvolumet i LNCaP, PC3, DU145 og tumorer som ble behandlet med orlistat, som er vist i form av relativt tumorvolum sammenlignet med opprinnelig tumorstørrelse normalisert mot hverandre ubehandlede tumor samtidig punkt; Det var signifikante forskjeller i tumorvekst mellom LNCaP, PC3 og DU145 tumorer (
P
0,05). Effekten av orlistat behandling på kroppsvekt, er vist i fig. 3C. Body vekttap var mindre enn 5% på dag 14. Det var ingen åpenbare endringer i fysisk tilstand (med ingen tegn til rufsete pels eller diaré) over forsøksperioden. Disse dataene viste at opptaket av radiomerket acetat reflekterer følsomheten FASN-rettet behandling med orlistat
in vivo Hotell og FASN-rettet behandling med orlistat er svært effektiv mot svulster med høy FASN uttrykk indikert med høyt opptak av radiomerket acetat.
(A) er veksten av tumorer som ble behandlet med orlistat (240 mg /kg /dag) eller bærer bare daglig i 2 uker (venstre) i tumor xenograft-bærende mus. Dataene representerer tumorvolum (mm
3). Representative bilder av behandlede tumorer på dag 14 (til høyre). (B) Relativ tumorvolumet i forhold til opprinnelig tumorstørrelse normalisert mot hverandre ubehandlet tumor på samme tidspunkt. Gruppene med ulike alfabeter er signifikant forskjellig (
P
0,05). (C) Effekter av orlistat behandling på kroppsvekt.
FASN hemming av RNAi
Neste, for å undersøke mekanismene hvordan FASN hemming påvirker tumorprogresjon, vi vedtatt FASN knockdown LNCaP celler oppnådd av shRNA transduksjon. I denne studien har vi etablert fem FASN-RNAi cellelinjer, FASN-RNAi 3125, 3126, 3127, 3128, og 3129 celler, og QRT-PCR viste en markant nedgang i FASN mRNA uttrykk i FASN-RNAi 3128 celler og en moderat nedgang i FASN-RNAi 3129 celler, sammenlignet med (fig. S3) kontroll-RNAi celler. Western blot analyse viste den samme trenden i FASN-RNAi 3128 og 3129 celler i FASN uttrykk, henholdsvis (fig. 4A, venstre). Knockdown av FASN av RNAi i LNCaP celler førte til en tilsvarende reduksjon i acetate innlemmelse (fig. 4A, høyre).
FASN-RNAi 3128 og 3129 celler og kontroll-RNAi celler ble brukt. (A) Relativ ekspresjon av FASN, analysert ved hjelp av Western blotting-analyse (til venstre) og opptak av [
14C 1-] acetat (til høyre). (B) Celleproliferering over 7 dager (øvre, venstre). Lysmikroskopi bilder (øverst til høyre). Relativ migrasjon og invasjon potensial i FASN-RNAi celler, sammenlignet med kontroll-RNAi celler (nedre, venstre og høyre, henholdsvis). Verdier fra seks uavhengige eksperimenter er vist. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Gruppene med ulike alfabeter er signifikant forskjellig (
P
0,05)..
Interessant, knockdown av FASN induserer observerbare endringer i de biologiske egenskapene til LNCaP celler (fig 4B ). Knockdown av FASN hemmet celleproliferasjon tilsvarer en nedgang i FASN uttrykk (fig 4B, øverst til venstre.); Det var signifikante forskjeller i celleproliferasjon i FASN-RNAi 3128 og 3129 celler, sammenlignet med kontroll-RNAi celler (
P
0,05). Videre mikroskopisk observasjon viste at kontroll-RNAi cellene spindel-formet med pseudopodia på kultur plater, mens FASN-RNAi 3128 celler var rundt med mangelfull dannelse av pseudopodia og FASN-RNAi 3129 celler viste mellom morfologi (fig. 4B, øverst til høyre) . Bevegelsen av cellene på kulturplater ble videre observert ved anvendelse av time-lapse mikroskopi (fig. 5, Video S1, S2 Video). Kontroll-RNAi-celler festet til platen bunn dannede pseudopodia, ble spindel-formet, og aktivt migrerte med celledeling og forlengelsen av deres pseudopodia. Mens FASN-RNAi 3128 celler viste mangel pseudopodia formasjon, ble runde, og cellene deles, men viste mindre migrasjon sammenlignet med kontroll-RNAi celler. FASN-RNAi 3129 celler viste middels atferd (data ikke vist).
Data tyder på bildene i kontroll-RNAi celler (A) og FASN-RNAi 3128 celler (B). Bilder ble tatt hver 6. time i 5 dager. Hvite pilspisser viser et eksempel på dannelsen av pseudopodia, spindel-formet morfologi, og aktiv celle migrasjon i kontroll-RNAi celler. Svart pilspisser viser et eksempel på manglende dannelse av pseudopodia, rund morfologi, og lav aktivitet av cellemigrasjon i FASN-RNAi 3128 celler.
Basert på disse observasjonene, hypotese vi at FASN hemming påvirker migrering og invasjon av celler. For å teste dette, utførte vi celle migrasjon og invasjon analyser med FASN-RNAi og kontroll-RNAi LNCaP celler. Vi fant at FASN-RNAi celler viste mindre migrasjon og invasjon tilsvarende reduksjon i uttrykket av FASN (Fig. 4B, nedre venstre og høyre). Disse observasjonene tyder på at FASN hemming ikke bare undertrykt celleproliferasjon, men også svekket cellulær adhesjon, migrasjon og invasjon.
Gene Expression profil i FASN Knockdown Cells
For ytterligere å forstå effektene av FASN hemming,
