Abstract
lysyl oxidase (LOX) har vist seg å både fremme og undertrykke tumorprogresjon, men dens rolle i prostata cancer er stort sett ukjent. LOX immunoreaktivitets ble scoret i prostata svulst epitel, tumor stroma og i svulsten-tilstøtende ikke-ondartet prostata epitel og stroma. LOX score i svulsten og ikke-maligne prostata vev ble deretter undersøkt for mulige sammenhenger med kliniske egenskaper og overlevelse i en historisk kohort av mennene som ble diagnostisert med prostatakreft ved transurethral reseksjon og etterfulgt av vaktsom venter. Menn med lav LOX score i den ikke-ondartet prostata epitel hadde signifikant lengre kreft spesifikk overlevelse enn menn med en høy score. Videre LOX poengsum i ikke-ondartet prostata epitel forble prognostisk i en multivariabel analyse inkludert Gleason score. LOX score i prostata svulst epitel positivt korrelert til Gleason score og metastaser, men var ikke assosiert med kreft overlevelse. LOX score i svulsten og ikke-ondartet prostata stroma dukket ikke er relatert til disse tumoregenskaper. I radikal prostatektomi prøver, LOX immunfarging tilsvarte LOX in-situ hybridisering og LOX mRNA-nivåer ble funnet å være lik mellom tumor og tilstøtende ikke-maligne områder, men signifikant økt i benmetastaser prøver. LOX nivåer både i svulster og i de omkringliggende tumor bærende organ er tilsynelatende knyttet til prostatakreft aggressivitet
Citation. Nilsson M, Hägglöf C, Hammarsten P, Thysell E, Stattin P, Egevad L, et al. (2015) Høy lysyl oksidase (LOX) i ikke-maligne prostata Epitel Spår et dårlig resultat i Prostate Cancer Patient Managed by vaktsom venter. PLoS ONE 10 (10): e0140985. doi: 10,1371 /journal.pone.0140985
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 6 august 2015; Godkjent: 02.10.2015; Publisert: 26 oktober 2015
Copyright: © 2015 Nilsson et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Vetenskapsrådet (65X-05935-32-3, https://www.vr.se/inenglish.4.12fff4451215cbd83e4800015152.html) , Den svenske Cancer Foundation (CAN 2013/327, https://www.cancerfonden.se/sv/Information-in-English/), The Lions Cancer Research Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
prostatakreft er generelt multifokal og heterogene og deres naturhistorie varierer fra ufarlig til dødelig. Nåværende avbildningsmetoder kan ikke i tilstrekkelig grad detektere prostatakreft, i stedet flere nålbiopsier, prøvetaking mindre enn 1% av prostatavolum, er tatt fra prostata for å identifisere ondartet tumorvevet. Tumor-holdige biopsier, forhåpentligvis som representerer den mest ondartet svulst dag er histologisk scoret (Gleason score, GS) og sammen med serumnivåer av prostataspesifikt antigen (PSA) som brukes til å prognosticate tumor atferd. I de fleste av prostatakreftpasienter disse metodene har begrenset evne til å forutsi sykdom aggressivitet, og bedre prognostiske markører derfor sterkt behov [1].
Ikke-maligne prostatavevet er alltid samplet av biopsier, og nyere studier av oss og andre har foreslått at svulsten bærende organ er ulikt påvirket /farget av lat vs aggressive svulster [2]. Endringer i de vanlige delene av tumorbærende prostata kan i tillegg til adaptive endringer også være et resultat av feltet cancerization [3, 4]. Endringer i de ikke-maligne deler av tumorbærende prostata (uansett årsak) er viktig å identifisere og validere som de potensielt kan tjene som nye markører for å diagnostisere og prognosticate prostatakreft [2-4]. Vi har kalt den tumor-tilstøtende innrettet ikke-ondartet prostatavevet som Tumor angitt (og således indikerer) Normal Tissue (TINT) [2]. NYANSE omfatter morfologisk normale vises epitel og stroma av den tumor-bærende organ og er ikke i direkte kontakt med tumoren epitel og er således atskilt fra tumor stroma /tumor mikromiljøet.
