Abstract
På grunn av sin aggressivitet og mangel på effektive behandlinger, bukspyttkjertel ductal adenokarsinom har en sturen prognose. Nye strategier for å forbedre behandling og overlevelse er derfor presserende behov. Mange fucosylated antigener i sera tjene som tumor markører for kreft deteksjon og evaluering av behandlingseffekt. Økt uttrykk for fucosyltransferases har også blitt rapportert for kreft i bukspyttkjertelen. Disse enzymene akselerere malign transformasjon gjennom fucosylation av sialyserte forløpere, noe som tyder på en avgjørende forutsetning for fucose av kreft i bukspyttkjertelen celler. Med dette i bakhodet, har vi utviklet fucose-bundet nanopartikler som kjøretøy for levering av kreftmedisiner spesifikt til kreftceller. L-fucose-bundet liposomer som inneholder Cy5.5 eller Cisplatin ble effektivt levert inn CA19-9 uttrykker kreft i bukspyttkjertelen celler. Overflødig L-fucose redusert effektivitet Cy5.5 innføringen av L-fucose-bundet liposomer, noe som tyder på L-fucose-reseptor-mediert levering. Intravenøst injiserte L-fucose-bundet liposomer som bærer Cisplatin ble levert til kreft i bukspyttkjertelen celler, medierer effektiv tumorvekst-inhibering, så vel som å forlenge overlevelse hos mus xenograft-modeller. Dette modalitet representerer en ny strategi for kreft i bukspyttkjertelen celle-targeting terapi
Citation. Yoshida M, Takimoto R, Murase K, Sato Y, Hirakawa M, Tamura F et al. (2012) Targeting Anticancer Drug Delivery til kreft i bukspyttkjertelen celler ved hjelp av en Fucose-Bound partikler tilnærming. PLoS ONE syv (7): e39545. doi: 10,1371 /journal.pone.0039545
Redaktør: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center og Beckman Research Institute, USA
mottatt: 15 mars 2012; Godkjent: 22 mai 2012; Publisert: 11.07.2012
Copyright: © 2012 Yoshida et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble delvis støttet av departementet for utdanning, vitenskap, idrett og kultur, Grant-i-Aid for Scientific Research (B), 21390231, 2009, til JK. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom er en av de mest aggressive. maligniteter og har en forferdelig kamp prognose. Det er anslått at bukspyttkjertelkreft dødelighet rangerer åttende i kreftrelaterte dødsfall. Den samlede 5 års overlevelse på bare 1% til 4% er på grunn av den manglende evne til å påvise denne sykdommen på et tidlig stadium, sin aggressivitet, og mangelen på effektive konservativ terapi [1] – [4]. Selv de pasienter som er i stand til å gjennomgå kirurgisk reseksjon for det meste tilbakefall, noe som resulterer i en generelt ugunstig utfall [3]. Selv om nesten 80% av pasienter diagnostisert ved en meget avansert inoperable trinn (IV) behandles med gemcitabin, gemcitabin i kombinasjon med erlotinib, eller FOLFIRINOX, er median overlevelsestid rapportert til å være bare 5,7 måneder, 6,8 måneder og 11,1 måneder, respektivt [1], [5], [6].
en plausibel forklaring på dårlig respons av avansert kreft i bukspyttkjertelen er at systemisk kjemoterapi resulterer i ekstremt ineffektiv levering av anticancermedikamenter til tumoren på grunn av sin hypovascularity [7 ]. I et forsøk på å overvinne dårlig levering av anti-kreft narkotika, har vi utviklet arteriell infusjon kjemoterapi med gemcitabin og 5-fluorouracil for operabel avansert kreft i bukspyttkjertelen etter vaskulær forsyning omfordeling via superselective embolisering [8]. I en fase I /II studien, en samlet svarprosent på 33,3% og en median overlevelse på 22,7 måneder (95% KI, 9,5 til 24,5) ble oppnådd, et bedre resultat enn med intravenøs gemcitabin monoterapi [1]. Men to-års total overlevelse var fortsatt bare 25% på grunn av dårlig kontroll av metastatiske lesjoner [8]. Dette indikerer at enda mer effektiv behandling er nødvendig. Spesifikk levering av kreftmedisiner til kreftceller kan resultere i økt effekt.
