Abstract
Syntetiske triterpenoids er antioksidant betennelse modulatorer (mål) som viser bred anticancer aktivitet. AIMS binde seg til KEAP1 og hemme dens evne til å fremme NRF2 degradering. Som et resultat, øker NRF2 transkripsjon av gener som gjenoppretter redoks-balanse og reduserer inflammasjon. AIMS hemme tumorvekst og metastase ved å øke NRF2 aktivitet i tumormikromiljøet, og ved å modulere aktiviteten av onkogene signaliseringsreaksjonsveier, inkludert NF-kB, i tumorceller. Samle bevis tyder på at KEAP1 tap eller mutasjons som resulterer i høye nivåer av vedvarende NRF2 aktivitets kan fremme kreft vekst og øke chemoresistance. Tap av KEAP1 øker også nivåene av andre onkogene proteiner, inkludert IKKβ og BCL2. Den tilsynelatende overlevelse fordel gitt til noen kreftceller ved tap av funksjonelle KEAP1 reiser spørsmålet om farmakologisk hemming av KEAP1 kan fremme tumorvekst. For å løse dette problemet, vi preget basalnivåer KEAP1 og NRF2 i et panel av humane tumorcellelinjer og profilert aktiviteten til en AIM, RTA 405. Vi fant at i tumorcellelinjer med lav eller mutant KEAP1, og i
Keap1
– /-
murine embryonale fibroblaster, ble flere KEAP1 mål inkludert NRF2, IKKβ, og BCL2 forhøyet.
Keap1
– /- murine embryonale fibroblaster hadde også høyere forekomst av spredning og kolonidannelse enn sine vill type kolleger. I celler med funksjonell KEAP1, RTA 405 økte NRF2 nivåer, men ikke IKKβ eller BCL2 nivåer, og ikke øke celleproliferasjon eller overlevelse. Videre RTA 405 hemmet veksten i samme konsentrasjoner i celler med forskjellige basal NRF2 aktivitetsnivå og i celler med villtype eller mutant
KRAS
. Til slutt, før behandling med RTA 405 ikke beskytte tumorceller fra doxorubicin- eller cisplatin-mediert veksthemming. Sammen er disse dataene viser at farmakologisk aktivering av NRF2 av målene er forskjellig fra genetisk aktivering og gir ikke en vekst eller overlevelse fordel til kreftceller
Citation. Probst BL, McCauley L, Trevino jeg, Wigley WC, Ferguson DA (2015) kreft celle vekst differensielt påvirket av konstitutiv aktivering av NRF2 av KEAP1 Sletting og Farmakologisk Aktivering av NRF2 av syntetisk triterpenoid, RTA 405. PLoS ONE 10 (8): e0135257. doi: 10,1371 /journal.pone.0135257
Redaktør: Irina V. Lebedeva, Columbia University, USA
mottatt: 17 desember 2014; Godkjent: 20 juli 2015; Publisert: 24 august 2015
Copyright: © 2015 Probst et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:.. Dette arbeidet ble finansiert av Reata Pharmaceuticals som hadde en rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, og utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser: forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikter: Alle forfatterne er nåværende eller tidligere ansatte i Reata Pharmaceuticals. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Syntetiske oleanane triterpenoids som bardoxolone metyl og RTA 408, er antioksidant betennelse modulatorer ( AIMS) som utviser bred antitumor aktivitet i modeller av kreft forebygging og behandling [1, 2], og er godt tolerert hos pasienter med utbredt kreftsykdom [3]. Det primære målet av målene er Kelch lignende ECH-assosiert protein 1 (KEAP1), et substrat adapter protein for CUL3-RBX1 E3 ubiquitin ligase kompleks. Under normale forhold, letter KEAP1 den ubiquitinering av dets substrat-proteiner, noe som fører til deres nedbrytning ved proteasomet [4]. En av disse substrater er transkripsjonsfaktor nukleær faktor (erythroid-avledet 2) -lignende 2 (NFE2L2), også kjent som NRF2. AIMS potent øke NRF2 aktivitet ved å binde seg til en sensor cysteinrest (C151) i KEAP1, forårsaker en konformasjonsendring som gjør KEAP1 klarer å fremme NRF2 degradering [5-8]. NRF2 akkumulerer og går inn i kjernen hvor det øker uttrykket av antioksidant respons element (ER) -inneholdende målgener. Produktene av disse genene omfatter antioksidant og cytobeskyttende proteiner, som gjenoppretter cellulære redoks balanse og reduserer inflammasjon. Følgelig har som mål demonstrert brede anti-inflammatoriske og cytobeskyttende aktivitet i mange dyremodeller, samt i klinikken [9, 10].
