Abstract
Prostatakreft er den nest største årsaken til kreft dødsfall i amerikanske menn. Utvikling og progresjon av klinisk prostatakreft er svært avhengig av androgen signalering. Metastatiske svulster er i utgangspunktet lydhør overfor anti-androgen terapi, men blir resistente mot dette regimet på progresjon. Genomisk og proteomikk studier har implisert en rolle for androgen i å regulere metabolske prosesser i prostatakreft. Men det har ikke vært noen metabolomic profilering studier utført hittil som har undersøkt androgen-regulert biokjemiske prosesser i prostatakreft. Her har vi brukt objektiv metabolomic profilering kombinert med berikelse basert bioteknologi kartlegging for å få innsikt i de biokjemiske forandringer mediert av androgen i prostata kreft cellelinjer. Våre funn tyder på at androgenisering resulterer i heving av aminosyre metabolisme og endring av metylering potensial i prostatakreftceller. Videre metabolske fenotyping studier bekrefter høyere fluks gjennom pathways forbundet med aminosyre metabolisme i prostatakreftceller behandlet med androgen. Disse funnene gir innsikt i de mulige biokjemiske prosesser som reguleres av androgen signalisering i prostatakreft. Klinisk, hvis validert, disse banene kan utnyttes til å utvikle terapeutiske strategier som supplerer dagens androgen ablativ behandlinger mens de observerte androgen-regulert metabolske signaturer kan brukes som biomarkører som forløpere utviklingen av kastrering resistent prostatakreft.
Citation: Putluri N, Shojaie A, Vasu VT, Nalluri S, Vareed SK, Putluri V, et al. (2011) Metabolomic Profilering avslører en rolle for androgen i Aktivering aminosyremetabolisme og Metylering i prostata kreft celler. PLoS ONE 6 (7): e21417. doi: 10,1371 /journal.pone.0021417
Redaktør: Jean-Marc VANACKER, Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, Frankrike
mottatt: 10 desember 2010; Godkjent: 01.06.2011; Publisert: 18.07.2011
Copyright: © 2011 Putluri et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet støttes delvis av National Cancer Institute gir RO1CA133458-04 (AS), en R03 CA139489-01 (AS) og RCA145444A (AS), Doris Duke Foundation og molekylær fenotyping Core og DK089503 (alle til SP). AS er støttet av Georgia Cancer Research Distinguished Scientist award. Prosjektet ble også støttet av Agilent Technologies som tilbys veiledning om metodikk. TS og SF er ansatt med Agilent Technologies. Ingen ekstra ekstern finansiering mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den vanligste solid. organ malignitet diagnostisert hos menn i USA, og er den nest største årsaken til kreft dødsfall i amerikanske menn [1]. Androgen og androgenreseptoren (AR) spiller en viktig rolle i utvikling og progresjon av PCa, og androgen ablasjon er en av de viktigste terapeutiske muligheter for behandling av lokalt fremskreden eller metastatisk PCa [2]. Nesten 90% av alle pasienter med metastatisk prostatakreft i utgangspunktet svare på kastrering-indusert androgen uttak; imidlertid, er denne behandlingen ofte effektivt i mindre enn 2 år, og utvikler seg til en kastrering motstandsdyktig tilstand (kastrering motstandsdyktig prostatakreft, CRPC) deretter. CRPC er en dødelig sykdom. [3]. På tross av sin klinisk resistens mot androgen deprivasjon, uttrykker CRPC AR [4] og oppviser aktiv androgen signalisering gjennom utradisjonelle aktivering av androgen reseptor signaleringsakse [5]. Dette illustreres best ved observasjon av økende nivåer av serum prostata spesifikt antigen (PSA), som er en androgen regulert protein og for tiden brukt som en markør for biokjemisk tilbakefall av tumor, til tross for utviklingen av CRPC [6]. Det er fortsatt diskutert med hensyn til om denne AR-aktivitet i CRPC er mediert av høy-affinitets-reseptorer som er følsomme for lave nivåer av sirkulerende androgener eller, om reseptoren får evnen til å kritikkløst samvirke med andre steroidhormoner [4], [7], [8]. Sistnevnte er støttet av studier som har beskrevet en hyppig mutasjon (T877A) innenfor det hormonbindende domene av AR som gjør den ettergivende