Anti-kreft narkotika levering spesifikt til kreftceller er fortsatt en stor utfordring. Flere tilnærminger, for eksempel liposomer, polymerer, polymersome og miceller bærer anti-kreft narkotika, har blitt utnyttet for levering av legemidler til kreftceller, med forventning om passiv målretting gjennom økt gjennomtrengning og oppbevaring (EPR) effekter [9]. Imidlertid har lipid-baserte bærere er rapportert å bli hurtig fjernet fra blodstrømmen av det retikuloendoteliale system (RES) [9]. For å overvinne dette problemet, har kjemisk modifisering av legemiddelbærere med visse syntetiske polymerer vært hyppig benyttet i et forsøk på å øke
in vivo
levetid [10]. Den mest populære og vellykkede modifikasjon er å belegge med polyetylenglykol (PEG) for å oppnå «sterisk stabilisering», som hindrer interaksjonen av blodkomponenter med sin overflate, og reduserer binding av plasmaproteiner, toksisitet immunogenisitet, og akkumulering i RES [11 ], [12]. Et slikt eksempel er doksorubicin i PEG-belagte liposomer (Doxil® og Caelyx®), som er mye brukt i klinisk praksis for å behandle faste tumorer hos pasienter med brystcancer [13]. Imidlertid har siste bevis viser at PEG, som tidligere ble ansett for å være biologisk inert, fortsatt kunne forårsake visse uønskede effekter gjennom aktivering av komplementsystemet [14]. Andre fremgangsmåter ved hjelp av polymerbaserte eller organisk nanopartikler (Abraxan®) brukes klinisk, men disse er begrenset av mangelen på kontrollert legemiddelfrigivelse ved spesifikke seter på grunn av lang levetid i blodstrømmen, noe som fører til uønskede bivirkninger [15].
en annen måte å aktivt målet kreftceller er gjennom bruk av nanocarriers konjugert med molekyler som binder til antigener eller reseptorer på kreftceller [17], [18]; imidlertid hindringer forbli med denne strategi, slik som ikke-spesifikt opptak av RES og ved ikke-målrettede celler [9], [16]. Når for eksempel antistoffer anvendes i sin opprinnelige tilstand for modifisering av nanocarriers, Fc-domenet av et intakt monoklonalt antistoff kan også bindes til Fc-reseptorer på normale celler, slik det skjer med makrofager, noe som fører til økt immnunogenecity og opptak av RES [ ,,,0],19], [20]. Selv om effekten av disse modifikasjoner har vist seg, har skadelige bivirkningene er også observert, sannsynligvis på grunn av ikke-spesifikk binding [21] mellom de målsøkende middel og ikke-target-grupper på celleoverflaten. Dermed er en spesifikk kreftcelle-målsbærer som ikke gjennomgår fangst av RES eller ikke-målrettede områder presserende behov.
Derfor fokuserte vi på de biologiske egenskapene til kreft i bukspyttkjertelen, spesielt fucosylated antigener, for eksempel sialyl Lewis XI (SLX) antigen og karbohydrat antigen-19-9 (CA19-9) som er funnet i sera og tumorvev hos pasienter [22] – [25]. Disse brukes som tumor markører for kreft deteksjon og evaluering av behandlingseffekt. Av flere slike fucosylated antigener, har CA19-9 blitt identifisert som et vidt nyttig tumormarkør for pankreatisk adenokarsinom på grunn av dets hyppige høyde i denne sykdommen (~80%) [26], [27]. Det har også vist seg at den postoperative overlevelse er betydelig verre i bukspyttkjertelen adenokarsinom pasienter som CA19-9 nivåer er mer markert forhøyet [28].
Fucose, en deoxyhexose sukker, spiller en fysiologisk rolle i endring av forskjellige molekyler i pattedyr. For eksempel spiller fucosylation en viktig rolle i blodtypebestemmelse, immunologiske reaksjoner, og signaltransduksjonsveier [29]. Syntese av fucose skjer via to hovedveier [30]; dvs.
de novo Hotell og berging. I det tidligere, BNP-fucose er syntetisert fra GDP-mannose av to enzymatiske reaksjoner. I sistnevnte frie fucose avledet fra ekstracellulære kilder eller lysosomale [31], eller fra kosten kilder (eller kulturmedium
in vitro
) transporteres gjennom plasmamembranen inn i cytosol. Selv om de nøyaktige mekanismer er uklare, har økte nivåer av fukose ofte funnet i sera og urin fra pasienter med cancer, inkludert kreft i bukspyttkjertelen, kolorektal kreft, og magekreft [32] – [34], som tyder på at fucosylation økes i kreft celler.
