Abstract
Eggstokkreft G protein-koblet reseptor 1 (OGR1) har vist seg å være et proton sensing receptor
in vitro
. Vi har vist at OGR1 fungerer som en metastase suppressor gen når det er over-uttrykt i humane prostata kreft celler
in vivo
. For å undersøke fysiologiske funksjoner OGR1, genererte vi betinget OGR1 mangelfull mus ved homolog rekombinasjon. OGR1 mangelfull mus var levedyktig og ved brutto-inspeksjon viste normal. I samsvar med
in vitro
studier som viser at OGR1 er involvert i osteoclastogenesis, reduserte osteoklaster ble påvist i OGR1 mangelfull mus. Et pH-avhengig osteoklaster overlevelse effekt ble også observert. Men samlet abnormitet i beina i disse dyrene ble ikke observert. I tillegg ble melanomcelle tumorigenesis signifikant hemmet i OGR1 mangelfull mus. OGR1 mangelfull mus i den blandede bakgrunnen produserte signifikant mindre peritoneale makrofager når stimulert med tioglykolat. Disse makrofager viste også endret ekstracellulære
signal
-regulated kinaser (ERK) aktivering og nitrogenoksid (NO) produksjon som respons på lipopolysakkarid. OGR1-avhengige responser pH vurdert ved cAMP-produksjon og celle overlevelse i makrofager eller brune fettceller ble ikke observert, sannsynligvis på grunn av tilstedeværelsen av andre proton avføling reseptorer i disse cellene. Våre resultater indikerer at OGR1 rolle i osteoclastogenesis er ikke sterk nok til å påvirke den generelle bein utvikling og dens rolle i tumordannelse garanterer videre etterforskning. Musene som genereres kan potensielt brukes til flere sykdomsmodeller, inkludert kreft eller osteoklast-relaterte sykdommer
relasjon:. Li H, Wang D, Singh LS, Berk M, Tan H, Zhao Z, et al. (2009) Misdannelser i Osteoclastogenesis og redusert tumordannelse hos mus Mangel for Ovarian Cancer G protein-koblet reseptor 1. PLoS ONE 4 (5): e5705. doi: 10,1371 /journal.pone.0005705
Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada
mottatt: 02.04.2009; Godkjent: 05.05.2009; Publisert: 28. mai 2009
Copyright: © 2009 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. RO1 HL68804 , RO1-CA89228 og Ralph C. Wilson, Sr. og Ralph C. Wilson, Jr. Medical Research Foundation stipend. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Vi har tidligere klonet OGR1 fra en eggstokkreft cellelinje HEY [1]. Nylig har vi vist OGR1 er en roman metastase suppressor genet for prostatakreft [2]. OGR1 og dens underfamilien G-protein-koblede reseptorer (GPCR), GPR4, G2A og T-celledød-assosiert gen 8 (TDAG8), har vist seg å ha proton-sensing evne [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9]. Mange av disse proton føler aktivitetene er blitt identifisert i celler som over-uttrykker ett eller flere av disse GPCR. Mer nylig har protonføler aktivitet påvist i celler fra GPR4- og TDAG8-, men ikke G2A-manglende mus [8], [10], [11].
Mus som mangler G2A, TDAG8, eller GPR4 har blitt generert. Disse knockout (KO) mus er levedyktig og viser forskjellige fenotyper. G2A KO mus viser et normalt mønster av T- og B-celle avstamning differensiering gjennom ung voksen alder. Men alderen G2A-mangel dyr ( 1 år) utvikle sekundære lymfoide organ utvidelse forbundet med unormal utvidelse av både T- og B-lymfocytter [12]. I tillegg kan andre fenotyper relatert til benmarg-avledede celler, innbefattende, monocytter /endoteliale celler og makrofager, så vel som leverceller har blitt rapportert [8], [13], [14], [15], [16], [17]. TDAG8 er transcriptionally oppregulert av glukokortikoider (GCS) og impliserte av over-uttrykk studier i psychosine hemming av cytokinese [18], [19]. Selv TDAG8 uttrykk ligner dynamisk regulering beskrevet for kjente modulatorer av GC-indusert apoptose under thymocytt utvikling, er det unnværlig for psychosine-indusert dannelse av multinucleated celler. I tillegg thymocytter i TDAG8 KO mus viser normal apoptose følgende
in vivo Hotell og
in vitro
GC behandling [11]. Videre gjør surt ekstracellulære pH ikke differensielt modulerer mottakelighet av TDAG8 villtype (WT) og KO thymocytter til GC-indusert apoptose [11]. Men i thymocytter og splenocytter fra eksplanterte reseptor-manglende mus, TDAG8, men ikke G2A, er funnet å være kritisk for pH-avhengig cAMP produksjon [8]. Mens dette manuskriptet var under forberedelse, Mogi
m.fl.