Økningen i antioksidant og anti-inflammatorisk aktivitet som forekommer ved behandling med sikter reduserer tumortilfeller og belastning i for kjemiske stoffer, og genetisk-induserte modeller av kreftutvikling [11-14]. Likeledes, har som mål å redusere oksidativt stress og inflammasjon i mikromiljøet av etablerte tumorer og hemme tumorvekst, metastase, angiogenese, og tumor-medierte immun-suppresjon [15-20]. Tar også sikte på direkte hemme spredning og indusere apoptose i tumorceller [1, 2, 21, 22]. Selv om den mekanisme som ligger til grunn den direkte anticancer virkning tar sikte på tumorceller ikke er fullstendig forstått, er det kjent som tar sikte på å modulere aktiviteten av flere kreft-relaterte proteiner, inkludert cyklin D1 [12, 23], CDKN1A (p21) [23], JAK1 og STAT3 [24, 25]., HER2 [26], og nukleær faktor kappa B (NF-kB) [27-29]
Selv om NRF2 spiller en rolle i anticancer svulsten mikromiljøet, har det vært foreslått å ha motsatt effekt i ondartede celler [30, 31]. Nye genetiske analyser av humane tumorer har vist at mutasjoner i
KEAP1
eller
NRF2
-som resultat i høye nivåer av vedvarende NRF2 aktivitets er assosiert med økt spredning, chemoresistance, og dårlig overlevelse [30 ; 31]. Andre mekanismer for NRF2 aktivering har også blitt identifisert, inkludert redusert
KEAP1
uttrykk på grunn av arrangøren hypermethylation eller miRNA uttrykk [32-34] og økt uttrykk av
NRF2
skyldes aktiverte onkogener, for eksempel KRAS [35]. Det har blitt foreslått at forhøyede NRF2 aktivitet gir en overlevelsesfordel til tumorceller ved å øke antioksidant nivåer for å styre overskytende reaktive oksygenarter (ROS) og reaktive nitrogenforbindelser (RNS), som er felles for kreft [35]. Disse observasjonene reise spørsmålet om hvorvidt farmakologiske midler som aktiverer NRF2 via KEAP1 hemming kan fremme kreft vekst eller øke terapeutisk motstand [31; 36; 37]. Dette spørsmålet er spesielt viktig gitt potensialet for NRF2 aktivatorer for å forebygge og behandle en rekke kroniske inflammatoriske og autoimmune sykdommer [38-40].
I samsvar med den generelle anticancer aktivitet av målene, er det ingen bevis for at disse forbindelsene øke forekomsten av kreft i dyremodeller [36, 37]; heller, det er sterke bevis for det motsatte [1, 31]. Derfor genetisk induksjon av NRF2 ved tap av KEAP1 funksjon synes å ha en annen effekt enn AIM-mediert aktivering av NRF2 via KEAP1 hemming på tumorvekst. Men begge de NRF2 avhengige effekter på tumormikromiljøet og NRF2 uavhengig effekt på tumorcellene sannsynligvis bidrar til anticancer aktivitet av målene in vivo. Så vidt vi vet, er effekten av AIM-mediert NRF2 induksjon på spredning, overlevelse, og kjemosensitivitet av isolerte tumorceller har tidligere ikke blitt vurdert.