Forbedret uttrykk for fucosyltransferases (FUTs) har også blitt rapportert i ulike kreftformer. For syntese av CA19-9, FUTs legge til L-fukose i α (1,3) og α (1,4) binding til sialyserte forløpere [35] – [37]. FUTs er viktige enzymer akselerer malign transformasjon gjennom fucosylation forskjellige sialyserte forløpere [32], [35] – [37]. Det har blitt rapportert at økt aktivitet av FUT3 er assosiert med økt metastatisk potensial på pankreas adenokarsinom celler [38], kan noe som tyder på at fucosylation spiller en viktig rolle i sykdomsprogresjon. Disse observasjonene antydet et høyt krav til L-fucose av ulike kreftceller [22], [24].
Med dette i tankene har vi utviklet L-fucose-bundet nanopartikler som kjøretøy for levering av kreftmedisiner spesifikt til disse cellene
via
reseptor-mediert endocytose. Vi modifisert størrelsen på nanopartikler for å tillate gjennomtrengning gjennom de minste kapillære porer innen kreft blodkar, men ikke gjennom blod-hjerne-barrieren, via EPR effekter [16]. Videre, for å hindre ikke-spesifikk trapping av RES, hydrophilization av liposomet overflaten ble foretatt i et forsøk på å forlenge systemisk retensjon og innkapsling av anticancer medikament, Cisplatin. Heri rapporterer vi at intravenøst injisert L-fucose-bundet liposomer som inneholder Cisplatin kan være vellykket leveres til kreft i bukspyttkjertelen celler som uttrykker fucosylated antigener. Dette resulterte i effektiv tumorvekstinhibitering samt forlenget overlevelse i tumorbærende mus.
Resultater
Produksjon og fysiske og kjemiske egenskaper L-fucose-bundet liposomer
aminerte L -fucose ble tverrbundet via 3,3′-ditiobis [sulfosuccinimidylpropionate] (DTSSP) til liposomer fremstilt ved den modifiserte cholat dialyse metode for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 25 ug /ml (F25) eller 50 ug /ml (F50). BS
3 og Tris ble så koblet videre til hydrophilize liposomet overflaten (figur 1 A), noe som kan forhindre opptak av RES i lever og milt, og av makrofager og vaskulære endotelceller, og kan også forhindre adsorpsjon til opsonin proteiner plasma. Følgelig er systemisk retensjon av liposomene forlenget [39]. Undersøkelse ved transmisjonselektronmikroskopi viste at nesten alle L-fucose-bundet liposomer (Fuc-liposomer) ble sfærisk form og, i tilfelle av Cy5.5-innkapsling, var tilnærmet 80-90 nm i størrelse (figur 1 B, C, og tabell S1). Denne partikkelstørrelse stemmer godt overens med målinger foretatt av Zetasizer Nano-S90 (figur 1C). Zeta-potensialet, som representerer den negative elektriske ladning av liposomet overflate, var under -40 mV (figur 1D, og Tabell S1, S2), som er tilstrekkelig for hydrophilized stealth funksjon. Partikkelstørrelsesfordelingen var stabil etter lagring ved 4 ° C i 6 måneder.
(A) Liposom-fremstilling skjema som viser sukkerkjeder. HSA, BS
3, tris, og DTSSP betegne følgende, henholdsvis: humant serumalbumin; bis (sulfosuccinimidyl) suberat; Tris (hydroksymetyl) aminometan; 3,3-ditiobis (sulfosuccinimidylpropionate). (B) Electron mikroskopisk bilde av L-fucose-bundet liposomer. Scale bar viser 50 nm. (C, D) Fysiokjemiske karakterisering av Fuc-liposom-Cy5.5. Gjennomsnittlig partikkelstørrelse (C) og zeta-potensial (D) av liposomer som ble fremstilt i vann ble bestemt ved dynamisk lysspredning spektrofotometri.
Overføring av Fuc-liposom-Cy5.5 og inn i -FAM kreft~~POS=TRUNC celler~~POS=HEADCOMP
i
in vitro
eksperimenter, vurderte vi produksjonen av CA19-9 i kreft i bukspyttkjertelen celler og funnet ut at BxPC-3, ASPC-en, PK59, og HuCCT1 skilles betydelige mengder dette molekylet (figur 2A). Videre flowcytometrisk analyse avslørte også at mengden av membranbundne CA19-9 var høy i celler som utskilte CA19-9 (figur S1). Membranbundet CA19-9 kunne ikke påvises ved ELISA i cellelinjer som ikke skiller CA19-9 (figur S1). Basert på disse resultatene, fordelt vi bukspyttkjertelkreft cellelinjer inn i to grupper i henhold til nivået av CA19-9; dvs. CA19-9 høy produsent og ikke-produsentceller.
