Abstract
Bakgrunn
Vi har vurdert nytten av den doble PI3K /mTOR-hemmer NVP-BEZ235 (BEZ235) som monoterapi terapi og i kombinasjon med konvensjonell kjemoterapi for skjoldbruskkjertelkreft.
metodikk /hovedfunnene
Åtte cellelinjer fra fire typer skjoldbruskkjertelen (papillær, follikulær, anaplastic, medullær ) ble studert. Cytotoksisiteten av BEZ235 og fem konvensjonelle kjemoterapeutiske midler alene og i kombinasjon ble målt ved anvendelse av LDH-analyse. Kvantitativ western blot vurderes ekspresjon av proteiner forbundet med cellesyklus, apoptose og signalveier. Cellesyklusfordeling, og apoptose ble målt ved strømningscytometri. Murine flanke anaplastiske skjoldbrusk kreft (ATC) ble behandlet med oral BEZ235 daglig. Vi fant at BEZ235 effektivt hemmet celleproliferasjon av alle kreft linjer, med ATC oppviser størst følsomhet. BEZ235 konsekvent inaktivert signaliserer nedstrøms mTORC1. BEZ235 vanligvis indusert cellesyklus-stans ved G0 /G1 fase, og også forårsaket apoptose i de mest sensitive cellelinjer. Baseline nivåer av p-S6 ribosomalt protein (Ser235 /236) og p27 korrelert med BEZ235 følsomhet. Vekst av 8505C ATC xenografttumorer ble hemmet med BEZ235, uten noen observert toksisitet. Kombinasjonsbehandling av BEZ235 og paclitaxel konsekvent vist synergistisk effekt overfor ATC
in vitro
.
Konklusjoner
BEZ235 som et enkelt terapeutisk middel hemmer skjoldbruskkjertelkreft spredning og har synergistiske effekter i kombinasjon med paclitaxel ved behandling av ATC. Disse funnene oppmuntre fremtidige kliniske forsøk med BEZ235 for pasienter med denne dødelige sykdommen
Citation. Lin SF, Huang YY, Lin JD, Chou TC, Hsueh C, Wong RJ (2012) Utility av et PI3K /mTOR-hemmer (NVP-BEZ235) for Thyroid kreftbehandling. PLoS ONE 7 (10): e46726. doi: 10,1371 /journal.pone.0046726
Redaktør: Guillermo Velasco, Complutense University, Spania
mottatt: 21 april 2012; Godkjent: 06.09.2012; Publisert: 15 oktober 2012
Copyright: © Lin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Science Council of Taiwan, Kina (NSC 98-2314-B-182A-012 -MY3) (https://web1.nsc.gov.tw/) og delvis med tilskudd fra Chang Gung Memorial Hospital og Chang Gung University (CMRPG370581, CMRPG370582, CMRPG370583, CMRPG3A0161) (https://www.cgmh.org.tw/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Thyroid kreft er den vanligste endokrine malignitet, som stammer fra skjoldbruskkjertelen follikulære celler (papillær, follicular, dårlig differensiert og anaplastisk kreft) eller parafollicular C celler (medullær kreft). Forekomsten av skjoldbruskkjertelkreft har økt de siste 3 tiår, hovedsakelig en økning i deteksjon av papillær kreft. I motsetning til forekomsten av follikkelutvikling og dårlig differensiert skjoldbruskkjertelkreft er uendret [1], [2]. De fleste pasienter med godt differensiert kreft, inkludert papillær (PTC) og follikulær (FTC) i skjoldbruskkjertelen har en gunstig prognose. Likevel, ca 5% av pasientene utvikler radioaktivt jod ildfaste svulster og vanligvis føre til døden i løpet av 5 år [3]. Anaplastisk skjoldbruskkjertelkreft (ATC) er en sjelden, svært aggressive, og ofte dødelig sykdom, med en median overlevelse på bare seks måneder. Medullær skjoldbruskkjertelkreft (MTC) står for 3-5% av skjoldbrusk kreft. Hyppigheten av regional og fjernt metastatisk sykdom i MTC reduserer overlevelse [4], [5]. Nye behandlingsformer for ildfaste og aggressiv skjoldbruskkjertelkreft er nødvendig for å forbedre tiden dårlig utfall for disse pasientene.