For å evaluere effekten av AIM-mediert NRF2 induksjon på tumorcellevekst og overlevelse, må vi først preget basalnivået NRF2 aktivitet i et panel av kreftcellelinjer for å identifisere de som hadde en vill-type KEAP1-NRF2 aksen (dvs. lave basal NRF2 nivåer), og de som hadde en dysfunksjonell KEAP1-NRF2 aksen (dvs., høye basal NRF2 nivåer). Med denne informasjonen, vurderte vi anticancer aktivitet av en AIM, RTA 405 (CDDO-etyl amid) [8, 11, 41-47] i tumorcellelinjer hvor NRF2 aktivitet kan bli indusert (dvs. de med en villtype KEAP1 -NRF2 akse) sammenlignet med tumorcellelinjer der NRF2 aktivitet allerede var på sitt maksimale nivå (dvs. forhøyet NRF2 aktivitet på grunn av tap av KEAP1 funksjon). For å direkte sammenligne effektene av tap av KEAP1 funksjon til effekten av farmakologisk KEAP1 hemming, vi behandlet villtype (WT) og
Keap1
– /- murine embryonale fibroblaster med RTA 405 og vurderes spredning og overlevelse, samt nivåene av IKKβ og BCL2-to andre KEAP1 underlag som har kreftfremmende aktiviteter. Vi evaluerte også effekten av RTA 405-mediert aktivering NRF2 på KRAS-indusert proliferasjon og følsomheten av tumorcellelinjer til andre kjemoterapeutika. Til sammen resultatene fra denne studien viser at NRF2 induksjon av målene ikke øker cellulær proliferasjon eller overlevelse, og at nedstrøms effekten av farmakologisk KEAP1 hemming av målene er forskjellige fra de som følge av tap av funksjonelle KEAP1 i tumorceller.
Materialer og metoder
Material
RTA 405 (2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9 (11) -dien-28-syre etyl amid) og RTA 402 (metyl-2-cyano-3,12-dioxoolean-1,9-dien-28-oat) ble syntetisert ved Reata Pharmaceuticals, Inc. (Irving, TX USA). Hvis ikke er angitt, ble alle andre kjemikalier innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis MO, USA). Villtype og
Keap1
– /- murine embryoniske fibroblaster (MEFs) ble oppnådd fra Dr. Masayuki Yamamoto (Tohoku University, Japan) [48, 49]. LSL-Kras
G12D MEFs ble hentet fra Dr. Tyler Jacks (Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA) [50]. Alle andre cellelinjer som er benyttet i denne undersøkelsen var fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA USA). ATCC bruker kort tandem repeat (STR) analyse for å skjerme alle humane cellelinjer for ekthet og renhet før distribusjon. Alle cellelinjer ble passert for mindre enn seks måneder etter gjenoppliving.
Cell kultur
MEFs, MCF-7, Panc-1, A549, og HeLa-celler ble dyrket i Dulbeccos Modified Eagle Medium ( DMEM), SK-N-SH celler i Eagle er Minimum Essential medium (EMEM), og G-361 celler i McCoys 5A medium. DMEM og McCoys 5A medium ble hentet fra Life Technologies, Grand Island, NY USA. EMEM ble oppnådd fra ATCC, Manassas, VA, USA. Alle andre cellelinjer ble dyrket i RPMI 1640-medium (Life Technologies). Kulturmediet ble supplert med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin. FBS brukes i kulturen LSL- Kras
G12D MEFs ble varme inaktivert. Cellelinjer ble dyrket i nærvær av 5% CO
2 ved 37 ° C.
Cell vekst og klonogene analyser
For celletelling eksperimenter, MEFs (5 x 10
4 celler /brønn) ble sådd ut i 6-brønners retter, behandlet med RTA 405 neste dag, og regnet på ulike tidsintervaller ved hjelp av en Vi-cELL XR celle analysator (Beckman Coulter, Indianapolis, iN USA). For klonogene analyser, vill-type (1 x 10
3 celler /brønn) og
Keap1
– /- (0,5 x 10
3 celler /brønn) MEFs ble sådd i 6 -vel retter og 6 timer senere, behandlet med RTA 405. Etter syv dager, kolonier ble løst (1: 7 eddiksyre: metanol) og farget med 0,5% krystallfiolett i metanol. Kolonier av ≥50 celler ble talt opp.