(A) Konsentrasjon av CA19-9 utskilt fra forskjellige bukspyttkjertelkreft cellelinjer. Fem millioner celler ble inkubert i serumfritt medium i 48 timer og CA19-9 konsentrasjonen ble målt ved hjelp av ELISA. (B) BxPC-3-celler ble inkubert med Fuc-liposom-FAM i nærvær eller fravær av overskudd av L-fukose i 2 timer, deretter vasket og observert ved konfokal lasermikroskopi. Scale bar, 10 mikrometer. (C) Strømningscytometrisk analyse av Fuc-liposom-Cy5.5-behandlede celler. BxPC-3, PK59, ASPC-en (CA19-9 produsere kreftceller) og PANC-en, PK45H, MIA PACA-2, KP4 (CA19-9 ikke-produserende kreft i bukspyttkjertelen celler) celler ble behandlet med Fuc-Liposome-Cy5 0,5 i 2 timer med eller uten overskudd av L-fukose og ble analysert ved strømningscytometri. Cy5.5 positive celler ble angitt. NT, ingen behandling: F0, F0-Liposom-Cy5.5: F25, F25-Liposom-Cy5.5: F50, F50-Liposom-Cy5.5: F50 + Fuc, overflødig L-Fucose. (D) HuCCT1 (CA19-9 produserende) celler ble inkubert med Fuc-liposom-Cy5.5 for angitte timer i nærvær eller fravær av overskudd av L-fukose, deretter vasket to ganger med fosfat-bufret saltløsning og analysert ved hjelp av strømningscytometri. (E) Effekt av monosakkarider for innføring av Cy5.5 til kreft i bukspyttkjertelen celler av Fuc-liposomer. Flowcytometrisk analyse av Fuc-Liposome-Cy5.5-behandlede celler. Cellene ble behandlet med Fuc-Liposome-Cy5.5 eller liposom-Cy5.5 i 2 timer med eller uten overflødig monosakkarider og ble analysert ved flowcytometri.
Vi deretter undersøkt om CA19-9 produserende kreftceller kan være målrettet bruke disse Fuc-liposomer. Basert på resultatene av preliminære forsøk, tilsatte vi Cy5.5 eller FAM-innkapslet L-fucose-liposomer (Fuc-liposom-Cy5.5, Fuc-liposom-FAM) for å produsere CA19-9 eller ikke-produserende cancerceller for å bekrefte spesifisiteten for levering. Som vist i figur 2B, viste fluorescens mikroskopi at F50-Fuc-liposomer, men ikke F0-Fuc-liposomer effektivt innføres FAM inn i cytosol av BxPC-3. Videre viste flowcytometrisk analyse at F50-Fuc-liposomer, men ikke F0-Fuc-liposomer effektivt innføres Cy5.5 inn i cytosol av BxPC-3 ASPC-1, og PK59 celler som utskilte rikelig CA19-9 innen 2 timer (figur 2C og 2D, figur S2). Overskudd av L-fukose hemmet opptak av Cy5.5 inn i CA19-9 produserende celler, men ingen bemerkelsesverdig forandring i CA19-9 ikke-produserende celler, noe som tyder på L-fukose spesifikk introduksjon. Dessuten er mengden av Cy5.5 overført til kreft i bukspyttkjertelen celler så ut til å øke i direkte forhold til nivået av CA19-9 uttrykket (figur 2C, og fig S2A). Overskudd av L-fukose, men ikke D-glukose, D-mannose, D-xylose eller D-galaktose redusert effektiviteten av denne fremgangsmåte (figur 2E), noe som indikerer at introduksjon av Cy5.5 av Fuc-Liposomer er faktisk L-fukose avhengig .
reseptormediert-opptak av Fuc-Liposome inn i cellene
for å bekrefte L-fucose avhengige opptak av Fuc-Liposome, opptak av
14C-merket L-fucose av ASPC -1 undersøkt. Inkorporering av
14C-merket-L-fukose i ASPC-en ble øket i en tidsavhengig måte, og ble hemmet i nærvær av overskudd av kald L-fukose (Figure3A), noe som tyder på tilstedeværelsen av L-fukose-spesifikk bindende protein. Inhibering av endocytose ved chroloquine førte til undertrykkelse av Cy5.5 opptak i BxPC-3-celler (Figur 3B). Vi så utført en
14C-L-fukose reseptorbindingsanalyse ved hjelp ASPC-1-celler og påvist en høy affinitet L-fucose-spesifikk reseptor (3,25 x 10
6-reseptorer /celle, Kd = 28,74 nM), som indikerer at opptak av L-fucose formidles av sine reseptorer (figur 3C, 3D).