har vist at TDAG8, men ikke OGR1 er involvert i pH-indusert hemmende effekt på tumor nekrose faktor-alfa (TNF-α) produksjon i makrofager [20]. GPR4 er uttrykt i de fleste endotelceller og medierer sphingosylphosphorylcholine (SPC) -indusert angiogene aktiviteter (11). GPR4 mangel fører til delvis trengt karlidelser under utvikling og at denne reseptoren funksjoner i blodkar pH sensing i en
ex vivo
aortic ring analyse [10].
OGR1 har blitt identifisert som et sterkt oppregulert genet under osteoclastogenesis i
csf1
tl /csf1
tl
rotter (CSF-manglende rotte) ble behandlet med makrofag kolonistimulerende faktor (M-CSF eller CSF-1) og i reseptor aktivator av kjernefysiske faktor κ B ligand (RANKL, eller TRANCE, TNFSF11) indusert osteoclast differensiering
in vitro product: [21]. Potensialet funksjonell involvering av OGR1 i osteoclastogenesis er blitt demonstrert ved anvendelse av et anti-antistoff OGR1 og ved å hemme OGR1 med liten inhiberende RNA (siRNA) [21]. Videre har systemisk acidose skadelige virkninger på skjelettet og lokal acidose er forbundet med benet ødeleggelse i inflammatoriske og neoplastiske sykdommer. Overlevelse og kalsiumsignalisering av osteoklaster blir betydelig forbedret ved surgjøring av mediet i en OGR1-depedent måte [22]. Den funksjonelle involvering av OGR1 har hovedsakelig vært undersøkt ved hjelp av enten OGR1 antistoff, eller en uspesifikk OGR1 antagonist Cu
2 +, eller siRNAs mot OGR1. Siden alle disse reagenser alle potensielt kan ha off-target effekter, er et mer spesifikt system for å vurdere de fysiologiske rollene OGR1.
stamceller (MSC) og blodkreft stamceller fra benmarg er i stand til å differensiere i monocytter, osteoklaster, osteoblaster og adipocytter, blant andre celle fenotyper. Disse celletypene er viktig for mange biologiske funksjoner. Under normale fysiologiske betingelser er de differensieringsprosesser kontrollert. Ubalanserte differensiering og /eller aktivering prosesser føre til patologiske tilstander og sykdommer.
Avledet fra blod monocytter, makrofager er relativt lang levde phagocytotic celler av pattedyr vev. Makrofager er involvert i en rekke prosesser, inkludert patogen ødeleggelse, inflammasjon, vev reparasjon og ombygging. De har en meget plastisk fenotype og deres funksjonelle polarisering er bestemt av cytokiner og faktorer innenfor lokale microenvironments [23]. En av funksjonene til makrofager er å tilveiebringe en forsvarsmekanisme mot tumorceller. Imidlertid er tumorassosierte makrofager (TAM), som representerer hoved inflammatorisk komponent av stroma av mange faste tumorer, assosiert med tumorprogresjon og metastase [23].
Brown og hvite fettvev (BAT og WAT ) er sentrale aktører i fedme og relaterte helseproblemer, slik som type-2 diabetes og hjerte- og karsykdommer. BAT-avhengige som ikke skjelver thermogenesis signifikant påvirker kroppens energibalanse. I tillegg til sin energilagringsfunksjon, fettvev også utskiller et antall hormoner og cytokiner, og er involvert i kontrollen av kroppens stoffskifte og energibalanse på flere steder [24], [25]. BAT er av spesiell betydning hos nyfødte, små pattedyr (for eksempel mus) i kalde omgivelser, og dyr som dvale, fordi dens store fysiologiske funksjon er å spre lagret energi i form av varme. I menneskebarn BAT omfatter opptil 5% av den totale kroppsvekt, som deretter avtar med alderen til nesten ikke-eksisterende nivåer av voksenlivet.