For å bestemme IC
50 og GI
50 verdier, celler ble sådd ut i 96-brønners plater og behandlet med RTA 405 ved konsentrasjoner i området 50-1000 nM . Cellevekst ble vurdert ved hjelp av sulforhodamin B (SRB) analyse [51]. I korte trekk, 50 ul iskald 50% (w /v) trikloreddiksyre ble tilsatt til hver brønn og platene ble inkubert ved 4 ° C i 1 time. De faste Cellene ble deretter vasket fem ganger med vann fra springen og lufttørket over natten. Den følgende dag ble cellene farget med 0,4% (w /v) SRB i 1% eddiksyre ved romtemperatur i 20 minutter. Fargede celler ble deretter vasket fem ganger med 1% eddiksyre og lufttørket. SRB fargestoff ble solubilisert ved tilsetning av 200 ul 10 mM Tris Base, og absorbansen ble målt ved 490 nm. For IC
50 besluttsomhet, ble celleviabilitet vurdert etter 48 timer med vekst. For GI
50 bestemmelse, ble cellene i en plate festet ved starten av eksperimentet (tid 0) og celler i et duplikat plate ble behandlet med RTA 405 i 72 timer. Prosentandelen av vekst av RTA 405-behandlede celler i forhold til bærer-behandlede cellene ble beregnet ved anvendelse av følgende ligning: [(T
iT
z) /(CT
z)] x 100, hvor (T
z) er absorbansverdien ved tid null, (C) er absorbansverdi fra bærer-behandlede brønner etter 72 timer, og (T
i) er absorbansverdien fra brønner behandlet med medikamentet. For kombinasjons eksperimenter med doksorubicin eller cisplatin,-celler ble forbehandlet med RTA 405 i 2, 6 eller 24 timer og deretter behandlet med doksorubicin eller cisplatin i ytterligere 72 timer. IC
50 og GI
50 verdier ble bestemt fra dose-responskurver ved hjelp GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA USA).
Sanntids revers transkripsjon PCR
Total RNA ble isolert fra celler med RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD USA) og revers transkribert ved hjelp Hevet II (Life Technologies). PCR-reaksjoner ble utført ved anvendelse av primere validert for spesifisitet og forsterkningsvirkningsgrad. Revers transkripsjon og PCR syklus informasjon finnes i S1 Protokoller og PCR-primer sekvenser er gitt i S1 tabell.
Ribosomalt protein S9 product: (
RPS9
) og
ribosomalt protein L19 product: (
Rpl19
) ble brukt som referanse gener for mennesker og mus prøver, henholdsvis. Den relative overflod av hvert mål genet ble bestemt ved hjelp av komparative Ct-metoden (ΔΔCt) [52].
KEAP1 Hotell og
NRF2
sekvense
Genomisk DNA ble isolert fra celler ved hjelp av DNeasy kit (Qiagen). PCR forsterkning og sekvensering av koding eksoner av
KEAP1 Hotell og exon 2 av
NRF2
ble utført ved hjelp av primere som tidligere beskrevet [53, 54]. PCR-produkter ble renset ved hjelp QIAquick PCR rensing kit (Qiagen) og sekvensert ved Sequetech Corporation (Mountain View, CA USA). Alle mutasjoner ble bekreftet ved sekvensering i begge retninger.
Western blotting
Eksperimentelle detaljer for utarbeidelse av helcellelysater og atom ekstrakter er i S1 Protokoller. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved bruk av DC-proteinanalyse (Bio-Rad, Hercules, CA USA). Proteiner (20 til 40 ug) ble oppløst ved SDS-PAGE, og overført til nitrocellulosemembraner. Membraner ble inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C. Antistoff informasjon er gitt i S2 tabell. Pepperrot-konjugert sekundære antistoffer var fra Jackson Immunoresearch (West Grove, PA USA).
ROS og glutation analyser
Basal ROS-nivåene ble målt ved hjelp av CM-H
2DCFDA (Molecular Probes , Eugene, OR USA). Totalt glutation nivåene ble målt ved hjelp av GSH-Glo Glutathione Assay (Promega, Madison, WI USA). Glutationnivåer ble normalisert til cellulære proteinnivåer ved hjelp av SRB-analysen. For å kontrollere for variabilitet mellom eksperimenter, basal ROS og total glutation nivå for hver cellelinje var normalisert til NCI-H460 (innstilt til en verdi på 1). Ytterligere eksperimentelle detaljer for ROS og glutation analyser kan finnes i S1 Protocols.