(A) inkorporering av
14C-merket-L-fucose i ASPC-1 celler. Celler ble inkubert i nærvær eller fravær av overskudd av L-fukose (overskudd av kald) i
14C-merket-L-fukose-inneholdende medium for den angitte tid, så
14C-merket-L-fukose inkorporering var målt. (B) BxPC-3-celler ble inkubert med eller uten chroloquine i 24 timer, behandlet med F50-liposom-Cy5.5 i 2 timer ved 37 ° C, og deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri. (C, D)
14C-merket-L-fukose bindingsanalysen ved hjelp av ASPC-1-celler. Scatchard plott analyse viste 3,25 x 10
6-reseptorer /celle, en K
d av 28,74 nM, og en Bmax på 5,49 pmol /10
6 celler. Metoder er beskrevet i
Materialer og metoder
.
Effekt av Fuc-Liposome-Cisplatin på veksten av kreft i bukspyttkjertelen cellelinjer
Vi innkapslet Cisplatin i Fuc -Liposomes. Fuc-Liposom-Cisplatin partiklene var ca 200 nm i størrelse, og den endelige konsentrasjon av cisplatin ble anslått til 2 mg /ml (figur S3 og S3 tabell). Denne størrelsen av nanopartikler bør tillate penetrasjon gjennom de minste kapillære porer innen kreft blodkar av EPJ-effekter, men bør ikke bryte blod-hjerne barrieren [16]. Cytotoksisiteten av Fuc-liposom-Cisplatin ble testet ved bruk av WST-1-analysen (figur 4). Kreft i bukspyttkjertelen celler ble eksponert for Fuc-liposom-Cisplatin eller liposom-Cisplatin i 2 timer og deretter vasket to ganger med fosfat-bufret saltvann for å teste effektiviteten og spesifisiteten av Cisplatin overføring til CA19-9-produserende celler. Fordi vi har observert størst cytotoksisitet ved hjelp av F50-liposom-Cisplatin (50 ug /ml Fuc-liposomer) (figur 4A), valgte vi denne tilstand for de følgende eksperimenter. I CA19-9-produserende celler (BxPC-3, ASPC-1, PK59), F50-liposom-Cisplatin som utøves mer potente effekter enn kontroll liposomer (F0-liposom-cisplatin), noe som indikerer fucose-avhengig cytotoksisitet (figur 4B). I tillegg til virkninger på pankreas adenokarsinom-cellelinjer, veksten av andre kreftformer, slik som gastrisk og CRC cellelinje Colo205, som produserer CA19-9, ble også effektivt undertrykkes ved F50-liposom-Cisplatin, noe som indikerer den potensielle anvendbarheten av denne nanopartikkel-teknologi for behandling av forskjellige typer kreft (data ikke vist). Ingen cytotoksiske effekten av denne agenten ble observert i ikke-CA19-9 produserende celler (MIA PACA-2, PANC-en, PK45H). Dessuten ble ingen cytotoksisitet i normale celler slik som perifere mononukleære blodceller, fibroblaster, humane umbilikalvene endotelceller (HUVEC) eller primære keratinocytter sett, sannsynligvis på grunn av deres lave krav til L-fukose (figur S4). Fordi blodgruppe-antigener er bestemt av mønsteret av glykoproteiner, inkludert molekyler med vedlagte L-fukose grupper molekyler uttrykt på erytrocytt membranen, vi var bekymret for at erytroblast forløpere kan også bli hemmet. Derfor, undersøkte vi CFU-E /BFU-E kolonidannelse av CD34 + celler i nærvær eller fravær av F50-liposom-Cisplatin. Imidlertid kolonidannelse ble ikke hemmet, uavhengig av blodtype av de CD34 + celler testet (figur S5).
(A, B) Celler ble behandlet med Fuc-liposom inneholdende Cisplatin i 2 timer, deretter vasket og inkubert i 72 timer. Levedyktige celler ble målt ved WST analysen.