PI3K /mTOR veien er viktig for celle metabolisme, overlevelse og spredning. Klasse I
A PI3Ks er heterodimerer inneholder en P85 regulatoriske og en p110 katalytisk underenheter som fosforylerer phosphatidylinositol-4,5-hydrogenfosfat (PIP
2), noe som ga phosphatidylinositol-3,4,5-trifosfat (PIP
3). PIP
3 kombinerer med phosphoinositide-avhengig protein kinase 1 (PDK1) til å fosforylere AKT på Thr308. I tillegg blir fosforyleringen av AKT ved Ser 473 ved mTORC2 nødvendig for full aktivitet av AKT. Aktivering av AKT fosforylerer mTORC1, som senere fosforylerer S6 kinase1 og 4E-BP1, som fører til G1 /S cellesyklusprogresjon og inhibering av apoptose. PTEN er en tumor suppressor som dephosphorylates PIP
3 og inaktiverer denne veien [6], [7]. Endringer i denne signalveien ofte forekommer i maligniteter og er potensielle mål for kreftbehandling [6] -. [8]
I skjoldbruskkjertelkreft, genetiske endringer som påvirker PI3K /mTOR vei har blitt identifisert.
PIK3CA plakater (koding p110α av klasse I
En PI3K) eksemplar nummer gevinst korrelerer med økt
PIK3CA
protein uttrykk.
PIK3CA
kopiere nummer gevinst oppstår oftere enn genetiske mutasjoner av
PIK3CA
eller
PTEN
i skjoldbruskkjertelkreft [9] – [14]. Mer
PIK3CA /akt1
mutasjoner og
PIK3CA
kopier vinning er identifisert i ATC sammenlignet med godt differensiert kreft, noe som tyder på at PI3K /mTOR sti aktivitet er involvert i prosessen med kreft de-differensiering [ ,,,0],3], [11], [12]. For MTC,
RET
proto-onkogen mutasjoner forekommer i nesten alle kjente tilfeller (25% av MTC) og omtrent halvparten av sporadisk MTC. Denne gevinsten-of-funksjon omorganisering forbedrer PI3K /mTOR signaloverføring [15], [16]. I sporadisk MTC uten
RET
mutasjoner, over 50% av tumorprøver viser aktivering av AKT eller mTOR ved immunhistokjemi [16].
BEZ235 er en dual PI3K /mTOR-hemmer som reduserer PI3K og mTOR kinase-aktivitet ved konkurrerende binding til ATP-bindende kløft av disse enzymene [17]. BEZ235 kan behandle kreft gjennom induksjon av G0 /G1 cellesyklus og apoptose, og har nylig inngått fase II kliniske studier [17] – [22]. Denne studien ble utført for å evaluere effekten av BEZ235 i behandling av skjoldbruskkjertelkreft fra fire store patologiske typer, inkludert PTC, FTC, ATC og MTC. Vi utforsket også kombinasjonseffekter av BEZ235 og tiden ansatt kjemoterapeutika mot fire ATC cellelinjer.
Resultater
Cytotoksisitet av BEZ235
BEZ235 hemmet celledeling i alle skjoldbrusk kreft linjer i en dose og tidsavhengig måte (figur 1A). En lav dose av BEZ235 på 6,25 nmol /L hindres minst 30% av celleveksten i 6 av 8-cellelinjer på dag 4. BEZ235 på 100 nmol /L arrestert mer enn 80% cellevekst i ATC linjer, 78% i medullær ( TT) og mer enn 74% i godt differensiert skjoldbrusk kreft linjer. Den Dm av BEZ235 på dag 4, ble beregnet for hver cellelinje (figur 1B). De 4 ATC linjene var mest følsomme overfor BEZ235 (Dm, KAT4C = 3,9, KAT18 = 6,6, 8305C = 6,7, 8505C = 9,3 nmol /L), etterfulgt av follikulær udifferensierte kreft FRO81-2 (Dm, 10,6 nmol /L) . Den medullær thyroid kreft (TT), er godt differensiert papillær (BHP7-13), og den follikulære (WRO82-1) kreft var mindre følsom (Dm 17,1, 17,2, og 43,1 nmol /L, henholdsvis).
a, dose-responskurver ble oppnådd daglig fra celler behandlet med et utvalg av seks 1:01 fortynninger av BEZ235. B, ble det Dm av BEZ235 på dag 4 beregnet ved bruk CompuSyn programvare for hver cellelinje. ATC cellelinjer (KAT4C, KAT18, 8305C og 8505C) hadde lavest Dm og dermed mest følsomme, følger av follikulær udifferensiert skjoldbruskkjertelkreft (FRO81-2), medullær (TT) og godt differensiert papillær (BHP7-13) og follikulær ( WRO82-1) kreft.