for binding av andre steroidhormoner og derved overvinne et spesifikt behov for androgener [9], [10], [11 ]. Viktigere er det imidlertid ingen markører som er tilgjengelige, for å forutsi om svulsten vil utvikle seg til en kastrering resistent tilstand. Således er vesentlig en forståelse av den molekylære endringer som følge av androgen virkning på prostatakreft. Flere grupper har avhørt androgen-regulert endringer på transkriptom og proteom nivåer i PCA cellelinjer, ved hjelp av genuttrykk arrays og massespektrometri [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18]. En slik banebrytende studie med Affymetrix oligonukleotid arrays uthevet foreningen av androgen signalisering i PCA celler med metabolske prosesser knyttet til stressreaksjoner [19]. Videre har androgen-drevet proliferasjon av PCA-celler har vist seg å innebære aktivering av pattedyr-målet for rapamycin (m-TOR) [20], [21], [22], [23] som i seg selv er følsom for metabolske forstyrrelser i tumor [24], [25]. På tross av denne forening, er det begrenset innsikt i de biokjemiske forandringer indusert av androgen virkning på PCA-celler. Ved hjelp av integrerende analyse av matchet genekspresjon og proteomikk data, tidligere vi hadde spådd aktiveringen av aminosyren metabolisme i androgen-behandlet LNCaP (androgen bokstaver) prostatakreftceller [26]. Denne forventningen ble ytterligere styrket ved metabolomic profilering av PCA vev som avslørte aminosyremetabolisme som ett av kjennetegnene for tidlig svulst utvikling [27]. Her benytter vi massespektrometri-baserte profilering av metabolomet androgen behandlet PCA celler, nominere endrede metabolitter, identifisere og validere biokjemiske mekanismer og evaluere hormon forbundet signatur i pasient avledet vev. Våre resultater indikerer androgen-indusert heving av aminosyre metabolisme og endring av metylering potensial i PCA-celler, som begge underbygge våre tidligere funn ved hjelp pasient-avledet lokaliserte metastatiske og PCA vev [27].
Methods
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
prostata cellelinjer (udødeliggjort godartet – RWPE, androgen-ikke-responsive – PC3, DU145 og androgen-responsive – Vcap, og LNCaP) ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC , Manassas, VA). RWPE celler ble dyrket i keratinocytt-SFM media (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) supplert med 5 ng /ml epidermal vekstfaktor (EGF) og 50 ug /ml bovint pitutary ekstrakt (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Vcap celler ble dyrket i DMEM-Glutamax media (Invitrogen Corp., Carlsbad, California) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Hyclon Labs, Thermo Scientific, Rockford, IL) og 1% penicillin-streptomycin (Hyclon Labs, Thermo Scientific , Rockford, IL). DU145 cellene ble dyrket i Minimum Essential Media (MEM) (Invitrogen Corp., Carlsbad, California) supplert med 10% FBS (Hyclon Labs, Thermo Scientific, Rockford, IL), 1% penicillin-streptomycin (Hyclon Labs, Thermo Scientific, Rockford , IL) og 1% HEPES (Hyclon Labs, Thermo Scientific, Rockford, IL). PC3 og LNCaP cellene ble dyrket i RPMI-1640 media (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Hyclon Labs, Thermo Scientific, Rockford, IL) og 1% penicillin-streptomycin (Hyclon Labs , Thermo Scientific, Rockford, IL) .. Alle celler ble holdt ved 37 ° C og 5% CO
2.
androgen (R1881) behandling
Samme antall Vcap cellene belagt og dyrket til 60% konfluens i DMEM-medium Glutamax som beskrevet ovenfor. Mediet ble deretter erstattet i to dager ved fenol-rød fri RPMI-1640 medium supplert med 10% trekull-strippet FBS og 1% penicillin-streptomycin (Hyclon Labs, Thermo Scientific, Rockford, IL). Ett sett med celler ble behandlet med 10 nM syntetisk androgen, methyltrienolone (R1881, Perkin Elmer, Waltham, MA), for enten 24 eller 48 timer, mens kjøretøy-behandlede celler (behandlet med etanol) fungerte som kontroller. Ved slutten av behandlingen, ble cellene, trypsinert, pelletert, vasket med 50 mM fosfatbufret saltvann (PBS, pH 7,4) og lagret ved -140 ° C inntil videre analyse.