Gjennom et dyrs liv, i benvevet i en konstant tilstand av omsetningen som et resultat av en kombinasjon av sekvensiell fjerning av benvev ved osteoklaster og nytt ben deponering av osteoblaster. Osteoklastene ben-resorberende multinukleære kjempeceller som er avledet fra hematopoetiske forløperceller mononukleære under kontroll av både M-CSF og RANKL [21]. . Disse cellene hjelpemiddel i å absorbere og fjerne overflødig benvev i ombygging av voksende bein, eller skadet bein i reparasjon av brudd
Vi har generert og karakterisert OGR1 mus som mangler for å løse flere kritiske spørsmål: 1) fysiologiske funksjoner OGR1 i mus; 2) rolle OGR1 i osteoclastogenesis; 3) OGR1 avhengige pH respons ved hjelp OGR1-manglende celler; og 4) funksjoner av OGR1 i andre benet biologiske prosesser når musene utfordret av eksogene stimuli, slik som tumorceller. Vi har funnet ut at i konsistens med publiserte data, er sannsynlig å bli involvert i osteoclastogenesis OGR1. I våre hender, observerte vi redusert osteoklaster avledet fra beinmargceller hos OGR1 mangel mus. En svak pH-avhengig osteoklaster overlevelse effekt ble også observert. Imidlertid blir benstrukturer av musene ble ikke påvirket og en betydelig pH-regulert og OGR1-avhengige biologiske effekten ble ikke generelt bevist i OGR1-uttrykkende celler [inkludert makrofager og brune adipose avledede celler (BADCs)], som tyder på en redundant virkning andre OGR1 familien GPCRs
in vivo
. I tillegg har effekten og involvering av vertscelle OGR1 i tumorigenesis av melanom celler er av stor interesse og garanterer videre etterforskning. Ytterligere to avvik knyttet til bukhinnemakrofager og BAT ble observert i en mus bakgrunn avhengig måte, noe som tyder på engasjement for å modifisere gener i forskjellige muse bakgrunn.
Materialer og metoder
Reagenser
Sphingosylphosphorylcholine (SPC) og lysofosfatidylcholin (LPC) var fra Aventi Polar Lipids (Birmingham, AL) eller Toronto Research Chemicals (Toronto, Canada). M-CSF og RANKL var fra Peprotech (Rocky Hill, NJ). Anti-FLAG M2, H
2o
2, thioglycolate (TG), lipopolysacchride (LPS), Latex perler, natriumnitritt, Griess reagens, tartrat-resistent sur fosfatase (TRAP) Fargingsreagensmidlene og Massons Trichrome Fargingsreagensmidlene var kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO). Anti-fosfor-ERK, anti-ERK, anti-fosfor-p38, anti-p38 var fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Geit-anti-iNOS, TRITC-anti-kanin var fra BD (San Jose, CA). Anti-F4 /80, anti-PCNA, kanin anit-arginase og anti-cyklooksygenase-2 (COX-2) var fra Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Anti-CD31 var fra RDI (Fitzgerald, Concord, USA). Citratbuffer, universell hest serum, VECTOR NovaRED, og Hematoxylin QS var fra VECTOR (Burlingame, California).
Generering av OGR1 knockout (KO) mus
OGR1 målretting konstruksjon har blitt generert gjennom en kontrakt med AnTeq gene mus (Australia). I korte trekk, ble A 13,2 kb Bam HI genomisk fragment som inneholder OGR1 genet subklonet fra en bakteriell kunstig kromosom (BAC) klone (en slags gave fra Dr. Owen Witte laboratoriet ved UCLA) i en PBS (KS) II vektor (plasmid # 182) . 5′-homologi regionen til OGR1 locus ble PCR-amplifisert ved å bruke primerne OGR1 # 1 og # 2 og plasmid # 182 som et templat. Primer # 2 opprettet en ny Nco1 området på begynnelsen av OGR1 (skiftes første kodon fra ATG til CTC). PCR-fragmentet ble subklonet inn i pCR2.1.TOPO (Invitrogen) for å gi plasmid # 183. Ekson 1 av OGR1 ble PCR-amplifisert ved anvendelse av primere # 7 og # 8, mens primer # 7 innført et XbaI-sete for ytterligere kloningstrinn. PCR-fragmentet ble subklonet inn i pCR2.1.TOPO for å gi plasmid # 188. Denne komplette OGR1 sekvens ble bekreftet ved sekvensering analyser. Et 6,2 kb genomisk fragment av den 3 «ikke-translaterte regionen av OGR1 locus ble subklonet inn i plasmid # 182 for å gi plasmid # 189. En 1,4 kb floxed-neo-kassetten ble så klonet inn i plasmidet # 189 linearisert med Stu jeg å gi plasmid # 208. Stul spalter ved 5»-enden av den 3 «Hind III OGR1 region. De 3xFLAG region som koder for tre tilstøtende FLAG-epitoper ble PCR-amplifisert fra plasmid p3xFLAG CMV-19 ved anvendelse av primere # 3 og # 4 og den sistnevnte primer inngår et Xho I-sete for ytterligere kloning. Den 353 bp PCR-produktet ble subklonet inn pCR2.1.TOPO (plasmid # 185). Et 400 bp Ken I- og Xho I-fragmentet fra # 185 ble ytterligere subklonet i PBS (KS) II for å få plasmid # 196. Et 2,6 kb Kpnl-Nco I-fragment (5 «homoloy region) fra plasmid # 183 ble deretter subklonet inn i plasmid # 196 i front av 3 x FLAG region (plasmid # 199). Den loxP område i 5»-regionen av ekson 1, ble klonet ved anvendelse av primere glødet # 5 og # 6 og ligert inn i plasmid # 199 på Xho I- og Xba I-områder. Dette ga opphav til plasmid # 204, som ble sekvensert for å bekrefte integriteten til 3xFLAG-loxP-exon 1 koblings. Et 1,8 kb Xba I-Sac I-fragment inkludert OGR1 ekson 1 og «3» ikke-translaterte området fra plasmid # 188 ble subklonet inn i plasmid # 203 for å danne plasmid # 209. Et 7,7 kb Hind III-fragment av plasmid # 208 husing neo-kassetten flankert av loxP-seter og 3 «OGR1 homologi region ble subklonet inn i plasmid # 209 for å gi den OGR1 målretting vektor # 218. Funksjonaliteten loxP steder ble bekreftet i en
E. coli
belastning BNN123 konstitutivt uttrykker rekombinant Cre. Sekvensene av primerne som ble brukt var:
# 1: 5 «GGT ACC GGA GGA CGT GAG CAA CAA CT
# 2: 5′ ATG TTC CCC ATG GTT GGG CCA GAA
# 3: 5 «TCC TAC TTG GCA GTA CAT CT
# 4: 5′ ATC TCG AGC TTG TAC TCG TCA TCC TTG
# 5: 5 «TCG AGA TAA CTT CGT ATA GCA TAC ATT ATA CGA AGT TAT
# 6: 5 «CTA GAT AAC TTC GTA TAA TGT ATG CTA TAC GAA GTT ATC
# 7: 5′ TCT AGA GGG AAC ATC ACT ACA GAA AAC TC
# 8: 5 «AGG AAC TTG GCT AAG GAC
OGR1 målretting konstruksjoner ble injisert i ES-celler på transgen mus Kjerne Facility ved case Western Research universitet (Cleveland, OH). Kimære mus med bakterie linje FLAG-merket OGR1 gener flankert av to loxP nettsteder ble generert. Gjennom avl til C57 /BL6 mus, ble disse musene som brukes til å generere heterozygote mus med en kopi av FLAG-merket OGR1. Etterfølgende oppdrett av heterozygous OGR1
fl /+ mus generert homozygot OGR1
fl /fl mus. Alle avkom fra oppdrett av heterozygot OGR1
fl /+ mus ble genotypet ved DNA-analyse av halen klipp. Utgangspunktet både Southern blot og PCR-analyser ble utført for å bekrefte genotype. Etterfølgende genotyping ble i hovedsak utført ved bruk av PCR-analyser. Homozygot mus med OGR1 floxed (OGR1
fl /fl) ble avlet for å spire linje Cre mus Zp-3 (en transgen mus linje for inaktivering av loxP-flankert målgener spesielt i den kvinnelige kjønnsceller [26]; Jackson Labs , Bar Harbor, Maine). I tillegg ble de avlet for å PRM (Protamine-Cre, en transgen mus linje for inaktivering av loxP-flankert målgener spesielt i den mannlige kjønnsceller fra mus [27]; vennlig levert av Dr. Guangbin Luo, Case Western Reserve University ) for å generere OGR1
+/- Cre mus som ble avlet videre for å generere OGR1
– /- (KO eller mangel) mus. Den OGR1
fl /fl mus ble utpekt OGR1 FL. OGR1
– /-. Mus i blandet bakgrunn har blitt backcrossed til C57 /BL6 i 10 generasjoner, det OGR1
+ /+ 10
th generasjon mus ble utpekt OGR1 villtype (OGR1 WT)
Phenotype analyserer
OGR1 KO mus var levedyktig og fruktbar. En komplett mus fenotype Undersøkelsen er gjennomført i to par OGR1 KO og FL mus (8 uker gammel, en mann og en kvinne i hver gruppe) ved Mouse fenotyper delt ressurs, Ohio State University, Columbus, OH. For å bestemme fedme indeksen, var en tidligere publisert metode som brukes [28].