Modulation av signalveier av BEZ235
effektene av BEZ235 på signalveier ble undersøkt i 8505C, TT og BHP7-13 cellelinjer (figur 2, Figur S1). p-4E-BP1 (Thr70), p-4E-BP1 (Thr37 /46) og p-S6 ribosomalt protein (Ser235 /236) ble alle gående trykt av BEZ235 løpet av 2 timer og inhiberingen effekt var betydelig og holdbar, med mindre enn 12% av proteinet detektert etter 24 timer. p-ERK1 /2 (Thr 202 /Tyr204) ble aktivert ved BEZ235 med 2.6 til 8.6 ganger økning i 2 til 8 timer i tre cellelinjer. Imidlertid BEZ235 hadde heterogene effekter på p-AKT (Thr308) og p-AKT (Ser473), som kunne bli inhibert i en periode på TT og BHP7-13, men ble vedvarende økning i 8505C. Som i 8505C celler, i KAT4C celler BEZ235 på lignende måte inhiberte p-S6 ribosomalt protein (Ser235 /236), men aktivert p-AKT (Thr308), p-AKT (Ser473) og p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), ( Figur S1 og S2A). Den immunoblot ble kvantifisert og ble utført statistisk analyse for p-4E-BP1 (Thr37 /46) i BHP7-13 og p-S6 ribosomalt protein (Ser235 /236) i 8505C og BHP7-13. BEZ235 dypt inhiberte disse proteiner med 2 til 4 timer, og denne effekten var holdbar i 24 timer (Figur S1). p-4E-BP1 (Thr37 /46) ble undertrykt til mindre enn 12% fra 2 til 24 timer og oppnådde statistisk signifikans sammenlignet med basalnivå i BHP7-13 (P 0,02, t-test). Tilsvarende, p-S6 ribosomalt protein (Ser235 /236) ble betydelig redusert til mindre enn 7% og 13% fra 4 til 24 timer i 8505C (P 0,01, t-test) og BHP7-13 (P 0.02, t- test), respektivt. Disse resultatene antyder at BEZ235 har en sterk evne til å hemme mTORC1 (som fører til reduksjon av p-4E-BP1 og p-S6 ribosomalt protein) og svakere effekter på mTORC2 (som fører til varierende effekter på p-AKT ved Ser473).
p-AKT (Thr308) og p-AKT (Ser473) ble økt i 8505C i mer enn 24 timer. p-AKT (Thr308) og p-AKT (Ser473) ble redusert forbigående i TT og BHP7-13. p-4E-BP1 (Thr70), p-4E-BP1 (Thr37 /46) og p-S6 ribosomalt protein (Ser235 /236) ble gående redusert fra 2 timer ved over 24 timer i tre cellelinjer. BEZ235 forårsaket en rask økning av p- ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) med 2 til 4 timer i tre cellelinjer.
Effekter av BEZ235 på cellesyklus og apoptose
KAT4C , 8505C, TT, BHP7-13 og WRO82-1 ble utsatt for BEZ235 i 24 eller 72 timer (figur 3A). Sammenlignet med ubehandlede kontrollceller, BEZ235 ved 6,25, 25 og 100 nmol /L indusert økende cellefraksjoner ved G0 /G1phase i alle cellelinjer. En representativ cellelinje BHP7-13 demonstreres virkningen av BEZ235 på cellesyklusfordeling (Figur 3B).
A, analyse av cellesyklus ved måling av DNA-innhold viste økende doser av BEZ235 samles cellene ved G0 /G1 etter 24 timer (KAT4C, 8505C, BHP7-13 og WRO82-1) og 72 timer (TT). B, en representant cellelinje, BHP7-13 viste cellesyklus arrest i G0 /G1 fase. C, cellesyklusregulerende proteiner ble evaluert ved hjelp av immunoblot i celler behandlet med BEZ235 ved 100 nmol /L. p53 ble redusert med 2 til 4 timer i 8505C og TT. BEZ235 gradvis redusert p21 i TT og BHP7-13. p27 ble økt i alle cellelinjer. Cyclin D1 gradvis redusert i 8505C og BHP7-13. D, apoptose målt ved flow-cytometri for å måle sub-G1-celler viste at BEZ235 øker andeler av sub-G1-celler i KAT4C og KAT18 i 96 timer. E, immunoblot viste BEZ235 indusert nedbrytning av bøddel caspase-3 i KAT4C og KAT18.
Effektene av BEZ235 (100 nmol /L) på uttrykket av G0 /G1 relaterte cellesyklusproteiner ble undersøkt ( Figur 3C, fig S2B og S3). Overgangen av G0 /G1 til S-fasen er en kompleks prosess som involverer cykliner, cyklin-avhengige kinaser (CDK) og assosierte proteiner, inkludert p53, p21, p27 og cyklin D1 [31]. p53 er en tumor suppressor som kan aktivere p21, og både p21 og p27 er hemmere av G1 cyclin-avhengige kinaser.