Prøvepreparering for masse spectrometry- basert undersøkelse av metabolomet i cellelinjer
massespektrometri-baserte metabolomics profilering ble utført på frosne prostata celle pellets (-10 millioner celler). Prosessen med metabolitten utvinning involvert innføring av ekvimolar blanding av 11 standard-forbindelser oppløst i metanol (Epibrassinolide, [D
3] testosteron, [
15N] Antranilinsyre, Zeatine, Jasmonic syre, Gibberelic syre, [D
4] østron, [
15N] tryptofan, a [D
4] Tymin, [
13C] Kreatinin og [
15N] arginin), fulgt av homogenisering av cellene. Homogenatet ble deretter underkastet ekstraksjon med sekvensiell bruk av vandig (kaldt vann) og organiske (kjølt metanol og kloroform) oppløsningsmidler i det følgende forhold 1:4:3:1 (water:methanol:chloroform:water) [28]. De resulterende ekstraktene ble de-proteinized med en 3 kd molekylær filter (Amicon Ultracel -3K Membran, Millipore Corporation, Billerica, MA) og filtratet som inneholder metabolitter ble tørket under vakuum (Genevac EZ-2
pluss, Gardiner, NY) . Før massespektrometri-analyse, ble det tørkede ekstrakt resuspendert i samme volum av injeksjon oppløsningsmiddel bestående av water:methanol (50:50) med 0,2% eddiksyre og underkastet væskekromatografi (LC) massespektrometri. Som ytterligere kontroller for å overvåke profilering prosessen, en ekvimolar blanding av 11 standard forbindelser (Epibrassinolide, [D
3] testosteron, [
15N] Antranilinsyre, Zeatine, Jasmonic syre, Gibberelic syre, [D
4] østron, (
15N) Tryptofan, [D
4] thymin [
13C] Kreatinin, og [
15N] Arginin) og karakterisert pool av muselever (hentet i tandem med cellelinjer) ble analysert sammen med cellelinjesampler. Hver av disse kontrollene, ble inkludert flere ganger inn i randomisering ordningen slik at prøvene forberedelse og analytisk variasjon kan være konstant overvåket. Videre analyse av hver cellelinje ble etterfulgt av minst to tomme kjøringer, for å hindre enhver overføring av metabolitter mellom prøver. Fig S1 illustrerer reproduserbarheten i profileringen prosessen overvåkes ved hjelp av standard blanding som beskrevet ovenfor. Spesielt CV for hele profilering prosessen måles ved hjelp av fem uavhengige duplikater av muselever ekstraktet nevnt ovenfor var mindre enn 5%.
-væskekromatografi /massespektrometri (LC /MS)
LC /MS delen av objektiv profilering plattformen er basert på en 1200 SL Rapid oppløsning LC og en 6520 Quadrapole Time of Flight (Q-TOF) massespektrometer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Prøvene ble uavhengig undersøkt i både positiv og negativ ionisering modusene ved hjelp av en dobbelt elektrospray ionisering (ESI) kilde. Sanntid masse korreksjon i løpet av massespektrometri ble oppnådd ved tilførsel av en standardblanding av referanse ioner ved hjelp av en uavhengig 1200 SL Rapid oppløsning LC isokratisk pumpe utstyrt med 100:1 splitter for å sende ut en strømningshastighet på 5 ul /min. Denne referansen blanding levert av leverandøren inneholdt ioner med
m /z
121.050873, 922.009798 og 119,03632, 966,000725 for masse korreksjon i den positive (+) og negative (-) ionisering henholdsvis moduser. En masse på mellom 50-1000 m /z ble anvendt for hele objektiv profileringsprosessen. Den datainnsamling under analysen ble kontrollert ved hjelp av Mass Hunter arbeidsstasjons datainnsamling programvare. De som brukes under massespektrometri parametrene omfattet følgende: 1) kilde betingelser: kapillar spenning, 4000 V (negativ modus 3500 V), 2) kilde temperatur var 325 ° C, 3) tørkegass ble anvendt ved 10 l /min 4) , forstøveren trykket ble opprettholdt ved 45 psig (referanse ion forstøveren 10 psig), 5) fragmentor spenning ble innstilt på 140, og 6) skimmer spenningen ble holdt ved 65 V. For hele analysen, ble ultrahøy ren nitrogen anvendt som forstøver og kollisjon gass. For kollisjon indusert dissosiasjon (CID) eksperimenter, ble forløperen ion valgt ved hjelp av kvadrupol analysatoren innstilt på høy oppløsning modus mens produktioner ble analysert ved TOF analysator. De kollisjonsenergier i alle forsøkene ble satt mellom 10-40 eV mindre annet er spesifisert. Spektrene for de analyserte prøvene i denne studien ble registrert under identiske forsøksbetingelser. LC løsningsmidler anvendt under hele studien ble innkjøpt fra Burdick Jackson (Muskegon, MI), og anvendt uten ytterligere rensing.