Caspase-3/7-aktivitet
Caspase-3/7-aktivitet ble bestemt som tidligere beskrevet [55] med DEVD- AFC (EMD Biosciences, Billerica, MA USA) som substrat. For å kontrollere for variasjon mellom eksperimenter, fluorescens av hver prøve ble normalisert til 786-0 (satt til en verdi av 100).
siRNA
A549, DU 145, og NCI-H460-celler ble omvendt transfektert i OptiMem med Lipofectamine RNAiMax (Life Technologies, Grand Island NY USA) og 20 nM siNRF2 eller 20 nM siNTPool (GE Dharmacon, Lafayette, CO USA), L-003755-00-0005 og D-001810-10-05 , henholdsvis). Mock prøvene fikk ikke siRNA. Celler ble sådd ut i 24-brønners plater i en tetthet på 4 x 10
5 (A549 og DU 145) eller 8 x 10
5 (NCI-H460) celler pr brønn eller på 96-brønns plater ved en densitet på 8 x 10
3 (A549 og DU 145) eller 1,6 x 10
4 (NCI-H460) celler per brønn i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS. Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med DMSO eller RTA 405. Etter 0, ble 24, 48 og 72 timer celler i 96-brønners platene fiksert med 50% TCA og behandlet for SRB-analyse som beskrevet ovenfor. Etter 72 timer ble cellene i 24-brønners plater vasket med steril PBS og høstet i lyseringsbuffer for vestlige blotter.
LSL-Kras
G12D murine embryonale fibroblaster
rekombinasjon av Kras
LSL-G12D allel ble utført
in vitro
bruker en selv excising Cre rekombinase. MEFs ble infisert med 500-1000 MOI av modellen, Ad-EGFP eller Ad-Cre /EGFP (GeneCopoeia, Rockville, MD USA) adenovirus partikler i henhold til produsentens protokoll. Cellene ble høstet 72 timer etter infeksjon. Genomisk DNA ble isolert ved hjelp av DNeasy Blood imidlertid har status av KEAP1 og den basale aktivitet av NRF2 blitt rapportert for meget få felles cancerlinjer [34; 48; 56]. Derfor, for å evaluere effekten av RTA 405, vi først gjennomført en serie forsøk for å karakterisere status til KEAP1 og NRF2 i et panel av tyve humane tumorlinjer (tabell 1). For å oppnå dette, har vi sekvensert alle koding eksoner av
KEAP1 Hotell og exon 2 av
NFE2L2
å avgjøre om noen av cellelinjene hadde mutasjoner i disse genene. Vi begrenset
NFE2L2
sekvense til ekson 2 fordi det koder KEAP1-samspill domene og har tidligere vært vist til båtplass aktiverende mutasjoner [30; 53]. Våre sekvense resultatene bekreftet tidligere identifiserte
KEAP1
mutasjoner i A549 og NCI-H460-ikke-småcellet lungekreft cellelinjer [54] og identifisert en ny mutasjon (Q193H) i NCI-H23 cellelinje, noe som er også avledet fra ikke-småcellet lungekreft (tabell 1). Vi fant ingen mutasjoner i ekson 2 av
NFE2L2
i dette panelet av cellelinjer.
I tillegg til
KEAP1 Kjøpe og
NFE2L2
mutasjoner , andre mekanismer, for eksempel promoter hypermethylation, miRNA uttrykk, og onkogene signalise-kan resultere i høye konstituerende nivåer av NRF2 aktivitet [32-35]. For å finne ut om noen av cellelinjene uten
KEAP1
eller
NFE2L2
mutasjoner hadde høye basale nivåer av NRF2 aktivitet, vi målte KEAP1, kjernekraft NRF2, og NQO1 (en proto NRF2 mål gen) protein nivåer av western blot. Vi fant ut at, til tross for at villtype
KEAP1 Hotell og
NFE2L2
gener, flere av cellelinjene hadde kjennetegn ved forhøyet NRF2 aktivitet. For å lette analysen, gruppert vi cellelinjene inn i tre kategorier: de med lav, moderat eller høy basal NRF2 aktivitet (figur 1A, beskåret blotter er i S1 figur). I cellelinjer med lav basal NRF2 aktivitet (
n
= 8), aktiviteten av KEAP1 viste seg tilstrekkelig til å fremme NRF2 degradering, noe som resulterer i lave nivåer av NQO1 (figur 1A og 1B, øvre paneler). I cellelinjer med moderat basal NRF2 aktivitet (
n
= 5), vill-type KEAP1 var påvisbart, men det viste seg å være utilstrekkelig for fullstendig å undertrykke NRF2 aktivitet, noe som resulterer i påvisbare nivåer av NQO1 (figur 1A og 1B , mellompaneler). Cellelinjer med høy basal NRF2 aktivitet (
n
= 7) hadde enten mutante eller lave nivåer av KEAP1, som så ut til å gjøre den ute av stand til å målrette NRF2 for nedbrytning (figur 1A og 1B, nedre paneler). Som et resultat, ble høye nivåer av kjerne NRF2 og NQO1 påvist i disse cellelinjene.