Vevsdistribusjonsstudier analyser
Organer ble skåret ut fra mus og faste i Sink (BD, Franklin Lakes, NJ) for 12 -24 time, deretter holdt i 70% etanol før den ble innleiret i paraffin og deretter seksjonert ved 5 um. Post deparaffinization og rehydratisering, ble platene behandlet med sitrat-buffer i 20 minutter og sammen med H
2o
2 (0,3%) i etanol i 15 minutter. Universal hesteserum ble brukt til å blokkere vevet etterfulgt av anti-FLAG antistoff (1:200 fortynninger) behandling. VECTOR NovaRED ble brukt som substrat og Hematoxylin QS som teller flekken.
RNA isolering, revers transkripsjon-PCR (RT-PCR)
Vev ble fjernet fra mus og pulverisert etter snap iskaldt flytende nitrogen. Total RNA ble ekstrahert ved bruk av RNeasy Mini Kit (Qiangen, Maryland) og revers transkribert av M-MLV (Invitrogen, Carlsbad, CA). Avledet cDNA ble forsterket ved hjelp av PCR mester mix (Promega, Madison, WI). Primersekvenser for OGR1 var som følger: 5′-CTCAATGACCTCCTTGTGATTG-3 «og 5′-CTACCAGAAAACTCCTCACTATC-3». β-actin ble forsterket som en husholdningsgenet med primere 5′-ACCGCTCGTTGCCATTAGTGATGA -3 «og 5′-AAGGCCAACCGTGAAAAGATGACC-3».
Brown fettvev isolasjon og spredning av brune adipose avledet celler (BADCs)
Brunt fett ble dissekert fra den dorsale aspekt av thorax mellom scapulae, og formalin (10%) fast da parafin innebygd, etterfulgt av H E farging. Til kultur BADCs, ble brunt fett skåret i små stykker og anbragt i samme volum av kollagenaseoppløsning (DMEM, 1% penicillin /streptomycin, 1% BSA, 1 mg /ml kollagenase type I, filtrert). Denne suspensjonen ble plassert i en 37 ° C risteapparat ved 200 rpm i 60 min. Etter dette, ble DMEM-medium (10 ml) inneholdende 10% FBS, 1% penicillin /streptomycin, 2% glutamin, 1% ikke-essensielle aminosyrer og 1/1000 β-merkaptoetanol tilsatt til den brune fettcellene. Etter sentrifugering ved 2000 rpm i 5 minutter ble det hvite sjiktet fjernet, og cellepelletene ble resuspendert i 10 ml kulturmedium og filtrert gjennom et cellefilter. Cellene ble deretter overført til cellekulturskåler og tillatt å nå konfluens. For spredning /overlevelsesanalyser ble cellene sultet i 24 timer, deretter behandlet med en annen stimulans for 24 og 48 timer [3]. 10 ul av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT, 5 mg /ml) ble tilsatt inn i cellene 3 t før innhøsting. Absorbansen til oppløsningen ved 550 nm ble bestemt ved anvendelse av en vektor
3 spektrofotometer (PerkinElmer, Waltham, MA).