reversfase (RP) kromatografisk separering på LC-QTOF anvendt en gradient ved anvendelse av vann (løsningsmiddel A) og metanol (MeOH, løsningsmiddel B) ( begge Midlene ble modifisert ved tilsetning av 0,2% eddiksyre). Den binære pumpe Strømningshastigheten var 0,6 ml /min med en første løsningsmiddelblanding av 2% B. Gradienten ble drevet fra 2% B til 98% B over en 13 minutters periode, etterfulgt av 98% B i 6 min og 5 min post (analysen) tid. En kolonne system bestående av en beskyttelseskolonne Zorbax SB-C8 (2,1 x 30 mm, 3,5 um) og analytisk kolonne Zorbax SB-Aq (Agilent Technologies, California) (2,1 x 50 mm, 1,8 um,) ble brukt for å utføre reversfaseseparasjon. Kolonnetemperaturen ble holdt ved 60 ° C i hele den kromatografiske prosessen. Videre ble alle prøvene oppbevart ved 4 ° C før deres masse-spektrometri-baserte metabolomic analyse. Massespektraldataene ble kjøpt i både tyngdepunkt og profilmodi. For å overvåke noen løp å kjøre variasjoner, strømningshastigheten og trykkkurver for hver av LC-forbundet pumper ble samlet inn og lagret.
LC kombinert Triple kvadrupol massespektrometri (Qqq Agilent Technologies, Santa Clara CA) ble brukes for målrettet vurdering av forbindelser ved hjelp av ett enkelt Reaction Monitoring (SRM) strategi. Driftsparametrene for denne massespektrometer inkludert 1) kilde betingelser kapillær spenning på 3000 V og kilde temperatur på 350 ° C, 2) tørkegassen holdes ved 10 l /min, 3) forstøver trykk innstilt på 35 psig og 4) fragmentor spenning sett 70 V. kollisjonsenergier som brukes for fragmentering ble satt til 10-40 eV mindre annet er oppgitt.
det motsatte fasen (RP) kromatografisk separasjon på LC-QQQ ansatt en gradient som inneholder vann (løsemiddel A) og acetonitril (ACN, løsningsmiddel B) (begge oppløsningsmidler ble modifisert ved tilsetning av 0,2% eddiksyre og 0,1% maursyre). Kromatografisk separasjon ble utført på en Zorbax Eclipse XDB-C18-kolonne (Agilent Technologies, CA) (50 x 4,6 mm i.d. .; 1,8 um) holdt ved 37 ° C og en strømningshastighet på 0,2 ml /min. Oppløsningsmidlet ved starten av gradienten var 2% B, som deretter ble gradvis trappet opp til 30% B i løpet av 6,5 minutter, fulgt av en økning til 90% B i løpet av de neste 0,5 minutter, 95% B i ytterligere 5 minutter, og trappet ned til 2% B i en periode på 8 minutter. Dette ble etterfulgt av en etterprøve ekvilibrering i ytterligere 5 minutter. Spesielt, ble kolonnen vasket og overhalt hver 50 injeksjoner
Den vandige normal fase (ANP) kromatografisk separering på LC-QQQ anvendt en gradient inneholdende Acetonitirle (ACN, løsningsmiddel A):. Vann (løsningsmiddel B) med begge løsningsmidler modifisert ved tilsetning av 0,2% eddiksyre og 0,1% maursyre. Strømningshastigheten ble innstilt på 0,4 ml /min. Den innledende Løsningsmidlet var 95% A med en gradient fra 95% A til 90% A i løpet av 3 minutters periode, 90% A-80% A i 2 min, fulgt av 80% A-75% A i 1 min, 75% A -55% A i 2 min, 55% A-40% A i 2 min, 40% A-30% A i 2 min, 30% A-20% A i 2 min, 20% A-95% A i ett min og 95% A i 5 min. Kolonnen ble deretter overhalt tilbake til utgangsbetingelsene. En diamant hydrid-kolonne (MicroSolv Technology, Eatontown, NJ) (4 um, 100A 2,1 x 150 mm) ble holdt i temperaturkontrollerte kammer (37 ° C) og anvendt for forbindelse separasjon. Under saklig og målrettet metabolomic profilering prosessen noen forbindelser er redundant visualisert på tvers av flere plattformer. Med den forståelse at følsomheten og linearitet er vesentlig forskjellig fra grensesnittet til grensesnitt, er disse oppsigelser brukt som en del