A. Prinsippskisse som viser egenskapene til cellelinjer med lav (øvre panel), moderat (midtre panelet) eller høy (nedre panel) basal NRF2 aktivitet. B. Protein nivåer av KEAP1 og NQO1 (hel-celle lysat), og NRF2 (atom fraksjon), ble evaluert av western blot. Actin (hel-celle lysat) og HDAC2 (atom fraksjon) tjente som lasting kontroller. Basert på KEAP1, NRF2, og NQO1 proteinnivåer, ble cellelinjer kategorisert i henhold til deres basal NRF2 aktivitet
De fleste av cellelinjer kan kategoriseres i en av de tre gruppene.; Men noen besatt egenskapene til mer enn én gruppe. For eksempel, sammenlignet med andre cellelinjer i det lave basal NRF2 aktivitet gruppe, SK-N-SH linje hadde forholdsvis lave nivåer av KEAP1 (figur 1B, øvre panel). Men basert på de lave nivåene av kjernefysisk NRF2 og NQO1, de KEAP1 nivåer i denne linjen syntes å være tilstrekkelig til å fremme NRF2 degradering. Motsatt, når sammenlignet med andre cellelinjer i høy basal NRF2 delplan, NCI-H460 linjen hatt relativt høye nivåer av KEAP1 (figur 1B, lavere panel). Det er imidlertid kjent at
KEAP1
er mutert (D236H) i NCI-H460-celler og at NRF2 er konstitutivt aktiv [54]. Til tross for svært høye nivåer av atom NRF2 i A498-cellelinjen, ble forholdsvis lave nivåer av NQO1 detektert. Men denne cellelinjen viste en rekke andre egenskaper som var i samsvar med høy basal NRF2 aktivitet (se nedenfor); noe som antyder at NQO1 selv kan gå tapt eller mutert. Til slutt, selv om KEAP1 var mutant (Q193H) i NCI-H23 cellelinje (tabell 1), NRF2 aktivitet så ut til å være lav, noe som tyder på at den Q193H mutasjon kan være en polymorfisme som ikke reduserer KEAP1 funksjon. Dette er konsistent med resultatene fra en fersk studie der fire av 18 KEAP1 mutasjoner identifisert i lungekreft prøver ikke svekke evnen til KEAP1 å fremme NRF2 degradataion [57].
Karakterisering av humane tumorcellelinjer med ulike nivåer basal NRF2 aktivitet
for ytterligere å validere klassifisering av cellelinjer, vi målte nivåene av andre biomarkører for NRF2 aktivitet, inkludert
NQO1
mRNA, ROS, og glutathione nivåer. Som nevnt ovenfor,
NQO1
er en prototypisk NRF2 målgen, og man kan forvente dens transkripsjon for å være forhøyet i cellelinjer med høy basal NRF2 aktivitet. Når sammenlignet med cellelinjer med lav basal NRF2 aktivitet, de med moderat og høy basal NRF2 aktivitet hadde suksessivt høyere nivåer av NQO1 ekspresjon (Fig 2A og S2 Fig). I tillegg til
NQO1
, NRF2 også regulerer uttrykket av flere gener som er involvert i glutation syntese og øker mobilnettet glutation nivå [58]. I samsvar med dette ble total glutation nivåer betydelig forhøyet i cellelinjer med høy basal NRF2 aktivitet sammenlignet med de med lav eller moderat basal NRF2 aktivitet (figur 2B og S2 fig). Ved å øke nivåer av glutation, så vel som ekspresjon av andre gener antioksidanter, reduserer NRF2 oksidativt stress. For å vurdere graden av oksidativt stress i hver tumor cellelinje, målte vi ROS-nivåer ved hjelp av en fluorescerende probe. Vi fant at ROS-nivåer var lavest i de cellelinjer med høy basal NRF2 aktivitet (figur 2C og S2 Fig). Derfor, i sammendraget, cellelinjer med høy basal NRF2 aktivitet hadde høyt NQO1 mRNA nivåer, høye nivåer av glutation, og lave ROS nivåer. Videre NQO1 og nivåer av glutation økte i forhold til nivået av basal NRF2 aktivitet. I motsetning til dette ble ROS-nivåer ikke følge en lignende trend: det var ingen forskjell mellom cellelinjer med lave og moderate NRF2 aktivitetsnivå. Dette tyder på at moderat aktivering av NRF2 er tilstrekkelig til å øke mål-genekspresjon og glutation syntese, men NRF2 aktivitet må nå en viss terskel, som bare kan oppnås når KEAP1 er fraværende eller inaktive, for å redusere ROS-nivåer.