Macrophage og osteoklastgenerering og karakterisering
For peritonealmakrofager ble mus injisert ip med 1 ml av TG (4%). Makrofager ble oppsamlet fire dager etter injeksjon. Cellene ble høstet ved peritoneal vasker bruker RPMI. Etter vasking ble cellene dyrket i RPMI med 10% FBS i 2 timer. De ikke-adherente celler ble fjernet og over 80% av de adherente celler var makrofager [29]. Benmarg avledet makrofager (BMMs) ble hentet fra lårben på 6-10 uker gamle mus [30]. I korte trekk, ble endene av benene kuttet av, og margen ble spylt fra amputerte lårben ved anvendelse av en 1 ml sprøyte for å oppnå en suspensjon, som deretter ble ført gjennom en 27-gauge nål for dispersjon. Margcellesuspensjoner (500 ul; 1 x 10
6 celler) ble sådd ut i lav M-CSF [3% L-929-celle-kondisjonert medium (L-CM) som en kilde for M-CSF] i RPMI inneholdende 20% FBS. L-CM ble fremstilt ved poding 2,5 x 10
5-celler i en 175-cm
2 vevskulturkolbe med 50 ml basisk medium inntil cellene var sammenflytende. Supernatanten ble deretter samlet, filtrert gjennom et 0,2 um filter, og frosset i alikvoter ved -80 ° C. Etter at stromaceller å følge over natten, ble ikke-adherente celler samlet opp og sådd ut i høy M-CSF (30% L-CM). Etter tre dager ble mediet fjernet sammen med ikke-festede celler og nytt medium inneholdende 30% L-CM ble tilsatt. Heftende makrofager var homogene populasjoner etter 7 dagers dyrking. Cellene ble farget med Diff-raske og telles. For å skille makrofager i osteoklaster, frisk medium med RANKL (50 ng /ml) ble satt på den tredje dagen og scoret tre dager senere ved å telle trap-positive celler.
fagocytose og nitrogenoksid (NO) produksjons analyser
Peritoneale makrofager (1 x 10
4 celler /300 ul) ble inkubert i 48-brønners plater og behandlet med latekskuler (1 x 10
6) i 3 timer. Analysene ble avsluttet ved vasking av cellene med iskald PBS. Cellene ble deretter fiksert i metanol i 30 min. Fagocytose ble kvantifisert under et fluorescerende mikroskop ved å telle antall intern perler i minst 200 celler, som ble spilt inn som phagocytotic indeksen ved formelen: 100 × (celle nummer med en perle + 3,5 × celle nummer med 2-5 perler + 8 × celle nummer med 6-10 perler + 20 × celle nummer med over 10 perler) /total celle tall. For NO-produksjon, peritonealmakrofager (5 x 10
5) i 100 ul av RPMI inneholdende 10% FBS ble dyrket i 96-brønns plate i 2 timer ved 37 ° C. Celler ble behandlet ved å erstatte med medium (0,5% FBS i 100 ul) og LPS (50 ul av 1 mg /ml) i 18 timer. Nivåene av NO i supernatanten ble analysert ved blanding av det samme volum av supernatanter (100 ul) og Griess-reagens i en ny 96-brønners plate. Platene ble inkubert i 15 minutter ved romtemperatur og avlest ved 570 nm ved anvendelse av en plateleser. Konsentrasjonen av nitritt i kultursupernatanten ble beregnet fra en standardkurve utviklet fra fortynne natriumnitritt i vann ved et konsentrasjonsområde på 0,01 til 100 uM.
Prostaglandin produksjon og COX-2 ekspresjon
95% sammenflytende celler i 24-brønners plater ble behandlet med forskjellige pH-buffere i 9 timer eller 25 timer [31], [32]. Supernatantene ble samlet opp for prostaglandin-analyse ved hjelp av HPLC-massespektrometri (API-4000, Applied Biosystems). I korte trekk, ble prostaglandiner ekstrahert fra cellesupernatanter (500 ul i hver prøve) i nærvær av 14:00 lysofosfatidisk syre (LPA, 10 pmol) som indre standard ved anvendelse av kloroform (2 ml), metanol (2 ml), og HCl (6 N, 10 mL). Ionene med m /z 351 ved (mor- ion) og 271 (datter ion) ble anvendt for identifisering av prostaglandiner. En TARGA C18 5 um, 2,1 mm ID x 10 mm TR-0121-C185 (Higgins Analytical, Southborough, MA USA) HPLC-kolonne ble anvendt, og den mobile fase var MeOH /vann /NH
4OH (90:10: 0,1, v /v /v), 6 min /prøve. Cellepelletene ble samlet for analyse av COX-2 ekspresjon.