av kvalitetskontrollen prosessen. Videre streng kvalitetskontroll vedtatt i denne studien involverte en kromatografisk separasjon som hadde mindre enn 0,1 minutt variasjon i oppholdstid over oppdagede forbindelser mellom eksperimenter (figur S1). I tillegg har vi også brukt som intern standard inneholdende ekvimolar blanding av rene forbindelser, så vel som en pool av lever karakterisert prøven for styring av prosess-assosiert variant. Begge disse kontrollene ble gjentatte ganger analysert i tandem med cellelinje prøvene. Også, for å sikre ensartethet i profileringen prosessen, ble alle kolonnene og løsningsmidler kjøpt fra en enkelt produsentens masse ved begynnelsen av disse forsøk.
I tillegg til den ikke-skjev profilering som er beskrevet ovenfor, evaluering av alanin og sarkosin var utføres ved anvendelse av isotopfortynning gasskromatografi-massespektrometri koplet. Her ble resterende vann fjernet fra prøvene ved å danne en azeotrop med 100 pl dimetylformamid (DMF), og tørking av suspensjonen under vakuum. Alle prøvene ble injisert ved hjelp av en på kolonne injektor og en Agilent 6890N gasskromatograf utstyrt med en 15 meter DB-5 kapillærkolonne (indre diameter, 0,2 mm, filmtykkelse, 0,33 mikrometer; J W Scientific Folsom, CA) tilkobles med en Agilent 5975 MSD massedetektor.
t
butyl dimetylsilvll derivater av sarcosine ble kvantifisert ved valgt ion monitorering (SIM), ved hjelp av isotopfortynning elektron-effekt ionisering GC /MS. Nivåene av alanine og sarcosine at eluert ved 3,8 og 4,07 minutter henholdsvis ble kvantifisert ved hjelp av sine respektive forholdet mellom ion av
m Twitter /
z
232 avledet fra mors metabolitt ([Mo-
t
butyl-dimetylsilvll]
-) og ioner av
m Twitter /
z
233 og 235 for henholdsvis alanin og sarkosin, avledet fra isotopically merket deuteriated intern standard [
2 H
3] for sarkosin. Deteksjonsgrensen (signal /støy 10) var ~0.1 picomol for sarcosine hjelp isotopfortynning GC /MS
Metabolomic fenotyping Mikromatriser
Den metabolske fenotyping ble utført ved hjelp av 96-brønners plater som inneholder. ulike metabolitter som eneste nærings underlag. Næringsholdige plater ble hentet fra Biolog Inc (Hayward, CA) og analysen ble utført i henhold til produsentens anvisninger. I alt 88 sukker, 5 nukleotider og 29 aminosyrer ble undersøkt som substrater på to 96-brønners plater, merket M1 og M2 av produsenten. I hovedsak måler analysen utnyttelse av disse metabolittene av de voksende celler som funksjon av NADH fluks som i sin tur målt ved graden av reduksjon av tetrazolium fargestoff. Sistnevnte er kvantifisert ved hjelp av spektrofotometri ved 590 nm, mens en hvilken som helst ikke-spesifikk bakgrunnsaktiviteten måles ved 790 nm. For de metabolske fenotyping studier ble VCap cellene sultet i 96 timer og sådd ut i brønnene i 96-brønns plate ved en densitet på 20.000 celler /brønn. Spesielt, de VCap cellene ble enten behandlet med 10 nM R1881 eller bærer (etanol) på tidspunktet for såing. Cellene ble så tillatt å vokse i 24 timer ved 37 C med 5% CO
2. Etter 24 timers inkubering, ble NADH flux målt ved å overvåke den optiske densitet ved 590 nm ved anvendelse av et spektrofotometer. Samtidig avlesninger ved 790 nm ble også tatt for å vurdere bakgrunnen aktivitet. Den første lesning ble tatt på 24 timer etter androgen tillegg og påfølgende avlesninger ble tatt på 1 t intervaller opp til 30
th time, etterfulgt av ytterligere tre avlesninger på
th 34, 42
nd og 48
th timer post-androgen tillegg. Dataene ble ordnet i et Excel-ark og analysert som beskrevet under statistiske metoder.
