Abstract
Bakgrunn
I kolorektalkreft en distinkt undergruppe av svulster demonstrere CpG island methylator fenotype (CIMP). Men en enighet om hvordan å score CIMP ikke nådd, og variasjon i definisjonen kan påvirke rapportert CIMP utbredelse i svulster. Derfor søkte vi å sammenligne tiden foreslåtte definisjoner og avskjær for metylering markører og hvordan de påvirker CIMP klassifisering i tykktarmskreft.
Metoder
Metylering spesifikke multiplex ligation avhengig probe forsterkning (MS -MLPA), med påfølgende fragment analyse ble brukt for å undersøke metylering av tumorprøver. I alt ble 31 CpG områder, som ligger i 8 forskjellige gener (RUNX3, MLH1, NEUROG1, CDKN2A, IGF2, CRABP1, SOCS1 og CACNA1G) undersøkt i 64 forskjellige tykktarm kreft og to tykktarm kreft cellelinjer. Den Ogino-genet panel omfatter alle 8-gener, i tillegg til den Weisenberger panel hvorav bare fem av de 8 genene inngår ble undersøkt. I alt ble 18 alternative kombinasjoner av scoring av CIMP positivitet på sonde, gen- og panel-nivå analysert og sammenlignet.
Resultater
For 47 prøver (71%), den CIMP status var konstant og uavhengig av kriteriene som brukes for scoring; 34 prøver ble stadig scoret som CIMP negativ, og 13 (20%) konsekvent scoret som CIMP positive. Bare fire av 31 sonder (13%) ble undersøkt viste ingen forskjell i antallet positive prøver ved å bruke de forskjellige cut-offs. Innenfor panelene ble observert en tendens til at øke gen-nivå stringens resulterte i en større forskjell i CIMP positive prøver enn å øke sonde-nivå stringens. En vesentlig forskjell mellom positive prøver å bruke «de strengeste» i forhold til «de minst strenge «kriterier (20% vs 46%, henholdsvis; p 0,005). Ble demonstrert
Konklusjoner
en statistisk signifikant variasjon i hyppigheten av CIMP avhengig av cut-offs og gener som inngår i et panel ble funnet, med dobbelt så mange positive prøver ved hvert fall i forhold til de strengeste definisjonen som brukes
Citation. Berg M, Hagland HR, Søreide K (2014) Sammenligning av CpG Island Methylator Phenotype (CIMP) Frequency in Colon Cancer Bruke forskjellige sonde og Gene-Specific Scoring Alternatives på Anbefalt Multi-Gene paneler. PLoS ONE 9 (1): e86657. doi: 10,1371 /journal.pone.0086657
Redaktør: Hassan Brim, Howard University, USA
mottatt: 17 september 2013; Godkjent: 16 desember 2013; Publisert: 21 januar 2014
Copyright: © 2014 Berg et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien var delvis finansiert med tilskudd fra Folke Hermansen Cancer Foundation (tilskudd # 424508 til KS for MB som postdoktor) (https://www.folke-fondet.org), Mjaaland Cancer Fund (tilskuddet # 424506 til KS ), Stavanger universitetssykehus Forskningsrådet og ved å bevilge midler fra institutt for kirurgiske fag, Universitetet i Bergen. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er en genetisk sykdom forårsaket av opphopning av molekylære endringer og modifikasjoner på DNA som styrer tumorigenesis [1]. Riktig molekylær karakterisering av kreft genotyper og fenotyper er viktig å avsløre markører for tidlig deteksjon, prognostication eller prediksjon, samt øke forståelsen av sykdomsprosesser som kan gi informasjon for terapeutisk intervensjon. Tykktarmskreft er et godt undersøkt kreft modell, som tumorer nå er delt i tre undergrupper fenotypiske, avhengig av den dominerende type genetiske avvik: kromosomal ustabilitet (CIN) refererer til endringer på kromosomet nivå (f.eks kopitallendringer); mikrosatelitt ustabile (MSI) refererer seg til endringer i basepar-gjentakelser (f.eks baseendring i dinukleotid gjenta CA
6), og; CpG island methylator fenotype (CIMP) betegner en avvikende metylering spektrum (f.eks hypo- eller hyper metylert cytosines i promoter-regionen), sammenlignet med normale celler [2], [3].