Western blot-analyser
Makrofager (10
6) dyrket i 6-brønners plate ble skylt med PBS og stimulert med LPS ( 100 ng /ml), SPC eller LPC (2,5 pM) i 30 minutter. Celler ble lysert i 100 ul av Laemmli prøvebuffer (Bio-Rad, Hercules, CA), ble ekstraktet løst på en 10% SDS-polyakrylamidgel og overført til polyvinylidendifluorid-membran. Membranene ble blokkert i 5% skummet melk i 2 timer og deretter inkubert med primære antistoffer angitte over natten ved 4 ° C. Etter inkubasjon med tilsvarende sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur ble membranene utviklet ved hjelp av en ECL western blotting pluss deteksjonssystem (GE Healthcare, Buckinghamshire UK). Protein lasting ble verifisert ved stripping og reprobing de blotter med antistoffer mot β-actin
.
Syklisk AMP (cAMP) produksjon og celle overlevelse ved forskjellige pH
bukhinnemakrofager ble belagt i 24 -vel plater, som ble behandlet med forskjellige pH-buffere inneholdende fosfodiesterase-inhibitor isobutylmethylxanthine (IBMX, 1 mM) i 30 min, og deretter lysert med 0,1 M HCI (60 ul). Cellelysater ble brukt for cAMP-analysen i henhold til instruksjonene i settet (Cyclic AMP EIA Kit, fra Cayman, Cat # 581001). For overlevelsesanalyser, makrofager eller benmarg-avledede osteoklaster ble platet i 96-brønners plater i 2 timer ved 37 ° C med 5% CO
2 og deretter dyrket i medium ved forskjellige pH-verdier ved 37 ° C med 0% CO
2 i 20 timer.
Bone histomorphometrical og immunhistokjemiske analyser
Bone prøver fra åtte ukers gamle dyr ble fikset i Bouin løsning over natten, decalcified i EDTA (14%) for 12 dager, og i parafin. Delene ble deretter farget med Masson er Trichrome Stain Kit for morfologisk observasjon.
Føflekkreft tumorigenesis
B16-F10 celler ble dyrket i RPMI med 10% FBS. 1 x 10
7 og 5 x 10
5-celler i 100 ul PBS ble injisert subkutant inn i flankene av den blandede bakgrunnen og de rene C57 /BL6 mus bakgrunns, respektivt. Musene ble avlivet da de dukket opp døende (9-14 dager etter injeksjon). Dyret forskning holdt alle relevante føderale retningslinjer og retningslinjer for Laboratory Animal Resource Center ved Indiana University School of Medicine.
Statistiske analyser
Alle data i denne studien ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD av tre eller flere uavhengige forsøk in triplo. Forskjeller mellom behandlingsgruppene ble analysert ved hjelp av Student
t
test og to-tailed distribusjon i Microsoft Excel.
Resultater
Generering av OGR1 mangelfull mus og OGR1 uttrykk i vev
for å studere fysiologiske rollen til OGR1, har vi etablert en OGR1 mangelfull mus belastning. Generering av OGR1 mangelfull mus ble beskrevet i detalj i Materialer og metoder. Den generelle strategi for å konstruere OGR1 målretting vektor ble vist i Figur 1A. Resultatene fra OGR1 genotyping er vist i figur 1B. OGR1 ble uttrykt i lunge, testis, hjerte, hjerne, milt, thymus, brunt fett, tynntarm, tykktarm, perifere blodleukocytter (PBL), makrofager, mage, ovarier, hvitt fett, men ikke i lever, nyre, og skjelettmuskel av de OGR1 FL mus, som påvist ved RT-PCR. OGR1 uttrykk i prostata var svake, men påvisbare (figur 2A). Fullstendig mangel på OGR1 uttrykk i OGR1 KO mus ble bekreftet i alle undersøkte vev. Vi satt en tre-FLAG tag foran OGR1 i knock-in konstruksjonen slik at den endogene OGR1 uttrykk på proteinnivå kan påvises i vev ved hjelp av anti-FLAG M2 antistoff. Immunhistokjemisk farging av lungen av OGR1 FL mus viste at OGR1 ble uttrykt i cuboidal /columar epitelceller som dekker de store luftveiene i lungene og i de vaskulære glatte muskelceller som omgir en stor blodåre (figur 2B). Dette vevet uttrykk mønster av OGR1 var lik den som ble observert i menneskelige vev som demonstrert tidligere [1], [33].
