Abstract
Bakgrunn
Rollen nøytrofile i tumorbiologi er i stor grad uløst. Nylig, uavhengige studier indikerte enten nøytrofile ekstracellulære feller (nett) eller Tissue Factor (TF) engasjement i kreftbiologi og tilhørende trombose. Imidlertid er deres individuelle eller kombinert rolle i kolon adenokarsinom fortsatt uutforsket.
Metoder
colectomy vevsprøver og variabelt antall drenerende lymfeknuter ble hentet fra ti pasienter med adenokarsinom i tykktarmen. NET deponering og nøytrofile tilstedeværelse samt TF uttrykk ble undersøkt ved farging. Effekten av garn på kreftcellevekst ble undersøkt i
in vitro
co-kulturer av Caco-2 cellelinje og akutt myelogen leukemi primære celler. Spredning og apoptose /nekrose av kreft celler ble analysert ved flowcytometri.
Resultater
TF bærende garn og nøytrofile lokalisering var fremtredende i tumor seksjoner og de respektive metastatiske lymfeknuter. Interessant, neutrofil infiltrering og NET konsentrasjon ble gradvis redusert fra tumormassen til den distale margin.
in vitro
dannede NET hindret veksten av kreftcellekulturer ved å indusere apoptose og /eller hemme spredning.
Konklusjoner
Disse dataene støtter videre rolle nøytrofile og nett i kreft biologi. Vi foreslår også sitt engasjement på kreftcellevekst
Citation. Arelaki S, Arampatzioglou A, Kambas K, Papagoras C, Miltiades P, Angelidou jeg, et al. (2016) Gradient Infiltrasjon av nøytrofile ekstracellulære feller i Colon Cancer og bevis for deres engasjement i Tumor Vekst. PLoS ONE 11 (5): e0154484. doi: 10,1371 /journal.pone.0154484
Redaktør: Nades Palaniyar, The Hospital for Sick Children og The University of Toronto, CANADA
mottatt: 1 mars 2016; Godkjent: 14 april 2016; Publisert: 02.05.2016
Copyright: © 2016 Arelaki et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette prosjektet ble støttet av styret i Universitetssykehuset i Alexandroupolis. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft er en ledende årsak til sykelighet og dødelighet over hele verden, med spredning og kreft-assosiert trombose omfatter de viktigste årsakene til dødsfall hos pasienter med kreft. Det er vel kjent at forholdet mellom kreft og immunsystemet ikke er begrenset bare til overvåking mot stigende monoklonale lidelser, men også mot etablerte ondartede svulster. Samspillet mellom immunsystemet og kreft bestemmer mange aspekter av den kliniske presentasjonen og progresjon av sykdommen [1]. Men selv om nøytrofile generelt utgjør den mest fremtredende inflammatorisk cellepopulasjon, er relativt lite kjent om deres innblanding i humane tumorer. Nyere studier har vist at nøytrofile megle crosstalk mellom kreft og immunsystemet [2,3]. Tumor-infiltrering av neutrofiler har også blitt rapportert å lette metastase, hovedsakelig ved å endre mikromiljøet av den metastatiske lesjoner [4-6]. Videre har neutrofili vært forbundet med en dårligere prognose hos kreftpasienter [7], mens den nøytrofile til lymfocytt-forhold har vært foreslått som en prognostisk faktor i flere typer kreft, for eksempel kolonkreft [8].
Nylig, en viktig mekanisme av nøytrofile granulocytter, nøytrofile ekstracellulære feller (NETS), har omdefinert sin rolle i tumorbiologi [4-6,9-11]. NET er ekstracellulære kromatin strukturer består av cytoplasma, granulat og kjernefysiske komponenter av nøytrofile, først beskrevet som en antimikrobiell respons [12,13]. Men det er økende bevis for den viktige rollen av garn i ikke-smittsomme sykdommer, som trombose [14,15], autoimmune [16], Autoinflammatorisk [17], hjerte- og karsykdommer [15], fibrose [18] og kreft [ ,,,0],11]. Til dags dato har det vært antydet at NET kan handle innenfor primærtumor fremme tumorprogresjon [4,11], mens på eksterne nettsteder kan de beslaglegge sirkulerende kreftceller favoriserer metastase [5,6,19]. I tillegg NET har vært innblandet i kreft-assosiert trombose [9,11].
Videre Tissue factor (TF) hoved
in vivo
initiativtaker til koagulasjon har blitt rapportert å spille en nøkkel rolle i kreft biologi [20,21]). TF-trombin aksen, bortsett fra dens implikasjon i kreft-assosiert trombose, er blitt antydet å ha en meget potent angiogen egenskap via signalisering av dets serinproteaser gjennom pars. Dermed har denne veien vært implisert i neoangiogenesis og kreft metastase [22]. Blant cellene i stand til å uttrykke TF, kreftceller og neutrofiler utgjør kilden for denne prokoagulant og proinflammatorisk middel. Imidlertid har den kombinerte rollen TF og garn i kreft biologi aldri vært tidligere adressert.