CpG-øy metylering testing har blitt foreslått som et verktøy for diagnose av kreft, prognose, og deteksjon av restsykdom i både blod eller andre kroppsvæsker [4], og indikerer at metylering status er av klinisk relevans [5] – [9]. Videre metylering spesifikke analyser er kommersielt tilgjengelige i dag for å detektere kolorektal kreft, enten som testing for metylering av vimentin i avføringsprøver eller testing for metylering av
SEPT9
i blod [6], [10].
i de siste årene har oppmerksomheten vært fokusert på biologi og potensielle kliniske betydningen av CpG island methylator fenotype (CIMP) i CRC [11], [12]. Selv om det er generelt godt akseptert at etiologisk og klinisk distinkte undergrupper eksistere [13], [14], er det fortsatt en presis definisjon av CIMP skal etableres, både metodisk og på et molekylært nivå [15]. Den økende bruken av high-throughput teknologier også for metylering studier har vist stor innvirkning og foreslo flere paneler,
f.eks
til hjelp i diskriminering av tykktarms svulst fra epitelceller, skille mellom sykdomsstadier, prognostiske grupper og undergrupper forbundet til andre molekylære egenskaper [16] – [18]. Mangelen på konsensus for bestemmelse av CIMP fenotypen er delvis på grunn av det faktum at årsaken til endrede metylering mønster forblir stort sett ukjent [13], [19].
Som en konsekvens, flere genet paneler, laboratorieteknikker, og da terskelverdier er for tiden i bruk, som alle kan føre til forskjeller i rapportert forekomst av CIMP [20]. Siden det er ingen universell standard eller enighet om tallfeste fenotype, etablere sin sanne utbredelsen er en utfordring og vanskeliggjør sammenligning mellom studier. Dermed målene med denne studien var å systematisk teste flere kriterier for å definere CIMP i kolorektal kreft prøver, og undersøke forskjellen i CIMP frekvens når du endrer rille nivåer.
Metoder
humant materiale og Study etikk
Kreft vev ble innhentet fra tykktarmskreftpasienter som gjennomgår kirurgi ved Institutt for Gastrointestinal kirurgi, Stavanger universitetssykehus, Norge. Pasientene ble rekruttert til en potensiell sentinel node rettssaken, og alle samtykket til å studere deltakelse før inkludering og gjenfinning vev. Den vestlige Norge RHF godkjente bruk av menneskelige deltakerne etter å ha skrevet informert samtykke, godkjenning # 197,04. Alle data ble håndtert i henhold til Helsinki deklarasjonen.
Tissue ble oppnådd som tidligere beskrevet [21], og fersk frosne biopsier lagret ved -80 grader Celsius. En prøve sett av 64 trinn II og III pasienter, og 2 tykktarmskreft cellelinjer (Caco2 og HT29), ble vilkårlig valgt for evaluering i det aktuelle studiet.
DNA Isolation
Fersk frossen kreft vevsprøver, fra et like stort antall pasienter ble inkludert. Dessuten ble en referanseprøve av normal kolonepitelet erholdt som sikrer en betydelig avstand utenfor den reseksjonsrendene av kolon tumor. DNA-prøvene ble hentet ved hjelp DNeasy Mini kit eller AllPrep DNA . RNA Mini Kit (Qiagen, Hilden)
Metylering spesifikke Multiplex Ligation avhengig Probe Amplification (MS-MLPA) for CIMP Status
fra alle 64 DNA-prøvene, 100 ng DNA, ble denaturert i et totalt volum på 5 ul Tris-EDTA-buffer, og videre utført som anbefalt av leverandøren (MRC-Holland, Amsterdam, Nederland).
metylering-spesifikk multiplex ringsavhengig forsterkning sonde (MS-MLPA) er en fremgangsmåte for simultan påvisning av metylering ved flere posisjoner i en reaksjon [22], [23]. Kort sagt, en blanding av probe-mix (ME042-B1 CIMP, for mer informasjon om de spesifikke prober se tabell S1) og buffer ble lagt til denaturert DNA, og prober ble tillatt å hybridisere til DNA ved 60 C i 16 timer . Hver prøve ble delt i to rør, hvor den ene halvdel ble ligert, og den andre ble ligert og spaltet ved hjelp av metylering følsomme restriksjonsenzym
HhaI
. Begge prøver ble deretter utsatt for en PCR-reaksjon ved bruk av en termosykler (GeneAmp 2700, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), og fragmentanalyse utført på en kapillar-sequencer (ABI 3130
xl
, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). DNA fra normal tykktarmsslimhinne ble anvendt som normalt referanse. Utgangen fra analysen, etter inter- og intra-sample normalisering, er en prosentandel av metylering i prøven.