BEZ235 økt p27 med 4 til 24 timer i alle cellelinjer, med maksimal økning på 3,5 til 723,2 – fold i KAT4C, TT og BHP7-13. Et slikt forhold på økningen var ikke målbar i 8505C grunn av målbart signal i ubehandlede celler. Statistisk analyse ble utført for p27-ekspresjon i TT, og oppnådde betydning 8 timer sammenlignet med basal ekspresjon (P = 0,019, t-test) (figur S3C). Denne informasjonen er i samsvar med våre funn av G0 /G1 cellesyklus arrest. BEZ235 hadde varierende virkninger på ekspresjonen av p53, p21 og cyklin D1 i 4 cellelinjer, som viser at det kan være varierende bidrag til disse proteinene for å påvirke cellesyklusprogresjon. En konsekvent økning av p27 i BEZ235 behandlede celler sannsynlig utøves hemmende effekt på cellesyklusprogresjon på G0 /G1. Det er mulig at G0 /G1 cellesyklus-stans er et resultat av en kombinert effekt på mer enn en G0 /G1 relatert protein påvirkes av BEZ235. Alternativt kan den induksjon av p27 alene være tilstrekkelig til å stanse cellesyklusprogresjon. I et p53 negativ PC3M cellelinje, BEZ235 indusert p27 ekspresjon og fullstendig cellesyklus-stans ved G1 fase, uten å indusere p21 [17]. Denne studien demonstrerte G1 cellesyklus hemming indusert ved BEZ235 ikke nødvendig kreve tilknytning til p53 og p21.
hemning av PI3K /mTOR-reaksjonsveien kan også føre til apoptose [6], [8]. Evnen til BEZ235 å forårsake apoptotisk celledød i skjoldbrusk kreft celler ble undersøkt (Figur 3D). Sammenlignet med kontroll, BEZ235 ved 25 og 100 nmol /L betydelig apoptose målt som andel av sub-G1-celler i 96 timer i KAT4C. Lignende funn ble observert i KAT18, med BEZ235 på 6,25, 25 og 100 nmol /L kjører en økende andel av apoptotiske celler. Men BEZ235 klarte ikke å vise noen økning av sub-G1 celler i 8505C, TT, BHP7-13, og WRO82-1.
For å validere induksjon av apoptose i KAT4C og KAT18 av BEZ235, caspase-3 var vurdert ved immunoblot etter 72 timers behandling (figur 3E, fig S4). Generelt er høyere doser av BEZ235 indusert mer degradering av apoptotisk skarp caspase-3, med mindre enn 12% av caspase-3 detektert ved 100 nmol /L i begge cellelinjer. Disse dataene antyder at apoptotiske mekanismer står for cytotoksisitet av BEZ235 i KAT4C og KAT18. Disse funn er i overensstemmelse med tidligere rapporter om BEZ235 forårsaker apoptose i noen, men ikke alle, cellelinjer [17] – [22] .De underliggende mekanismene for de ulike evner BEZ235 å indusere apoptose i forskjellige doser og i forskjellige cellelinjer forblir uklar [6] -. [8]
BEZ235 følsomhet korrelerer med baseline uttrykk for p-S6 ribosomalt protein (Ser235 /236) og p27
Dm av BEZ235 spenner over et bredt spekter over 8 forskjellige cellelinjer, med en 11-fold forskjell mellom KAT4C og WRO82-1.To utforske potensielle biomarkører som korrelerer med følsomhet på BEZ235, grunnlinjen uttrykket av proteiner som er involvert i PI3K /mTOR og RAS /RAF /ERK stier, og celle cycle- assosierte proteiner ble evaluert i 6 cellelinjer (figur 4A). Følsomheten av de seks cellelinjer til BEZ235 ble pålagt i henhold til den Dm verdi.
A, er utgangsnivået av proteiner forbundet med signaleringsoverføring og cellesyklus ble evaluert ved immunoblott. Sekvensen av proteiner som er lastet var ifølge Dm. Uttrykket av p-S6 ribosomalt protein (Ser235 /236) gradvis redusert fra KAT4C til BHP7-13, mens p-27 viste motsatt rekkefølge. Ekspresjonen av de andre proteiner viste en tilfeldig fordeling. B, Band tettheter ble fotografert og kvantifisert. Relasjoner mellom Dm og protein uttrykk ble analysert ved hjelp av Pearsons korrelasjonskoeffisienter, og grafer ble tegnet med KAT4C. Uttrykket av p-S6 ribosomalt protein (Ser235 /236) hadde en positiv sammenheng, og p27 en invers korrelasjon, med følsomhet for BEZ235.