I denne studien undersøkte vi tilstedeværelsen av garn i solide svulster og metastatiske lymfeknuter av colon adenokarsinom pasienter og deres
i vitro
virkninger i kulturer av tykktarm kreft celler og primære leukemiceller. Vi viser for første gang at NET er til stede i operasjons eksemplarer av colon adenokarsinom og de respektive metastatisk lymfeknuter og de er også dekorert med TF. Vi rapporterer også at NET kan begrense veksten av kreft celler
in vitro
ved å indusere apoptose og /eller hemme spredning
Materialer og amp.; Metoder
humane prøver
For denne studien, formalinfiksert parafin-embedded kirurgiske vevsprøver fra 10 pasienter som hadde gjennomgått colectomy for adenokarsinom, herunder drenering lymfeknuter, ble undersøkt. Pasient egenskaper er vist i S1 tabell. Snittene ble tatt i rekkefølge per en cm fra sentrum av tumormassen opp til det kirurgiske margin fra hver prøve av colon adenocarcinoma. Videre ble både metastatisk og ikke-metastatisk identifisert lymfeknuter undersøkt.
I tillegg ble 10 friske givere registrert for blodprøver for å isolere polymorfonukleære nøytrofile (PMN).
Skriftlig samtykke ble gitt av alle personer som er involvert i denne studien. Studien protokolldesign var i samsvar med Helsinkideklarasjonen og ble godkjent av etikk Review Board av Universitetssykehuset i Alexandroupolis.
Immunohistochemistry /immunfluorescens
Snittene ble deparaffinized og immunocytokjemisk farging ble utført ved hjelp av et LSAB /HRP kit (DAKO) som tidligere beskrevet [23]. Nøytrofil elastase ble oppdaget med en IgG kanin polyklonale anti-nøytrofil elastase antistoff (1/50 fortynning, Santa Cruz, CA, USA; sc-25621). Seksjonene ble deretter kontra med hematoxylin, dehydrert og montert. Mus monoklonalt IgG1 ble anvendt som negativ kontroll. Prøvene ble visualisert under lysmikroskopi (Nikon, modell Eclipse E400) og bildene ble tatt med et Nikon digitalkamera (ACT-en Nikon-programvaren).
For immunfluorescens, seksjonene ble farget som tidligere beskrevet [24]. Ikke-spesifikke bindingsseter ble blokkert med 2% geiteserum i 2% BSA-PBS. NET ble farget med en kanin anti-citrullinated histon H3 polyklonale antistoff (Abcam, UK, ab5103), en mus anti-NE monoklonalt antistoff (Santa Cruz, sc-55548), en kanin anti-NE poluclonal antistoff (Santa Cruz, SC- 25 621) og et muse anti-myeloperoksidase monoklonalt antistoff (Santa Cruz, sc-52707). For TF deteksjon en IgG1-TF mAb (Sekisui Diagnostics, Lexington, USA, 4508) ble brukt. En geit anti-kanin Alexa Fluor 647 antistoff (Invitrogen, Carlsbad, USA; A21244) og en polyklonale kanin anti-mus Alexa Fluor 488 antistoff (Invitrogen, A11059) ble benyttet som sekundære antistoffer. Seksjoner ble kontra med DAPI, montert og visualisert i en konfokalmikroskopi (Spinning Disk Andor Revolution Confocal System, Irland) i en PLAPON 606O /TIRFM-SP, NA 1,45 og UPLSAPO 100XO, NA 1,4 mål (Olympus, Hamburg, Tyskland).
Cell isolasjon
perifert blod nøytrofile ble isolert fra heparinisert blod fra friske givere som tidligere beskrevet [24]. Primære humane akutt myelogen leukemi (AML) celler ble isolert ved hjelp Biocoll Skille løsning i henhold til produsentens instruksjoner (Biochrom, Berlin, DE) fra perifere blodprøver som stammer fra pasienter ved Universitetssykehuset i Alexandroupolis, Hellas. AML diagnosen ble gjort i henhold til Verdens helseorganisasjon kriterier.