Data Analysis of MLPA data
De rådata fra fragmentanalyse ble analysert bruker Coffalyser.NET ™ Software, beta-versjon, (MRC-Holland, Amsterdam, Nederland). Kort sagt, den metylering av hver posisjon i hver prøve i forhold til referanse ble beregnet ved hjelp Coffalyser.net ™ programvare, med standardinnstillinger.
Alle kvalitetsregler /parametre var innenfor tilfredsstillende rekkevidde. Alle prøver ble normalisert mot flere kjøringer av referanseprøven (inter prøve normalisering), og dessuten alle probene ble justert for å referere prober i løpet av hver prøve (intra prøve normalisering).
For metylering scoring av alle probene i alt prøver, forholdet mellom topphøyde av fordøyd versus ufordøyd prøven ble beregnet individuelt i Coffalyser, og andelen av metylering brukes til videre analyse.
Definisjoner og avskjær.
for å undersøke forskjeller i CIMP frekvens, som var avhengig av graden av metylering, forskjellige poeng parametre ble undersøkt.
To paneler av gener ble undersøkt. Den Ogino scoring panel inkluderer 8 gener (
CACNA1G
,
IGF2
,
NEUROG1
,
RUNX3
,
SOCS1
,
CDKN2A
,
MLH1 Hotell og
CRABP1
), mens Weisenberger panel inneholder fem av de ovennevnte gener (
CACNA1G
,
IGF2
,
NEUROG1
,
RUNX3 Hotell og
SOCS1
). For Weisenberger panelet (kalt Weisenberger heretter) en positiv score for tre eller flere av de fem genene anses CIMP positive, mens for Ogino panel to ulike definisjoner ble testet; CIMP positivitet hvis fem av åtte gener var positive (kalt Ogino 5/8), og CIMP positivitet om seks av åtte gener var positive (Ogino 6/8).
Videre ulike cut-offs for å oppnå positive metylering for hver sonde, samt ulike definisjoner av den totale metylering status for et bestemt gen ble undersøkt: alle posisjoner /probene ble merket ved bruk av to forskjellige nivåer av metylering (≥20% eller ≥30%) for å definere en bestemt stilling /probe som denaturert. Tre forskjellige cut-offs ble testet for å definere metylering for hvert gen; enten minst 33% (1/3) av prober ble metylert; minst 66% (2/3) ble metylert, eller; som har minst ett eller flere metylerte prober innenfor genet.
For hvert gen ble flere metylering sider studert, som strekker seg fra tre til seks steder pr genet. Antallet metylering nettsteder for genene undersøkt var som følger: 3 probes hver for
RUNX3
,
CACNA1G Hotell og
IGF2
; 4 sonder hver for
MLH1
,
CRABP1
,
SOCS1 Hotell og
CDKN1A
, og; 6 prober for
NEUROG1
.
For CIMP avgjørelse, ble de tre panelene som brukes i kombinasjon med alle sonde og gen-messig cut-offs, Figur 1. Dette resulterte i totalt 18 alternative poeng definisjoner for CIMP. Forskjeller i positive prøver ble observert, og statistisk signifikans evaluert.
«mest strenge kriterier «for scoring av CIMP ble definert som metylering av minst 30% på sonde nivå, minst 66% positive prober i et gen, og seks av åtte positive gener i Ogino panelet. De «minst strenge kriterier» ble definert som 20% metylering på sonden nivå, en eller flere positive prober i et gen, og tre av fem gener merket som positivt i Weisenberger panelet.
Statistisk analyse.
Alle statistiske analyser ble utført av SPSS V21 (IBM Corp., Armonk, NY, USA).