Metabolomic biblioteker
Metlin bibliotek (Agilent, Santa Clara, CA) ble brukt til å søke massespektraldataene. Biblioteket ble opprettet ved hjelp av ca 1000 kommersielt tilgjengelige forbindelser som oppholdstid ble definert ved hjelp av RP og ANP kromatografiske metoder beskrevet ovenfor. I tillegg massen og fragment ion informasjon for hver av disse standardforbindelser ble også oppnådd i både positiv og negativ ionisering modi, og som inngår i Metlin biblioteket.
Statistical Analysis
Metabolitter med mer enn 60 % manglende verdier ble fjernet fra analysen. Den metabolske data er igjen sensurert på grunn av terskelverdier for massespektrometer data. For å ta hensyn til forskjeller i missingness mønstre på tvers av ulike klasser, fordeling av andel manglende verdier i androgen responsive (ARD), androgen ikke-responsive (ARI) og godartet (Ben) prøver ble undersøkt og forbindelser med mer enn 85% manglende verdier i hver gruppe- og mindre enn 60% manglende verdier samlet ble ansett for å ha biologisk missingness. Androgen behandlede og kontrollprøver ble behandlet på samme måte. Manglende metabolitt målinger for disse metabolittene ble erstattet (kalkulatorisk) med deteksjonsgrensen (2000). De manglende tiltak i resten av metabolitter ble tilregnet med nærmeste nabo algoritmen med k = 5 ved hjelp av R-pakken pamr. Beregnet data ble deretter log2 forvandlet. Normalisering for Q-TOF data ble gjort ved hjelp quantile normalisering per prøver ved bruk limma R-pakken. Qqq Prøvene ble normalisert ved median sentrering og IQR skalering.
Heatmaps, boksplott og Venn-diagrammer ble trukket ved hjelp av R-pakker gplot, statistikk og limma hhv. Data fra ulike plattformer ble deretter skalert per sammensatte og sammenlignes på tvers prøver. Prøvene for dupliserte forbindelser ble kombinert ved midling over prøvene resulterte fra flere forekomster av samme forbindelser. Hierarkisk clustering ble utført ved hjelp av komplett kobling med Pearsons korrelasjon. En tosidig t-test ble brukt til å vurdere sammenslutning av hver metabolitt med androgen respons status på en to-utvalgs test. De resulterende p-verdier ble deretter justert for multippel testing ved bruk av FDR med q * = 0,2, ved å beregne Q-verdier ved å bruke R-pakken fdrtool [29].
data fra metabolske fenotyping analyser ble først korrigert for bakgrunnssignalet, oppnådd fra målinger av tomme brønner. Dataene ble deretter justert ved å subtrahere middelverdiene av tre negative kontrollbrønner fra alle andre prøver på hvert tidspunkt. Effekten av androgen behandling av prostata-kreft-celler dyrket i aminosyre og sukker platene i forhold til kontrollceller ble sammenlignet ved bruk av varmekart og boksplott. I tillegg gen sett analyse (R-pakke GSA [30]) ble anvendt for å vurdere den generelle anrikning av aminosyre og sukker pathways, i de respektive plater, ved hvert tidspunkt.