uttrykk for p-S6 ribosomalt protein (Ser235 /236 ) gradvis avtar over økende Dm, mens nivået av p-27 øker gradvis økende over Dm. Statistiske sammenhenger ble analysert ved hjelp av Pearsons korrelasjonskoeffisient (figur 4B). Ekspresjonen av p-S6 ribosomalt protein (Ser235 /236) hadde en signifikant korrelasjon (R «sup> 2 = 0,8475, P = 0,009) med BEZ235 følsomhet, mens p27 hadde en betydelig invers korrelasjon (R» sup> 2 = 0,8117, P = 0,014). En gjentatt immunoblot av p27 viste konsistente resultater (vedlegg S1). Ekspresjonen av basis p-AKT (Thr308), p-AKT (Ser473), p-4E-BP1 (Thr70), p-4E-BP1 (Thr37 /46), p-S6 ribosomalt protein (Ser240 /244), s -ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), p53, p21 og cyclin D1 ikke klarte å avdekke eventuelle sammenhenger med BEZ235 følsomhet
BEZ235 terapi (data ikke vist). murine flanke svulster
atymiske nakne mus med flanke xenografter av 8505C ble brukt til å studere den terapeutiske effekten og sikkerheten til BEZ235
in vivo
. Dyr med etablerte tumorer flanke av tilsvarende utgangsvolumet ble behandlet med oral BEZ235 (50 mg /kg) eller bærer daglig i 25 dager og fulgt inntil dag 31 (figur 5A). BEZ235 forsinket tumorvekst og forskjellen av tumorvolum mellom BEZ235 og kontrollmusene var statistisk signifikant på dag 21 (94.1 ± 26.4 mm
3 og 335,1 ± 78,5 mm
3, P = 0,009, t-test) og dag 24 (109,9 ± 29,6 mm
3 og 403.1 ± 112,8 mm
3, P = 0,019, t-test). Forskjellen av tumorvolum mistet betydning på dag 28, 4 dager etter behandlingen var seponert (402.7 ± 123,6 mm
3 og 750,3 ± 198,3 mm
3, P = 0,15, t-test). Representative mus ble fotografert på den siste dagen av behandlingen (figur 5B).
En daglig oralt inntak av BEZ235 (50 mg /kg) undertrykker 8505C tumorvekst. Forskjellene i tumorvolumet mellom BEZ235 og kontrollgruppen oppnådde statistisk signifikans på dager 21 og 24. Betydningen ble tapt på dag 28, 4 dager etter behandlingen var seponert. B, representative mus med 8505C xenografttumorer (piler) ble fotografert på siste dag av behandling (dag 24). C, BEZ235 ikke resulterte i noen vekttap, i behandlede og kontrollmusene (P 0,05 for begge sammenlignings). D, undertrykker BEZ235 p-AKT (Thr308) og p-S6 ribosomalt protein (Ser235 /236) av 2 timer og caspase-3 av 4 timer in vivo. PCNA ble noe redusert ved tidlig periode. E, ekspresjon av p-S6 ribosomalt protein i tumorceller blir detektert ved farging ved de angitte perioder (forstørrelse x 200). Disse resultatene var i samsvar med Western blot resultater.
BEZ235 ikke redusere kroppsvekt mellom de to gruppene i løpet av studieperioden (figur 5C). Oral BEZ235 redusert fosforylering av AKT og S6 ribosomalt protein ved 2 timer og oppnådde dens største inhibitoriske effekter ved 4 timer med bare 2% og 10% av pakt og PS6 gjenværende, respektivt. Denne hemmende virkning varte i 24 timer i xenograft tumorer (figur 5D, Figur S5). PCNA ble svakt og forbigående fortrengt fra 2 til 4 timer. Imidlertid signifikant degradering av caspase-3 oppsto ved 4 timer, med bare 4% av caspase-3 gjenværende av 24 timer. Immunhistokjemi p-S6 ribosomalt protein (Ser235 /236) i tumorer behandlet med BEZ235 tilsvar viste en reduksjon i farge, mest markant fra 2 til 6 timer (figur 5E).
Interaksjon av BEZ235 og kjemoterapi i celler ATC
Vi studerte kombinasjonen av kjemoterapeutika og BEZ235 mot ATC. Fem kjemoterapeutiske midler (paclitaxel, irinotecan, etoposid, 5-FU og doxorubicin) viste cytotoksiske effekter i en dose- og tidsavhengig måte i fire ATC cellelinjer (figur S6). Dataene ble anvendt for å beregne median effektiv dose (Dm) på dag 4 ved anvendelse av CompuSyn programvare (figur 6A).