Cell kultur, stimulering og hemming studier
Caco-2 [Caco2] (ATCC
® HTB-37
™) (ATCC, Manassas, USA) celler ble dyrket i 5% CO
2, ved 37 ° C i L-glutamin Eagles Minimum Essential Medium (EMEM; Gibco BRL, New York, USA). AML celler ble dyrket i 5% CO
2, ved 37 ° C, i myelogen Long-Term Kultur Medium (MyeloCult
™ H5100; Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada). Både Caco-2 og AML-celler ble stimulert med 500 ng NET-strukturer isolert fra nøytrofiler som ble behandlet med de ovennevnte midler eller hel PMN forbehandlet med disse midler, i 4 dager. For NET stillas hemming, isolerte NET strukturer ble pre-inkubert med DNase1 (10 U /ml, Fermentas, Vilnius, Litauen) eller heparin (heparin natrium, 100 mikrogram /ml, LEO Pharma A /S, Ballerup, Danmark) i 60 min . For TF-inhibering et IgG1 mus anti-human TF-mAb (10 ug /ml; Sekisui Diagnostics) ble anvendt
Fire bilder tilfeldig tatt fra forskjellige områder i hver brønn med 100 x forstørrelse per forsøk ble analysert.. Gjennomsnittlig areal dekket av celler ble beregnet med Fiji /ImageJ [25].
NET struktur generasjon, isolering og kvantifisering
For å generere NET, 1,5 × 10
6 nøytrofile ble sådd i seks-brønners kulturplater (Corning Incorporated, New York, USA) i lav-serum RPMI-medium (Gibco BRL) som tidligere beskrevet [13] og ble behandlet med sepsis serum [14], isolert fra blodprøver som stammer fra septiske pasienter ved Academic Hospital of Alexandroupolis, Hellas, for 210 min. Nøytrofile ble også inkubert med forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) (40 ng /ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), en generisk induserer NET utgivelsen, for 210 min. Deretter ble mediet fjernet og cellene ble vasket med RPMI. Dessuten, 1 ml RPMI ble tilsatt til hver brønn og garn var oppsamlet etter kraftig omrøring. Mediet ble sentrifugert ved 20xg i 5 minutter og garn var oppsamlet i supernatant fase. Disse konsentrasjoner og tidspunkter var optimal for nøytrofile stimulering ifølge optimalisere eksperimenter. DNA-innholdet ble bestemt ved bruk av Nanodrop.
celleproliferasjon og apoptose
For analyse av celleproliferasjon, Caco-2 og AML-celler ble farget med 5 (6) -carboxyfluorescein diacetat N-succinimidylester (CFSE, Sigma-Aldrich) [26], CD34 APC (klone 8G12, BD Biosciences, New Jersey, USA) og CD45 PerCp (klone 2D1, BD Biosciences) før stimulering. Forsøk ble utført og analysert i timer serie forsøk vurderer som fars populasjonen for sammenligning cellene med høyest CFSE intensitet, i henhold til Landmark publikasjoner [27,28].
For analyse av apoptose /nekrose, Caco-2 og AML celler ble farget med FITC-annexin V (BD Biosciences) og propidiumjodid (PI, Sigma-Aldrich). AML celler ble også farget med CD34 APC (klone 8G12, BD Biosciences).
spredning og apoptose analyse ble utført etter 4 dager med co-kultur med garn i en FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences). Alle data ble analysert med FlowJo V10.
Statistisk analyse
Statistiske analyser ble utført ved hjelp av enveis variansanalyse (ANOVA) med Scheffé test for post hoc sammenligninger. P-verdier mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant. Alle statistiske analyser ble utført med OriginPro 8.
Resultater
NET er tilstede i menneskets tykktarm adenokarsinom og metastatiske lymfeknuter
Siden det har nylig blitt foreslått at NET er innblandet i kreft progresjon og metastasering i murine lunge og brysttumormodeller [4,11], undersøkte vi om de finnes i menneskets tykktarm adenokarsinom og deres respektive metastatiske lymfeknuter.
for å oppnå dette, brukte vi konfokalmikroskopi å undersøke vevsprøver av colectomy for adenokarsinom fra ti pasienter. Vi observerte signifikant avsetning av garn i tumorsnitt, som ekstracellulære colocalization av nøytrofil elastase med citrullinated H3 (fig 1Ai og 1Aii) og nøytrofil elastase med myeloperoksidase (fig 1Aiii) i konfokal mikroskopi, i motsetning til deres fravær i normale tarmen deler av den samme pasienter. Spesielt ble NET lokalisert i nærhet av kreftceller og i stroma (Fig 1Aii), og til og med innenfor kjertel lumen i hoved colonic masse. For å bekrefte vår observasjon i lavere forstørrelse, ble de samme vevsprøver undersøkt for nøytrofil nærvær av nøytrofile elastase immunhistokjemi. Nøytrofile farget med NE, viste lignende lokalisering i svulsten som garn (figur 1B). Ventet, nøytrofile var også synlig med hematoksylin og eosin (H 0,05.