antall positive prøver som følge av hver av de ulike scoring kriterier ble sammenlignet ved hjelp McNemars test på en 2 × 2 bord. Alle testene var tosidig, og statistisk signifikans angitt for p-verdier. 0,05
Resultater
Probe-messig Cut-off
For hver sonde, den relative metylering av prøven, sammenlignet med en normal referanse, ble gitt som en prosentandel. Cut-off for å oppnå en sonde som metylert ble testet med både 20% og 30% metylering av prøven vs referanse, figur 2. Begge cut-offs ble testet for alle sonder i analysen. Totalt sett, ved bruk av 30% som cut-off, antallet positive prøver for de 31 forskjellige prober som ble testet, varierte fra 0 (0%) til 63 (95%), mens anvendelse av 20% som cut-off, variasjonen var fra 0 (0%) 64 (97%). Den midlere variasjon med avslutningen av positive prøver mellom 20% og 30% cut-offs var 3 (5%), varierende fra et minimum på 0 til et maksimum på 8 prøver (0-12%). Fire av 31 sonder (13%), i to forskjellige gener, viste ingen forskjell i antall positive prøver ved hjelp av de to cut-offs (03-037010228 i
MLH1
, 16-011256544, 16-011256960 og 16-011257200 i
SOCS1
). Den største variasjon ble observert for sonde 09-021965200 i
CDKN2A
, der 8 pasienter (12%) ble scoret på en annen måte ved hjelp av to ulike cut-offs. Tre prober (16-011256544, 16-011256960 og 16-011257200 i
SOCS1
) ikke har noen positive prøver ved hjelp av ett av kriteriene, som metylering prosent varierte fra 0 til 5%.
aksen til venstre viser antall positive prøver, og aksen til høyre viser andelen positive prøver.
Gene-messig Cut-offs
antall prober undersøkt for hvert gen varierte fra 3 til 6. Tre forskjellige intra-genet innstillinger ble testet; en eller flere positive sonder, mer enn 33% positive sonder eller mer enn 66% positive sonder. Alle tre innstillinger ble testet både for en sonde-messig cut-off på 20% og 30%.
Dette resulterte i at seks scorings pr gen, for hvilke en middelverdi på 44,8% av prøvene ble skåret som positive i løpet 8 gener. Den midlere prosentandelen av positive prøver på tvers av gener, for hver ballen kriterier, varierte fra 34,3% til 57,0%, ved bruk av de strengeste (30% sonde cut-off, 66% positive prober pr genet), og minst strenge kriterier (20% sonde cut-off, ≥1 positive sonde per genet), henholdsvis Tabell 1.
SOCS1 hadde lavest antall positive prøver, med en gjennomsnittlig score på positive prøver av 5,8%, fra 0 til 18,2%, mens gjennomsnittsskår av positive prøver for IGF2 var 96,0% for de 6 alternative kriterier, alt 92,4 til 97,0%, Tabell 1 /Figur 3.
CDKN2A
viste største variasjon i positive prøver å bruke de 6 alternative kriterier. Antallet positive prøvene varierte fra 39 prøver, fra 5 til 44, ved hjelp av de strengeste og minst strenge kriterier, henholdsvis. Tvert imot,
RUNX3 Hotell og
IGF2
viste minst variasjon; i begge tilfeller bare 3 pasienter ble scoret på en annen måte i løpet av de 6 forskjellige kriterier. For
RUNX3
24 pasienter ble scoret som positive ved hjelp av de strengeste kriteriene, sammenlignet med 27 pasienter med de minst strenge kriterier. For
IGF2
antall positive prøver var 61 og 64, ved hjelp av de mest og minst strenge kriterier, henholdsvis.
CIMP Frekvenser
Resultatet, i form av antall positive prøver ved hjelp av hver av de tre paneler, inkludert de ulike kombinasjoner av probe-kloke og gen-messig scorings, blir presentert i tabell 2 /figur 4.
bilder
de strenge kriterier, ved hjelp en sonde cut-off på 30%, og krever at to av tre (mer enn 66%) av sondene i en viss gen skal være positiv, i tillegg til å bruke Ogino 6/8 panel, returneres 13 (20%) CIMP-positive prøver. Tvert imot, ved hjelp av en sonde cut-off på 20%, noe som krever minst en eller flere positiv sonde innenfor et gen, og den Weisenberger panelet (3 av 5 positive gener), returnerte 30 (45%) CIMP-positive prøver.
Når du bruker de minst strenge kriterier på sonde (20%) og generer (≥1 positive gener) nivå, 24 prøver (36%) ble scoret som positive ved hjelp Ogino 6/8-panel, 29 positive (44%) ved anvendelse av Ogino 5/8-panel og 30 positive (46%) ved anvendelse av Weisenberger panel. Disse sonde og gennivå kriterier resulterte i den største variasjon mellom platene, noe som resulterer i 6 pasienter (9,1%) ble scoret på en annen måte. For 47 pasientprøver (71%), den CIMP status var konstant og uavhengig av kriteriene som brukes for scoring; 34 prøver ble stadig scoret som CIMP negativ, og 13 scoret som CIMP positiv.