A.
NQO1
mRNA nivåer for individuelle cellelinjer ble målt ved qPCR og normalisert til gjennomsnittlig basal
NQO1
nivå for alle cellelinjer med lav basal NRF2 aktivitet. B. Total glutationnivåer for individuelle cellelinjer ble normalisert til NCI-H460 (innstilt til en verdi på 1), som ble kjørt som en referanse i hvert eksperiment. Verdier som er angitt ble normalisert til den gjennomsnittlige basal glutation nivå for alle cellelinjer med lav basal NRF2 aktivitet. C. Reaktive oksygenarter (ROS) nivåer for individuelle cellelinjer ble normalisert til NCI-H460 (innstilt til en verdi på 1), som ble kjørt som en referanse i hvert eksperiment. Verdier vist var normalisert til gjennomsnittlig basal ROS nivå for alle cellelinjer med lav basal NRF2 aktivitet. D-E. Basal IKKβ (D) og BCL2 (E) protein nivåer i humane tumorcellelinjer med lav, moderat eller høy basal NRF2 aktivitet. Feilfelt i A-C er SEM. Statistisk signifikans ble bestemt av Mann-Whitney test. *,
P
0,05; **
P
0,01; ***,
P
. .001
I tillegg til NRF2, KEAP1 regulerer nivåene av andre proteiner, inkludert IKKβ og BCL2 [59; 60]. KEAP1 binder direkte til, og letter ubiquitinering av IKKβ og BCL2 av CUL3 /RBX1 E3 ligase kompleks. Dette fører til degradering av IKKβ og BCL2 av proteasomet. Følgelig, tap av KEAP1 i cellelinjer fører til forhøyede nivåer av IKKβ og BCL2 [59, 60] er, og IKKβ nivåer forhøyet i humane tumorer med lave KEAP1 /CUL3 nivåer [59, 61]. IKKβ er en kinase som fremmer nedbrytning av kjernefysiske faktor kappa lys polypeptid genet forsterker i B-celler inhibitor, alfa (NFKBIA eller IκBα), en suppressor av NF-kB transkripsjonsfaktor som styrer uttrykket av mange gener som er involvert i å overleve, og BCL2 er et onkogen med anti-apoptotiske aktivitet. Gitt forholdet mellom KEAP1, IKKβ, BCL2, og kreft, undersøkte vi om tumorcellelinjer med høy basal NRF2 aktivitet også hadde forhøyet IKKβ og BCL2 proteinnivåer. Vi har funnet at mange cellelinjer i panelet hadde en tendens til å ha høye nivåer av IKKβ (S3 Fig). Imidlertid IKKβ nivåer ble forhøyet i 100% av cellelinjer med høy basal NRF2 aktivitet, sammenlignet med 80% av cellelinjene med moderat NRF2 aktivitet, og 62,5% av cellelinjer med lav NRF2 aktivitet (figur 2D). Da vi undersøkte BCL2, fant vi at færre av cellelinjene hadde forhøyet BCL2 nivåer (S3 fig). I cellelinjer med høy basal NRF2 aktivitet, 71% hadde også høye nivåer BCL2, sammenlignet med 37,5% og 20% av cellelinjer med lav og middels NRF2 aktivitet, respektivt. Som glutation nivå, IKKβ nivåene økt i forhold til nivåene av basal NRF2 aktivitet, mens BCL2 nivåer ble forhøyet i en større fraksjon av cellelinjer som hadde høy NRF2 aktivitet, sammenlignet med de med lav eller moderat NRF2 aktivitet. Dette tyder på at ulike KEAP1 substrater kan ha forskjellige følsom endringer i KEAP1 funksjon. Samlet utgjør disse dataene er konsistente med forestillingen om at tapet av KEAP1 påvirker flere mål som er relevante for kreftcellebiologi, inkludert ikke bare NRF2, men også IKKβ og BCL2 [62].