Administrasjon av D-mannose komplementerer Fordeling av Fuc-liposomer i CA19-9 produserende svulster i et Xenotransplantat Model
Vi neste undersøkt tumor- spesifikk levering av Fuc-liposomer i tumorbærende mus
in vivo
. Det er blitt vist at clearance av L-fukose er forsinket i D-mannose-reseptor-manglende mus [40], i overensstemmelse med tilstedeværelsen av mannose /fucose-reseptorene i leveren og Kupffer-celler [41] – [44]. Videre er mannose-bundet liposomer akkumulert i ikke-parenchymale celler og Kupffer-celler når det ble administrert via halevenen [45]. Basert på disse rapportene, vi samtidig administrering av D-mannose med Fuc-liposomer i tumorbærende mus for å hemme opptaket av L-fukose via den D-mannose-reseptoren. Først ble det undersøkt virkningen av D-mannose på effektiviteten av Fuc-mediert opptak ved hjelp av flow cytometri. Som vist i figur 2, bekreftet vi at Fuc-liposomer effektivt ble innført i BxPC-3-celler
in vitro
selv i nærvær av overskudd av D-mannose. Deretter vi administrert Fuc-liposomer
in vivo
og observert en opphopning av Cy5.5 i tumoren, men reduksjonen i leveren når D-mannose ble administrert før Fuc-liposom-injeksjon (figur 5A og 5B, fig S6 ). Videre akkumulering av Cy5.5 ble bare observert i CA19-9 produserende tumorceller, BxPC-3 og ASPC-1, men ikke i CA19-9 ikke-produserende tumorceller (dvs. MIA PACA-2). Opphopning av Cy5.5 i svulsten ble oppholdt opp til en uke etter Fuc-liposomadministrasjon (data ikke vist) og ingen åpenbare bivirkninger ble observert.
(A) Fuc-liposombundet eller Liposome-Cy5. 5 ble administrert via halevenen (50 ul /mus). Tumor regioner av MIA PACA-2, BxPC-3 og ASPC-1-celler (baksiden av en bilateral flanke lesjon) i mus ble observert og Cy5.5 akkumulering ble kvantifisert ved hjelp av IVIS avbildningssystem ved 96 timer etter injeksjon. D-mannose (1000 gangers av L-fukose) ble injisert samtidig med liposom-injeksjon. (B) Total fluks av svulsten og leveren ble beregnet ved hjelp Leve Bilde programvaren i henhold til produsentens instruksjoner.
Fuc-liposomer Bære Cisplatin tumorveksten og forlenget overlevelse av mus i Xenotransplantat Modell
for å teste effekten av Fuc-Liposome-Cisplatin på tumorvekst
in vivo
, har vi utviklet en bukspyttkjertelen adenokarsinom xenograft modell i mus. Disse dyrene ble behandlet med Fuc-liposom-Cisplatin to ganger i uken. Tumorvekst ble betydelig hemmet ved behandling med F50-Liposome-Cisplatin sammenlignet med ingen behandling, F0-Liposome-Ciplatin, eller cisplatin alene, noe som tyder på at F50-Fuc-Liposome kan levere Cisplatin spesifikt og effektivt (Figur 6A og 6B). I HE-farging av tumorvev ble mange levedyktige celler observert hos ubehandlede mus. Antallet av tumorceller ble redusert i Cisplatin-behandlede og F0-liposom-Cisplatin behandlede-mus sammenlignet med ubehandlede mus. Imidlertid, i mus behandlet med F50-liposom-Cisplatin, tumorceller nesten helt forsvunnet. TUNEL-farging viste nærværet av et større antall apoptotiske celler i tumorer behandlet med F50-liposom-Cisplatin enn i kontrollgruppen (figur 6C), muligens på grunn av mer markert akkumulering av Cisplatin i tumorvevet (figur 6D). Vi testet også effekten av Fuc-Liposome-Cisplatin på overlevelse i en orthotopic og levermetastaser modell
in vivo
hjelp BxPC-3-Luc celler. Som vist i figur 6E, overlevelse av mus behandlet med Fuc-liposom-Cisplatin var signifikant forlenget i forhold til ubehandlede mus, eller i forhold til mus behandlet med cisplatin alene eller F0-liposom-Ciplatin. I ortotopisk modell, tumor-størrelsen hos mus behandlet med cisplatin alene eller F0-liposom-Cisplatin var nesten den samme størrelse, men tumorene hos begge grupper var mindre i forhold til ubehandlet. Omvendt, tumor hos mus behandlet med Fuc-liposom-Cisplatin ble ikke påvist ved
in vivo avbildning
(figur 6F).