En vesentlig forskjell mellom positive prøver ved hjelp av de strengeste (20%) sammenlignet med de minst strenge (46%) kriterier ble demonstrert, p 0,005. Når man sammenligner de minst strenge kriterier for både probe-nivå (20%) og gen-nivå (≥1 positive probe) mellom de tre paneler, bare den Ogino 6/8 i forhold til Weisenberger panel viste en signifikant forskjell (p = 0,031) . Tvert imot, har de strengeste kriterier på sonde og gennivå ikke tilbake signifikante forskjeller mellom panelene.
Testing for forskjeller innenfor hvert av panelene, viste at en økning av stringens på gen-nivå fra den minst streng (≥1) til de streng (66%), og holder konstant sonden nivå, resulterte i signifikant forskjellig antall positive prøver. På den annen side, holder genet nivå konstant, mens endring av sonden nivå, ville resultere i signifikant forskjellige positive prøver for ≥1 kriterier, innenfor den Weisenberger panelet.
diskusjon
Uavhengig av metoden som er benyttet, vil kriterier for scoring av CIMP må defineres på tre nivåer; hvilke gener som skal testes, hvor mange metylering nettsteder bør bli påvirket for genet for å være transcriptionally inaktivert, og i hvilken grad en metylering nettstedet må metylert å påvirke transkripsjon status av genet.
Denne studien fant en signifikant forskjell i CIMP frekvens i tykktarmskreft ved bruk av MS-MLPA metodikk, når man sammenligner ulike kriterier som brukes for å definere denaturert prøver. Selv om en stor andel av prøvene (71%) var konsekvent scoret (hvorav 13 var CIMP positive) med ingen endring i henhold til kriteriene som er brukt, resten ble påvirket av en endring i scoring kriterier fastsatt. Spesielt, bare fire av 31 sonder (13%) undersøkt viste ingen forskjell i antall positive prøver ved hjelp av ulike cut-offs. Den største variasjon ble observert for en av sondene i
CDKN2A
genet. For de 8 gener undersøkt,
RUNX3 Hotell og
IGF2
var mest forenlig med liten variasjon mellom prøvene, mens betydelig variasjon var kjent for
CDKN2A
, i henhold til resultatene som rapporteres av Ogino et al. [20]. Kriteriene som brukes resulterte i signifikant forskjellig antall positive prøver når de brukes for de to foreslåtte paneler for å definere status CIMP i litteraturen, nemlig Ogino- og Weisenberger panelene [20], [24].
Funnene utgjøre flere viktige implikasjoner. For ett, viser det variasjon mellom hyppigheten av CIMP avhengig av cut-offs og gener undersøkt i et panel. Dette bør bemerkes når etterforskerne bruker CIMP som en del av klassifiseringen foreslått for tykktarmskreft. For det andre viser det variasjon i metylering innenfor og på tvers av gener. Dette kan enten være relatert til de sanne forskjeller innenfor genene og de undersøkte prober eller som kan knyttes til teknikk som brukes for identifikasjon. Dersom det tidligere er sant, grunnen til hvorfor enkelte områder er (mer konsekvent) metylert mens andre ikke bør undersøkes, da det kan danne ny kunnskap om kreftutvikling og hvordan metylering kan bidra til kreftutvikling. Videre kan det være at gener og prober (for eksempel
RUNX3
og
IGF2
) bør benyttes sammen med andre tilsvarende eller gjennomgående denaturert gener i paneler for å danne avgjørelse om CIMP status, i rekkefølge å unngå over- eller undervurdering av CIMP positive eller negative prøver.
den presenterte studien ble gjennomført for å vurdere relevansen av å bruke alternative scoring kriterier for CIMP, ved hjelp av metylering bestemt multiplex ligation avhengig probe forsterkning (MS -MLPA). I den publiserte litteraturen er det flere studier for evaluering gen paneler og CpG-posisjoner som skal brukes for CIMP anledninger, men de underliggende cut-offs for den bestemte stilling og genet er dårlig diskutert [11], [20], [24].