A, ble Dm beregnet ved hjelp av cytotoksiske data ved hjelp CompuSyn programvare for hvert medikament på hver cellelinje ved dag 4. B, den cytotoksiske effekten av BEZ235 og kjemoterapeutika (paclitaxel, irinotecan og etoposid) alene eller i kombinasjon etter en 4-dagers behandling i ATC ble evaluert ved hjelp av LDH analyser. Kombinasjonen av BEZ235 og paclitaxel viste synergieffekter i alle cellelinjer. Kombinasjonen av BEZ235 og irinotecan hadde forbedret cytotoksiske effekter ved høyere doser, men viste begrenset eller ingen gode terapeutiske effekter ved lavere doser. Kombinasjonen av BEZ235 pluss etoposid vises lite tilleggs cytotoksisitet. C, CI av BEZ235 og hver kjemoterapeutisk middel ble beregnet ved hjelp CompuSyn programvare. BEZ235 pluss paklitaxel utstilt synergieffekter i alle cellelinjer, med CI 0,8 på de fleste forhold. BEZ235 pluss irinotecan hadde synergistisk til antagonistiske effekter i 8305C, 8505C og KAT18, og antagonistiske effekter i KAT4C. BEZ235 pluss etoposid viste stort sett antagonistisk effekt i alle cellelinjer. De horisontale stiplede linjer på CI = 1 ble trukket for diskriminering av synergi (CI 1) og antagonisme (CI 1). D, de typiske områder for DRI-verdier for kjemoterapeutika i kombinasjon med BEZ235. Med tilstedeværelse av BEZ235, paclitaxel hadde stort sett de største DRIs i 8505C, KAT4C og KAT18, og viste også gunstige DRIs i 8305C.
Disse Dm av paclitaxel, irinotecan og etoposid er oppnåelig i pasientenes serum , og er klinisk relevant [32] – [34]. Selv om doxorubicin benyttes klinisk for anaplastisk thyroid kreft, den forholdsvis høye Dm i disse cellelinjer forstått at klinisk relevant dosering er ikke oppnåelig i pasienter serum og derfor er utelukket fra disse studiene. Interaksjoner mellom BEZ235 og paclitaxel, irinotecan, og etoposid ble evaluert (Figur 6B). Kombinasjonen av BEZ235 og paclitaxel betydelig forbedret cytotoksisitet enn monoterapi behandling i fire cellelinjer. BEZ235 kombinert med irinotecan også forbedret terapeutisk effekt, spesielt når flere celler ble berørt. BEZ235 pluss etoposid bare litt økt cytotoksisitet.
Interaksjoner mellom BEZ235 og hver kjemoterapeutisk middel ble bestemt ved å beregne CI ved Chou-Talalay ligning (figur 6C). Synergieffekter ble identifisert for kombinasjonen av BEZ235 og paclitaxel i alle ATC linjer (CI, 8305C = 0,77 til 0,86, 8505C = 0,43 til 0,59, KAT4C = 0,66 til 0,81 og KAT18 = 0,64 til 0,71).
kombinasjonen av BEZ235 med irinotecan varierte fra synergistisk å antagonist i 8305C, 8505C og KAT18 (CI, 0,86 til 1,34, 0,97 til 1,23 og 0,74 til 1,14) og var antagonist i KAT4C (CI, 1,09 til 1,36). Kombinasjonen av BEZ235 med etoposid var litt synergistisk å antagonist i 8305C (CI, 0,95-1,15) og antagonist i 8505C, KAT4C og KAT18 (CI, 1.16 til 1.17, 01.13 til 02.05 og 01.05 til 01.19, henholdsvis).
Disse resultatene viser at BEZ235 og paclitaxel hadde beste kombinerte effekter i behandlingen av ATC. Den beregnede DRI av kjemoterapi midlet betyr fold av legemiddeldose som kunne bli redusert i nærvær av BEZ235 (figur 6D). Blant tre kjemoterapeutika, paclitaxel hadde de største DRIs i 8505C (2.55-4.2), KAT4C (02.25 til 03.19) og KAT18 (2,59 til 2,63), og viste også gunstige DRIs i 8305C (1,55 til 2,16).