Resultat
Metabolomic profilering av prostata-avledet cellelinjer
i et forsøk på å profilere androgen-regulert metabolomet i prostatakreft, brukte vi væskekromatografi kombinert med massespektrometri å avhøre de relative nivåer av metabolitter over prostata-avledet celle linjer (udødelig godartet – RWPE, androgen-ikke-responsive – PC3 og DU145 og androgen-responsive – Vcap, og LNCaP). I tillegg til opptegning prostata cancer-spesifikke (PCA) metabolske profiler, vi også undersøkt metabolske forandringer i androgen-responsive (ARD) vs ikke-responsive celler (ARI), så vel som de som er direkte regulert av androgen i VCap-celler. Som beskrevet i figur 1, den ikke-skjev metabolomic profilering plattform som benyttes i denne studien bestod av både reversfase og vandig normal fasekromatografi kombinert med 1) elektrospray ionisering (ESI) i den positive ion-modus (+) og 2) ESI i det negative ion modus (-). I tillegg ble en målrettet vurdering av 57 forbindelser utføres ved hjelp av enkelt reaksjons Monitoring (SRM) på en trippel kvadrupol massespektrometer som drives i (+) og (-) ion henholdsvis modiene (figur 1). Den cellelinje-avledet massespektrometri profiler ble utsatt for pre-prosessering som er involvert data filtrering, godtgjørelses, logaritmisk transformasjon og normalisering som illustrert i figur 1. De normaliserte data ble deretter avlest for metabolitter som skiller 1) godartet prostata cellelinje (Ben) av prostatakreft-cellelinjer (PCA) 2) androgen responsiv prostatakreftceller (ARD) fra androgen-uavhengige celler (ARI) og 3) androgen-behandlede prostatakreftceller fra ubehandlede kontroller. Videre ble metabolittene som skilte ARD og Ari cellelinjer undersøkt i lokaliserte og metastatisk vev, ved hjelp av de vev-avledede metabolomic profiler som er tidligere publisert av vår gruppe [27]. De klassespesifikke metabolske signaturer ble utsatt for anrikning basert bioteknologi kartlegging fulgt av validerings ved hjelp av in vitro metabolske fenotyping eksperimenter.
illustrasjon av de forskjellige trinn som inngår i metabolomic profilering av prostatacellelinjer. De viktigste trinnene involvert metabolitt utvinning og separasjon, massespektrometri-basert gjenkjenning, spektralanalyse, data normalisering, avgrensning av klassespesifikke metabolitter og endret trasé og deres funksjonelle karakterisering. Variasjonen i utvalget ekstraksjon, separasjon og massespektrometri ble kontrollert ved hjelp av piggete standarder og vurdert ved hjelp av ulike kvalitetskontroll parametre (Figur S1).
Totalt 1553 forbindelser ble påvist på tvers av de seks prostata cellelinjer ved hjelp de forskjellige massespektrometri metoder som brukes i denne undersøkelsen (se ovenfor, figur 2A). Av disse ble 40 forbindelser påvist bare i Ben mens 102 og 55 henholdsvis forbindelser ble sett i ARI og ARD cellelinjer (figur 2B). Spesielt, dette kompendiet inneholdt 72 navngitte metabolitter (Figur 2C). En hierarkisk clustering profil basert på forbindelser med betydelig differensial uttrykk perfekt avtegner de prostatacellelinjer (figur 2D).
A) Varme kart representasjon av hierarkisk clustering av 1,553 metabolitter over 5 prostata cellelinjer. Eksempel klasser er angitt med de fargede feltene [godartet = grønn, androgen ikke-responsive PCa (ARI): gul og androgen responsive PCa (ARD): red bar]. Kolonner representerer individuelle cellelinjer og rader referere til forskjellige metabolitter. Nyanser av gult representerer heving av en metabolitt og nyanser av blått representerer nedgang på en metabolitt i forhold til median metabolitter (se fargeskala). B) Venn-diagram som representerer fordelingen av 1,553 metabolitter målt over godartet (RWPE), ARI (DU145 og PC3) og ARD (LNCaP og Vcap) cellelinjer ved hjelp av væskekromatografi kombinert massespektrometri. C) samme som i (A), men for 72 navngitte forbindelser D) dendrogram representerer hierarkisk clustering av prostata-relaterte cellelinjer som er beskrevet i B, ved hjelp av forbindelser med betydelig differensial uttrykk.