i denne studien, forskjellen i antall positive prøver ved hjelp av de strengeste i forhold til de minst strenge kriteriene var statistisk signifikant, og indikerer at de valgte cut-offs som brukes for scoring av CIMP status er viktig. Videre statistiske analysene viste også at kombinasjoner av alle tre nivåer av skåringsalternativer ga statistisk forskjellig antall positive prøver, noe som innebærer at alle tre nivåer bør vurderes nøye. Men innenfor alle de tre paneler, endring av genet nivåkriterier hadde en større innvirkning på antallet prøver merket som positivt enn endre sonde nivåkriteria. Selv om flere forskjellige metoder kan brukes til å oppdage den CIMP fenotype, vil alle disse metodene har til å vurdere scoring kriterier ligger til grunn for CIMP definisjon. Uavhengig av metoden som er benyttet, vil man måtte vurdere hvilke CpG nettsider for å studere og definere en cut-off for metylering av den spesifikke CpG området, definere hvor mange CpG områder innenfor genet som må metylert for å definere genet som metylert, og til slutt, som gener, og hvor mange av dem trenger å bli metylert til slutt scorer prøven som metylert.
Forskjeller i CIMP score mellom genet paneler har blitt evaluert [20], og funnet å være ganske små ( 3,2%), selv mellom panelene ved hjelp av ulike gener. Dessuten ble en sammenligning av cut-off for Ogino panel (5 til 8 og 6 av 8) sammenlignet, og 3% av prøvene viste forskjellige anledninger (18% og 15%, respektivt) [20].
generelt er uavhengig av kriteriene og fremgangsmåten som brukes for scoring av CIMP, graden av metylering målt for en gitt posisjon vil avhenge av homogeniteten av cellene, og infiltrering av normale celler i prøven undersøkt.
i tillegg bør valget av normal referanseprøve for hver studie vurderes nøye, da metylering av en prøve er i forhold til den valgte referanse. I denne studien brukte vi en prøve fra normal epitel fra et kolon kreftpasient. I teorien kan denne prøve havnen noen epigenetiske egenskaper som påvirker resultatene av metylering mønster i kreftprøvene. Imidlertid vil dette påvirke alle prøvene like, og er derfor minimal betydning med hensyn til å vurdere scoring kriterier. Gitt muligheten, ville det beste alternativet har vært å teste normal mucosavev fra pasienten hvor svulsten testet stammer fra langs selve svulsten. Gitt den begrensede materialet vi hadde tilgjengelig, vår beste alternativet var å bruke den før nevnte kontroll og dermed presentere dataene på samme måte.
De fleste rapporter om CIMP status har brukt bisulfitt behandling av DNA før den valgte metoden for avhør av metylering mønster. Denne manipuleringen av DNA-konverterer unmethylated cytosines til uraciler, mens det metylerte er igjen uomdannet. Det finnes flere protokoller for bisulfitt behandling, ulik bisulfittkonsentrasjonen brukt og inkubasjon /konvertering tid, og legge til et annet nivå av kompleksitet til den avgjørende CIMP status. I studien som presenteres her, har ingen DNA-behandling blitt gjort før den MLPA fremgangsmåten, og dermed begrense kilden til feil.
Videre er det faktum at metylering av genet er varierende naturlig for å regulere genekspresjon, og at arten av den epigenome, i motsetning til genomet, er å være i konstant transformasjon, er et annet aspekt kompliserer en klar definisjon av CIMP [25]. For å omgå denne utfordringen man måtte stole på materialet som er samlet inn på samme tidsintervall og scene i pasientens behandling, da slike unngå mulige time-lapse avvik.
Konklusjoner
I konklusjonen denne studien belyser hvordan ulike scoring kriterier resultere i statistisk signifikant forskjellig antall CIMP positive prøver. Definisjonen av CIMP i kolorektal cancer er ennå ikke avtalt, hverken på et kvalitativt nivå (som CpG-øyer /gener som skal testes), på et kvantitativt nivå (hvor mange posisjoner må være denaturert), og heller ikke på et teknisk nivå ( hvilken metode som skal brukes). Men uavhengig av den metoden som er benyttet man måtte bestemme seg for cut-offs for positiv score, noe som bør vurderes nøye, da den endelige CIMP frekvensen vil bli betydelig påvirket av denne beslutningen. Videre forskning på dette viktige området er berettiget til å forbedre kliniske betydningen av den rollen CIMP i kreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
sekvenser, kromosom plassering og fragmentlengder for de undersøkte stillinger /sonder i MLPA metode
doi:. 10,1371 /journal.pone.0086657.s001 plakater (docx)
Takk
Vi takker Oddmund Nordgaard for vennlig å gi DNA fra tykktarm kreft og normal colonic vev.