diskusjon
BEZ235 effektivt hemmet celledeling i åtte skjoldbrusk kreft linjer som stammer fra fire store histologiske typer. ATC var den mest følsomme, etterfulgt av follikulær udifferensiert, medullær og godt differensiert skjoldbruskkjertelkreft cellelinjer. Kreftceller skjuler en PI3K gevinst-of-funksjon mutasjon eller en
PTEN
sletting demonstrere høyere PI3K /mTOR pathway aktivitet og økt følsomhet for BEZ235 [22]. Våre data tyder på at ATC er avhengig av PI3K /mTOR-aktivitet, og avbrudd av denne veien med BEZ235 svekker ATC vekst mer betydelig enn andre skjoldbrusk kreft histologier. De relativt lave mediane doser av effekt BEZ235 i alle de thyroid kreft linjene ( 44 nmol /L) tyder på at BEZ235 kan være anvendelige for behandling av et spekter av thyroid kreft. Ildfaste kreftformer som utvikler aktivering av PI3K /mTOR signalisering i ferd med tumor de-differensiering kan være spesielt attraktive mål for terapi.
svikt i BEZ235 å undertrykke p-AKT (Ser473) på 8505C og KAT4C kan bli i forbindelse med en negativ feedback hemming. Det er tidligere blitt vist at inhibering av mTORC1 fører til inaktivering av S6 kinase 1, som deretter overvelder den hemmende effekten av BEZ235 på mTORC2, aktiverer mTORC2, og øker p-AKT (Ser473) i 8505C [35]. Tidligere rapporter viste også at lavere doser av BEZ235 klarer å hemme p-AKT (Ser473) i enkelte cellelinjer, og høyere doser av BEZ235 kan overvinne den negative tilbakemeldinger fra mTORC1 /S6 kinase en feedback loop [18], [20]. Selv om p-AKT (Ser473) ble aktivert i 8505C og KAT4C, BEZ235 hadde bedre hemmende effekter i disse cellelinjer i forhold til TT og BHP7-13, noe som tyder på at andre molekyler som er berørt av BEZ235 spille en viktigere rolle i å bestemme terapeutisk utfall.
Vi fant at uttrykket av p-S6 ribosomalt protein (Ser235 /236) og p27 korrelerer med følsomheten til BEZ235 i skjoldbruskkjertelen. S6 ribosomalt protein er et nedstrøms S6-kinase 1, som aktiveres ved mTORC1 [6] – [8]. Fosforylering av S6 ribosomalt protein øker translasjonelle kontroll av proteinsyntese og forbedrer cellevekst. Celler med høyere nivåer av p-S6 ribosomalt protein (Ser235 /236) er mer utsatt for BEZ235, noe som tyder på at inhibering av mTORC1 og S6 ribosomalt protein er den viktigste terapeutiske effekten av BEZ235.
p-S6 ribosomalt protein (Ser235 /236) har også nylig blitt anerkjent som en markør for å forutsi terapeutiske effekten av en mTOR-hemmer i sarkom [36]. I denne studien, thyroid kreft linjer med høyere uttrykk for p-S6 ribosomalt protein (Ser235 /236) viste også lavere nivåer av p27. Dette funnet antyder S6 ribosomal protein er en suppressor av p27 i skjoldbruskkjertelen, og kan forklare hvorfor både p-S6 ribosomalt protein (Ser235 /236) og p27 var prediktorer for følsomhet for BEZ235. Interessant, p27 var tidligere kjent for å ha en omvendt sammenheng med aktiviteten til PI3K /mTOR-reaksjonsveien i skjoldbruskkjertelen kreftceller, og represjon av denne veien øker p27 [37].
4E-BP1 er et annet protein nedstrøms mTORC1. Hemming av mTORC1 fører til defosforylering (aktivering) av 4E-BP1, styrke bindingen av 4E-BP1to eIF4E, og blokkerer proteintranslasjon og celleproliferasjon [7], [8]. Selv BEZ235 påvirker både S6 ribosomal protein og 4E-BP1 effektivt, spår bare p-S6 ribosomalt protein (Ser235 /236) uttrykk for følsomhet for BEZ235 i denne studien. I eggstokk-kreft, ble biomarkører forutsi følsomheten av BEZ235 rapportert [22], og ekspresjon av p-4E-BP1 (Thr37 /46) ble korrelert med følsomheten til BEZ235.
I tillegg til inhibering av cellesyklusprogresjon , BEZ235 forårsaket apoptose i to av seks cellelinjer. Inhibering av cellesyklusprogresjon er en kjent effekt av BEZ235, selv ved lavere doser (≤100 nmol /L). Det ser imidlertid ut apoptose i bare noen kreftcellelinjer, og er mer tydelig ved høyere doser (100-1000 nmol /L) av BEZ235 [17] – [22]. BEZ235 effektivt hemmet mTORC1, et molekyl å kontrollere både cellesyklus og apoptose som kan føre til cellesyklus og apoptose i KAT4C og KAT18 [7]. Forstå mekanismene gjennom hvilke BEZ235 bidrar til apoptotisk celledød vil kreve videre studier.