Spesifikke metabolske profiler skille Ben fra PCa og ARD fra ARI
For å avgrense metabolomic endringer mellom Ben og PCA cellelinjer, vi brukte en to-sample
t
-test. Totalt 674/1553 forbindelser var forskjell over disse to klassene etter gjentatt sammenlignings justering på en falsk oppdagelse hastighet (FDR) på 20%. Inkludert i denne listen var 29 navngitte metabolitter hvis relative nivåer er vist i figur 3A. Denne endrede metabolomic signatur i PCA-cellelinjene inneholdt høye nivåer av aminosyrer som sarkosin, treonin, fenylalanin og alanin, så vel som høyere nivåer av forbindelser som er forbundet med nitrogenmetabolisme som kreatin, kreatinin, citrullin og N-acetyl spermin. På den annen side, er nivåene av metabolitter som tilhører tryptofan metabolisme nemlig tryptofan, 1-metyl-tryptofan og kyneuric syre ble redusert i forhold til PCa Ben. Tilsvarende ble 913/1553 forbindelser endret mellom ARI og ARD PCA cellelinjer (figur 3B). Den endrede Listen inneholdt 52 navngitte metabolitter blant hvilke nivåer av spermin, N1-acetylspermine og aminosyrer som serin, treonin, lysin, homocystein, asparagin, alanin, glutaminsyre etc, var forhøyet i ARD (figur 3B). Tvert imot, ble nivåer av S-adenosylmethione (SAM, metylering valuta av cellen) reduseres i ARD-celler med en samtidig økning i nivåene av dets bryte ned produktet, homocystein (figur 3B). Dette tyder på økt metylering aktivitet i prostata kreft og er i tråd med våre tidligere funn om avansert prostatakreft vev [27].
A) Varme kart som viser 29 navngitte differensial metabolitter i prostata kreft celler i forhold til godartet celle linje (
p
0,05, FDR = 20%), avledet ved hjelp av en
t
-test sammen med permutasjoner (
n
= 1000) for å bestemme
p
-verdier for å sammenligne gruppene. Varmen kartet ble generert etter pålogging skalering og quantile normalisering av dataene. Fargevalget er det samme som i fig. 2A. B) samme som i (A), men for 52 navngitte differensial metabolitter mellom ARI (gul strek) og ARD (rød strek) prostatakreftceller. C) Nettverk visning av den molekylære konsept analyse for metabolomic profiler av våre «endret ved PCA cellelinje signatur» (grå node). Hver node representerer en molekyl konsept eller et sett av biologisk relaterte gener. Noden størrelse er proporsjonal med antallet av gener i konseptet. Hver kant representerer en statistisk signifikant berikelse (FDR
q
-verdi 0,2). Beriket begreper som beskriver «amino acid metabolism» er angitt med gule broer.
Integrative Molekylær Concept Modellering av PCA- avledet metabolomet
Ved opptegning av metabolomic mønstre for Ben, ARD og ARI prostata cellelinjer, vi senere fulgt evaluering av disse endringene i sammenheng med biokjemiske mekanismer og avgrensning av endrede biokjemiske prosesser i løpet av prostatakreft utvikling og progresjon holde i sammenheng sitt svar til androgen. For å avgrense den generelle biologiske prosessene som er endret i prostatakreftcellelinjer, så vel som i androgen-responsive prostatakreftceller, ble de klassespesifikke koordinert ekspresjonsprofiler av metabolittene som er beskrevet ovenfor, undersøkt ved hjelp av Oncomine konsept kart (OCM, www.oncomine. org) [31], [32]. Her en «molekyl begrepet «er definert som et sett med molekylære komponenter som er relatert i noen biologisk meningsfull måte. For denne analyse, benyttet vi molekylære konsepter av to generelle typer: (1) genet og protein markeringer fra eksterne databaser, og (2) beregnings-avledede regulatoriske nettverk.