(A, B) Sammenligning av tumorveksthemming med cisplatin, F0-Liposom-Cisplatin, og F50-Liposome-Cisplatin i ASPC-en-bærende mus. Cisplatin (2 mg /kg), F0-liposom-cisplatin (2 mg /kg), eller F50-liposom-cisplatin-oppløsning (2 mg /cisplatin /kg) ble injisert via halevenen til ASPC-1-bærende mus to ganger i uke. Ved 4, 8, 11, 15, 18, og 22 dager etter transplantasjon, tumorvolumer ble målt. Representative bilde av mus behandlet med cisplatin (B). Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD (n = 6). * P 0,01 sammenlignet med NT, cisplatin, og F0. (C) svulstvev ble forberedt på dag 22 etter behandling. HE farging (øvre panel) og TUNEL-farging (nedre panel) er presentert. (D) Konsentrasjonen av platina i tumorvevet målt med ICP. (E) Overlevelse av mus behandlet med cisplatin alene, F0-Liposome-Ciplatin, og F50-Liposome-Ciplatin i levermetastaser modellen ved hjelp BxPC-3 celler. Statistisk analyse ble utført ved generalisert Wilcoxon test. * P 0,01 sammenlignet med NT, cisplatin, og F0. (F) Lokalisering av BxPC3-Luc celler i orthotopic modellen påvises ved hjelp av IVIS Imaging System etter 3 ukers behandling.
Ingen bivirkninger, inkludert kroppsvektendringer, kan tilskrives tildelingen av enten D -mannose eller F50-Liposome-Cisplatin ble observert i denne studien (tabell S4).
Diskusjoner
Vi har generert og karakterisert L-fucose-bundet liposomer som inneholder cisplatin, og har vist at Fuc -Liposome-Cisplatin er langt mer effektivt enn Cisplatin alene hemme spredning av CA19-9-produserende kreftceller
in vitro Hotell og tumorvekst
in vivo
. Farmakokinetiske eksperimenter sammen med kvantifisering av Cisplatin i målrettede versus ikke-målrettede leveringssystemer både i
vitro Hotell og
in vivo
ytterligere bekreftet at hemming av tumorvekst skyldes målrettet levering. Dermed vår strategi å utnytte biologiske egenskaper CA19-9 produsere kreft i bukspyttkjertelen celler er lovende med hensyn til spesifikke kreftcelle målgruppe.
Vi endret liposomoverflaten overflaten ved kobling Tris via BS
3, og kryssbinding aminerte L-fucose via DTSSP å oppnå tilstrekkelig stealth og målretting funksjon (figur 1A). Partikkelstørrelsesfordelingen var stabil etter lagring ved 4 ° C i 6 måneder. Våre liposomer er i stand til å bære forskjellige typer legemidler som vanligvis brukes for behandling av kreft, for eksempel doksorubicin, oksaliplatin, og CPT-11 (data ikke vist).
Selv om det har blitt rapportert at den postoperative overlevelsen er betydelig verre i adenokarsinom pasienter som CA19-9 nivåer er markert forhøyet [28], våre resultater indikerte at disse pasientene med bukspyttkjertel kreft uttrykke CA19-9 ville være aktuelle kandidater for behandling med fuc-liposomer bærer kreft narkotika.
Fucose utnyttes for fysiologisk fucosylation av glykoproteiner i mange celletyper, spesielt i leveren via mannose /fucose reseptorer, som er rikelig uttrykt deri [41] – [43]. I preliminære eksperimenter, observerte vi høy akkumulering av Cy5.5 sannsynligvis gjennom ikke-parenchymale celler og Kupffer celler. Likevel, vi lyktes i å opprettholde liposom akkumulering ved å administrere mannose via halevenen, som resulterte i tumor målretting og preklinisk bekreftelse av sikkerheten for potensiell klinisk anvendelse [45].