IKKβ og BCL2 nivåer i
Keap1
– /- murine embryonale fibroblaster
Vi har vist at nivåene av IKKβ og BCL2 en tendens til å være høyere i tumorcellelinjer som har høy basal NRF2 aktivitet, noe som tyder på at mutant eller lav /fraværende nivåer av KEAP1 kan bidra til forhøyede IKKβ og BCL2 nivåer. Vi neste brukte villtype (WT) og
Keap1
– /- murine embryonale fibroblaster (MEFs) som en modell for å vurdere forholdet mellom KEAP1, IKKβ, og BCL2 nivåer direkte. Som tidligere rapportert [49], NRF2 ble forhøyet i
Keap1
– /- MEFs (S4 Fig). Behandling med RTA 405 økt NRF2 nivåer i WT MEFs, men ikke i
Keap1
– /- MEFs (S4 Fig). I samsvar med NRF2 aktivering, protein (A) og mRNA (Fig 3B) nivåer av NQO1 og GCLM, to NRF2 målgener, ble forhøyet i
Keap1
– /-
MEFs . I tillegg til forhøyede nivåer av NRF2 og nedstrøms målgener, fant vi også at nivåene av IKKβ og BCL2 var høyere i
Keap1
– /- MEFs enn i WT MEFs (fig 3A). For å bestemme hvorvidt de forhøyede nivåene IKKβ korrelert med en økning i aktiviteten, vi vurdert nivåene av nedstrøms komponenter av NF-kB signalveien. IKKβ fosforylerer IκBα, noe som fører til dets nedbrytning og påfølgende aktivering av NF-kB transkripsjonsfaktor. I samsvar med høyere IKKβ aktivitet, vi observerte lavere nivåer av IκBα (figur 3A) og signifikant høyere uttrykk nivåer av flere NF-kB målgener, inkludert
Ccnd1
,
Mmp9
,
Ptgs2
,
VEGF
,
og Bcl2l1
, i
Keap1
– /- MEFs sammenlignet med WT MEFs (fig 3C og S5 fig). Det var ingen signifikante forskjeller i
2CCl
,
Birc3
eller
Il1b
nivåer, og av ukjente årsaker
Ccl5
nivåene var signifikant høyere i WT MEFs enn i
Keap1
– /- MEFs (S5 Fig). Tatt sammen, disse resultater viser at tapet av KEAP1 resulterer i høyere IKKβ og BCL2 nivåer, og at det forhøyede nivå av IKKβ fører til en økning i NF-kB transkripsjonen aktivitet. Disse resultatene er i overensstemmelse med den observasjon at tapet av KEAP1 ble korrelert med høyere NF-kB transkripsjonen aktivitet i humane tumorer [61].
A. Basale nivåer av KEAP1-samspill proteiner og nedstrøms mål ble evaluert i WT og
Keap1
– /- MEFs av western blot. GAPDH fungerte som en lasting kontroll. B. Basal mRNA nivåer av
Nqo1 Hotell og
Gclm
i WT og
Keap1
– /- MEFs målt ved qPCR. mRNA nivåer i
Keap1
– /- celler ble normalisert til WT celler. *,
P
0,05; **
P
0,01 vs. WT av paret t-test. C. Basal mRNA nivåer av
Ccnd1
,
Mmp9
,
Ptgs2
, og
VEGF
i WT og
Keap1
– /- MEFs målt ved qPCR. mRNA nivåer i
Keap1
– /- celler ble normalisert til WT celler. ***,
P
0,001; ****,
P
0,0001 vs. WT av t-test. For alle paneler, datapunkter er gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter. Feilfelt er SD
Vekstraten for celler med ulike nivåer av basal NRF2 aktivitet
Tap av KEAP1 har blitt rapportert å øke spredning rate av MEFs. [48, 63]. For å bekrefte og utvide disse studiene, vi telles antall levedyktige WT og
Keap1
– /- MEFs ved 24-timers mellomrom etter seeding. 0,01; 0,0001. 0,05; 0,01; 0,0001; 0,01; 0,001. 0,05; 0,05; 0,001; 0,05; 0,01;