ATC er uten tvil den mest aggressive av de fire store histologiske typer skjoldbruskkjertelkreft. Kjemoterapi har blitt brukt til å behandle pasienter med ATC med responsrater rundt 20 til 50%. Nye strategier for å forbedre resultatene er nødvendig. Blant tre kombinasjonsterapiregimer, BEZ235 kombinert med paclitaxel hadde den beste synergistisk effekt i fire ATC cellelinjer. Kreftceller med aktivering av PI3K /mTOR signal er mer motstandsdyktig mot paclitaxel, og samtidig administrering av PI3K /mTOR-hemmere med paclitaxel forbedrer terapeutiske effekter [38] – [40]. Dette funnet er klinisk relevant, siden paclitaxel, en microtubule stabilisator, har vist å oppnå en 53% svarprosent hos pasienter med ATC i en fase II klinisk studie [41]. Kombinasjonen av BEZ235 med en microtubule depolymerisering av medikament vinkristin avslørte også lovende virkning ved behandling av sarkom [20]. Våre data viste at kombinatoriske virkningene av BEZ235 med inhibitorer av DNA topoisomerase type I (irinotekan) eller type II (etoposid) ved behandling ATC var i stor grad antagonistisk. Lignende antagonistiske effekter av hemming både topoisomerase aktivitet og PI3K /AKT veien er observert i eggstokkreft celler [42]. Celler i S-fasen er mer utsatt for topoisomearse inhibitorer. BEZ235-indusert opphopning av celler i G0 /G1 fasen kan derfor redusere den terapeutiske fordelen av samtidig behandling med topoisomerase-hemmere, forklarer ugunstig kombinasjon effekter av BEZ235 med irinotecan og etoposid.
Daglig behandling av BEZ235 betydelig forsinket 8505C xenograft tumorvekst i løpet av den terapeutiske perioden. Den inhibitoriske effekt var mindre fremtredende etter avsluttet behandling, noe som tyder på at langvarig behandling kan være nødvendig for å opprettholde terapeutisk effekt. BEZ235 betydelig redusert caspase-3 i 8505C xenografttumorer, indikerer denne forbindelsen kan indusere apoptose
in vivo
. Etter seponering av BEZ235, senere økt volumet av 8505C xenografttumorer. Denne utvidelsen av svulst etter avsluttet behandling kan skyldes normalisering av cellestørrelse og gjenopptakelse av celleproliferasjon, som mTOR og nedstrøms proteiner S6 Kinase 1 og 4E-BP1 spille sentrale roller i denne sammenheng [43]. Ingen signifikant vekttap eller sykdom ble observert i løpet av studieperioden, noe som tyder på at denne behandlingen kan ha en lovende sikkerhetsprofil.
En tidligere rapport viser at nærværet av genetiske endringer av
PTEN
,
PIK3CA Hotell og
akt1
korrelert godt med følsomhet for en AKT-hemmer, men hadde svakere korrelasjoner med en mTOR-hemmer [44]. Dette discrepency tyder på at mTOR aktivitet ikke bare er avhengig av PI3K /AKT aktivitet. De rapporterte data av genetiske forandringer i 8 skjoldbrusk kreft cellelinjer ble oppsummert (Vedlegg S2). ble identifisert begrensede genetiske endringer på RAS /RAF /ERK og PI3K /mTOR veier. De tilgjengelige data viser ikke noen sammenheng mellom genetiske avvik av PI3K /mTOR trasé og følsomheten BEZ235, som ingen mutasjon av denne veien i disse cellelinjene er rapportert. Mutasjoner i p53 og BRAF også ser ut til å ikke være korrelert med følsomhet på BEZ235, fordi både følsom (8305C) og mindre følsomme (WRO82-1) cellelinjer havnen mutasjonene. Utforskning av genetiske endringer av mTOR, de store målet for BEZ235, kan kanskje gi opplysninger som kan forutsi terapeutisk effekt.
Hemming av mTORC1 kan aktivere MAPK vei gjennom en PI3K avhengig feedback loop [45], noe som forklarer hvorfor BEZ235 ble sett her for å aktivere ERK1 /2 i skjoldbruskkjertelen kreftceller. Ved å kombinere BEZ235 med en inhibitor rettet mot MAPK-reaksjonsveien kan være en mulig tilnærming for å forbedre terapeutisk effektivitet. Nylig ble en kombinasjon av et pan-RAF-inhibitor og BEZ235 vist seg å indusere cellesyklus-stans ved G0 /G1 fase, og hadde gunstige kombinasjon effekter i behandlingen av kreft i skjoldbruskkjertelen [46].