I
Escherichia coli
, den cellulære opptaket av L-fucose medieres av store tilrettelegger familie proton symporter, FucP [46]. Nylig ble strukturen av L-fucose transportøren identifisert i
E. coli product: [47]. Imidlertid, hos mennesker, er mekanismen av L-fukose cellulært opptak fremdeles kontroversiell, med både diffusjon og det aktive transportsystem foreslått som viktige trasé for opptak av L-fukose inn i cellen [31]. Våre Fuc-liposomer trenge inn i CA19-9-produserende celler i løpet av 10 minutter, og inhiberes av overskudd av L-fukose, hvilket indikerer eksistensen av en transportør eller internalisering system mediert av spesifikke reseptorer på cellene, i stedet for bare en ikke-spesifikk diffusjon system. Faktisk reseptor-bindingsanalyser viste L-fucose-spesifikke høyaffinitets-reseptorer på ASPC-1 celler (figur 3). Imidlertid er ytterligere undersøkelser er nødvendig for å løse dette problemet.
skadevirkninger på hematopoiesis, spesielt på røde blodlegemer, var et stort problem med bruk av fuc-liposomer bærer kreft narkotika, men det var ingen endring i enten kolonidannelse
in vitro
eller benmargssuppresjon
in vivo
under behandlingen. Selv om disse negative effektene vil også trenge å bli vist for ved bruk fuc-liposomer som bærer andre enn Cisplatin anti-kreft narkotika, for eksempel doxorubicin, mistenker vi at, gitt den begrensede krav om normale celler for L-fucose eller dens begrenset levering via normal blodkar, ville EPR effekt og giftighet for tilskuer celler være minimal.
Denne rapporten er den første til å beskrive at målrettet levering av en cytotoksisk legemiddel som en L-fucose nanoconjugate effektivt kan hemme
in vivo
veksten av kreft i bukspyttkjertelen celler. Videre kan de L-fucose nanopartikler som vi utviklet utnyttes som levering kjøretøy for andre kreft narkotika. Denne strategien kan utvides som en generalisert metode for behandling av en rekke andre CA19-9-produserende karsinomer, slik som kolorektal (~80% CA19-9 positiv), galleveier (70~80% positiv), og gastrisk karsinom (20~50% positive) [48], i tillegg til pankreatisk adenokarsinom (~80% positive) [26], [27]. I konklusjonen, bør Fuc-liposomer som inneholder kreft narkotika gi en ny strategi for aktiv målretting kreftbehandling.
Materialer og metoder
Material
Cis-diammineplatinum (II) klorid ( cisplatin), kalium tetrachloroplatinate (II), kaliumjodid, ammoniakk, vandig løsning (28%), sølvnitrat, dipalmitoylfosfatidylcholin (DPPC), kolesterol (Chol), dicetylfosfat (DCP), natrium cholatehydrate (cholsyre), humant serumalbumin ( HSA), natriumperjodat, deuteriumoksyd (D
2o), natrium hexachloroplatinate, tris (hydroksymetyl) aminometan (Tris), og L-fukose ble innkjøpt fra Sigma (St. Louis, MO, USA). Gangliosid ble kjøpt fra Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA). Dipalmitoylphosphatidylethanolamine (DPPE) ble kjøpt fra Alexis (Plymouth Meeting, PA, USA). N-tris (hydroksymetyl) metyl-3-amino-propan sulfonsyre (TAPS) og N- (2-hydroksyetyl) piperazin-N «- (2-etansulfonsyre) syre ble kjøpt fra Chemical Dojin (Kumamoto, Japan). Sodium cyanoborohydrate ble kjøpt fra Aldrich (Milwaukee, WI, USA). Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS
3) og 3,3-ditiobis (sulfosuccinimidylpropionate) (DTSSP) ble kjøpt fra Pierce Biotechnology (Rockford, IL, USA). Kolesterol E-test Wako ble kjøpt fra Wako (Osaka, Japan). Kalium diklorplatina ble kjøpt fra Nacalai Tesque (Kyoto, Japan). Chroloquine ble kjøpt fra Sigma.
Utarbeidelse av Cy5.5, FAM og Cisplatin innkapslet i liposomer
Se Tekst S1 delen.
Cellelinjer
bukspyttkjertelkreft cellelinjer KP4, PK-59, PK-45H, MIA PACA-2, Panc-1, og HuCCT1 ble hentet fra Riken BRC Cell Bank. ASPC-en og BxPC-3 ble kjøpt fra American Type Culture Collection. BxPC-3, ASPC-1, PANC-1, PK-45H, PK-59, og HuCCT1 celler ble dyrket i RPMI 1640 (Gibco) supplementert med 10% FBS, L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin. KP4 og MIA PACA-2 ble dyrket i DMEM (Gibco) supplementert med 10% FBS, L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin.