(A) Strategi for å konstruere OGR1 målretting vektor. (B) Genotyping ble utført for å identifisere floxed (FL), – /- (KO) og + /+ (WT) mus
(A) OGR1 uttrykk i ulike vev fra FL og KO mus. påvist ved RT-PCR. PCR programmet var 94 ° C, 2 minutter; 25 sykluser for aktin og 35 sykluser for OGR1 (94 ° C, 30 s ved 55 ° C, 1 min, 72 ° C, 1 min); 72 ° C, 10 min, med unntak av både aktin og OGR1 i makrofager ble amplifisert ved 30 sykluser. BAT, brunt fettvev; BM, benmarg; PBL, perifert blod leukocytter. Pilene viser DNA stiger med 500 bp. (B) OGR1 distribusjon i lungevev fra FL og C57 /BL6 mus. Anti-FLAG M2 antistoff (1:200) ble brukt. Representative positivt fargede celler er angitt med piler. Scale bar = 100 mikrometer.
Generelle fysiologiske analyser av OGR1 KO mus og brunt fettvev (BAT) abnormitet i blandet bakgrunn
OGR1 KO mus var levedyktig og fruktbar. En komplett mus fenotype Undersøkelsen er gjennomført i to par OGR1 KO og OGR1 FL mus (8 uker gamle, en mann og en kvinne i hver gruppe). Kroppsvekt ikke avvike vesentlig blant musene undersøkt. I disse to par av mus, miltene av OGR1 KO mus så ut til å være noe mindre enn for de FL mus, mens lever og hjerte KO mus var noe større enn for de FL mus. Imidlertid har ytterligere analyse i mer mus ikke demonstrere statistiske forskjeller i disse organvekt (data ikke vist). Histologisk analyser i FL og KO avdekket ikke vesentlige forskjeller i de fleste vev, og representative data er vist i Figur 3.
Representanten H E farging av lever, nyre, testikler, prostata, ovarie og uterus ble presentert. Målestokk = 100 um.
Den opprinnelige analyser avslørte også at intrascapular BAT innskuddet var tyngre i den KO (0,35 og 0,28 g) enn den FL (0,10 og 0,11 g) mus, noe som kan være knyttet til endret fedme i KO mus. Konsistente forskjeller i BAT vekt og størrelse ble observert i flere par av FL og KO mus (Figur 4A). H E farging viste at mens de hvite fettvev (WAT) fra FL og KO-mus var tilsvarende, BAT fra KO mus var mindre tetthet i forhold til dem fra Fl-mus (figur 4B), som kan være forbundet, delvis, til forstørret størrelse av BAT i OGR1 KO mus.
(A) Brown fettvev i KO mus var større enn de i FL mus. (A) vekt på BAT (9 mus fra FL og 9 mus fra KO). (B) Representant utseendet BAT fra FL og KO mus. (B) H E farging av BAT og WAT i FL og KO mus. * Representerer en
P
verdien av 0,05, og *** representerer en
P
verdien av 0,001. Målestokk = 100 um.
OGR1 har vist seg å ha proton-føle aktivitet i forskjellige celler [3], [6], [9], [34]. I tillegg kan SPC modulere OGR1 handlinger [6], [9]. SPC er blitt vist å indusere proliferasjon av human adipose vev-avledede stamceller via aktivering av c-Jun N-terminal kinase (JNK) [35]. For å teste om BAT fra FL og KO-mus reagerer forskjellig pH-verdi og /eller SPC, isolerte vi BADCs og testet effekten av SPC eller pH-endringer på celleproliferasjon. SPC (2,5 mm) beskjedent stimulert celleproliferasjon på 24 timer og denne effekten var ikke signifikant forskjellig i BADCs fra FL versus KO mus (figur 5A). Sur pH indusert lavere spredning enn den fysiologiske pH (7,4), og igjen ingen statistisk forskjell ble observert i BADCs fra FL
vs.
KO mus (figur 5B). Vi har backcrossed OGR1 mangelfull mus til C57 /BL6 bakgrunn (10 generasjoner). Når vi undersøkte BAT i WT og KO mus i C57 /BL6 bakgrunn, ble det ikke observert forskjell (data ikke vist), noe som tyder på at BAT unormalt er relatert til musen bakgrunnen.
(A) SPC stimulert spredning var ikke signifikant forskjellig i BAT fra FL
vs.
KO mus. SPC (2,5 pM) eller LPC (2,5 uM) ble anvendt. (B) Effekten av pH på spredning var ikke signifikant forskjellig i FL
vs.
KO. Resultatene i denne figur er representative for minst 3 uavhengige eksperimenter. * Representerer en
P
verdi. 0,05
OGR1 mangel redusert makrofag produksjon i mus av blandet bakgrunn
mikroskopisk undersøkelse av vev ikke avsløre (B).