Vi neste undersøkt om NET hemme Caco-2 vekst via apoptose. Således ble Caco-2-celler som ble behandlet med de ovennevnte midler, og vist økte nivåer av apoptotiske og apoptotiske celler sene, som vurdert av Annexin V /PI flowcytometri (figur 4C og 4D). DNase eller heparin dempet denne effekten på apoptose (fig 4C og 4D). Videre apoptoseinduksjon av Nets var konsentrasjonsavhengig (data ikke vist) .Disse data indikerer at NET, uavhengig av NET generer stimulans, fungere som potente hemmere av tykktarm kreft celler vekst
in vitro
ved å indusere apoptose i disse cellene.
NET også hemme akutt myeloid leukemi celler vekst
in vitro
for ytterligere å avklare om dette hemmende rolle garn i kreftcellevekst gjelder bare for tykktarms adenokarsinom eller oppstår med andre typer kreft også, vi undersøkt deres effekter på menneskelig blodkreft kreft. Derfor gjennomførte vi
in vitro
co-kultur eksperimenter av primær AML celler i nærvær av Nets.
I likhet med Caco-2 celler, PMA eller sepsis-indusert garn eller henholdsvis pre-stimulert nøytrofile undertrykte betydelig vekst av AML celler (S2B fig) og indusert apoptose (S2C og S2D fig). I tillegg NET-behandlede AML celler viste en bemerkelsesverdig reduksjon av deres spredning sammenlignet med kontroller, som vurderes av flowcytometri (Fig 5A og 5B). På den annen side, NET kromatin stillas hemmere (DNase eller heparin) avskaffet Nets effekter på både AML celleproliferasjon og apoptose (figur 5A og 5B, S2D figur).
(A), (B) CFSE flowcytometri av AML celler co-kultivert med enten PMA eller sepsis serum-induserte garn i nærvær eller fravær av NET stillas hemmere. (A) Representative spredningsplott. (B) data fra fire uavhengige forsøk presentert som gjennomsnitt ± SD. N.S.-ikke signifikant sammenlignet med kontrollgruppen, * p 0,05.
Disse dataene er tatt sammen med de tidligere funnene tyder på at noten, uavhengig av stimulans, har også en potensielt universell hemmende rolle i primære humane kreftcellekulturer, som ble observert i celler av akutt myeloid leukemi.
Diskusjoner
i denne studien har vi demonstrert for første gang tilstedeværelsen av NET, dekorert med TF, i colon adenokarsinom deler av både primær tumormasse og de respektive metastatiske lymfeknuter . Vi tilbyr også bevis for en potensiell rolle garn for å begrense
in vitro
kreft celle vekst ved å indusere apoptose både i kulturer av Caco-2 og primær AML celler. Videre NET hemmet
in vitro
spredning i AML celler.
I tråd med tidligere rapporter som indikerer tilstedeværelse av garn i kreft biopsier [6,19], viste vi overflod av garn i colon adenokarsinom seksjoner både innenfor primærtumor og i metastatiske lymfeknuter, som ekstracellulære colocalizations av nøytrofile elastase med citrullinated histon H3 eller MPO. Videre observerte vi økt infiltrasjon av nøytrofile i disse delene belyse kilden til disse Nets. Spesielt, NET-generering nøytrofile demonstrert en aggregert mønster, muligens som et resultat av nøytrofile feste på allerede dannet NET og videre generere mer garn. Selv om økt tilstedeværelse av nøytrofiler ble også observert med den standard histokjemisk H E farging av colon adenokarsinom pasientprøver og respektive metastatisk lymfeknute prøver. Piler viser nøytrofile. En representant av ti uavhengige eksperimenter er vist. Original forstørrelse 400x
doi:. 10,1371 /journal.pone.0154484.s001 plakater (TIF)
S2 Fig. NET hemme veksten av kreftceller og indusere apoptose. Product: (A) mai Grünwald-Giemsa farging av Caco-2 celler co-dyrket med PMN forbehandlet med PMA eller sepsis serum. En representant av fire uavhengige eksperimenter er vist. Original Forstørrelse 100x. (B) mai Grünwald-Giemsa farging av AML celler co-kultivert med enten PMA eller sepsis forbehandlet PMN, eller PMA eller sepsis serum-induserte garn i nærvær eller fravær av NET stillas hemmere. En representant av fire uavhengige eksperimenter er vist. Original Forstørrelse 100x. (C) og (D) Annexin V /PI flowcytometri av AML celler co-dyrket med PMA eller sepsis serum-induserte garn i nærvær eller fravær av NET stillas hemmere. (C) viser representative spredningsplott. (D) data fra fire uavhengige forsøk presentert som gjennomsnitt ± SD. N.S.-ikke signifikant sammenlignet med kontrollgruppen, * p 0,05
doi:. 10,1371 /journal.pone.0154484.s002 plakater (TIF)
S1 Table. Kliniske karakteristika for pasienter med tykktarmskreft
doi:. 10,1371 /journal.pone.0154484.s003 plakater (DOC)