Vi har tidligere vist at endringer i prostata TINT epitel og stroma er relatert til prognostisk viktige tumor egenskaper som GS og tumorstadium, og kan brukes til å vurdere risikoen for å dø av prostatakreft i en vaktsom venter kohort [2, 5-13]. For å utforske TINT konseptet i mer detalj har vi brukt en dyremodell hvor rotteprostatakreftceller blir implantert i prostata av immunkompetente rotter. Dette resulterer i adaptive tumor fremme endringer i tumorbærende prostata lobe, for eksempel økt tetthet av makrofager og mastceller, og økt hyaluronan [8, 9, 14-16]. Typen og størrelsen av disse endringene er knyttet ikke bare til reduksjon av tumorstørrelse, men også til tumorcelle aggressivitet (Adamo et al., Upublisert). Gen-ekspresjon studier viste at en faktor markert oppregulert i rotte TINT var lysyl oksidase (LOX) [17].
LOX er et utskilt kobber-avhengig amin oksidase, med den primære funksjon å tverrbinde kollagen og elastin (begge oppregulert i rotte TINT [17]), i den ekstracellulære matriks (ECM). Økt ekstracellulært LOX aktivitet resulterer derfor i en stivere mikromiljøet som fremmer tumorprogresjon, metastaser, og invasjonen [18-20]. LOX har også vist seg å være nødvendig for pre-metastatisk nisje formasjon [21]. Nylig, LOX, utskilt av tumor epitelceller, ble også vist å indusere pre-metastatiske benlesjoner som går forut for og muliggjør dannelsen av brystkreft metastaser [22]. Økt ekspresjon LOX har vært forbundet med et dårligere resultat hos pasienter med astrocytomas, ikke-liten lungecancer og magecancer [23-25]. Imidlertid LOX har også vist seg å ha anti-tumoraktivitet i flere krefttyper, inkludert lunge, bukspyttkjertel, magekreft og nasofaryngeal karsinom [26-28]. LOX hemmer HRAS-indusert tumordannelse og omvendt HRAS-transformasjon av fibroblaster [29, 30]. Biproduktet produsert ved spaltning av LOX proenzymet har også vist seg å ha tumorundertrykkende egenskaper [31, 32]. Redusert LOX uttrykket har blitt observert i en rekke kreftformer og har innblandet LOX som en tumor suppressor gen [33].
Rollen LOX i prostata kreft er ikke etablert og både hemmende og stimulerende effekt er rapportert. Høy LOX mRNA-ekspresjon er assosiert med prostatakreft høyverdig og tumorresidiv [34], og har blitt vist å korrelere med GS [35]. Omvendt, ble LOX mRNA uttrykk redusert i metastatisk forhold til primær prostatakreft [36] og lave nivåer av LOX uttrykk har også blitt rapportert i høyverdig svulster [37, 38], noe som tyder på tap av LOX uttrykk under prostatatumorprogresjon.
Hensikten med denne studien var derfor å undersøke LOX protein uttrykk i prostata kreft epitelceller, tumor stroma, tumor-tilstøtende ikke-ondartet prostata epitel (TINT epitel) og i tumor-tilstøtende ikke-ondartet svulst stroma (TINT stroma ) og forholde LOX uttrykk i de ulike avdelingene til histopatologiske og kliniske parametre samt utfallet i en historisk kohort av prostatakreft administrert av vaktsom venter (se [12] for detaljer). Oppsummert finner vi at LOX flekker score i prostata TINT epitel spådd prostatakreft spesifikk overlevelse og ga additiv prognostisk informasjon til GS.
Materialer og metoder
Pasienter
LOX farging poengsum (se nedenfor) ble analysert i vevsprøver innsamlet fra menn som gjennomgikk transurethral reseksjon av prostata (TURP) mellom 1975 og 1991 og hvor histologisk analyse viste tilstedeværelse av prostatakreft (for mer informasjon se [7]). Studien omfatter 351 menn, hvorav 304 (inkludert 265 mål for LOX) menn ikke hadde fått noen kreft behandling før TURP og ble fulgt med vaktsom venter. Gjennomsnittsalderen ved diagnose var 74 år (51 til 95 år) og median total oppfølgingsperioden var 5,2 år (0 til 25,5 år). Lokal tumorstadium ble bestemt ved tidspunktet for kirurgi ved digital rektal undersøkelse og nærværet av metastase ble evaluert ved radio-nukleotid ben scan. Ingen lymfeknute iscenesettelse ble utført og serum PSA var ikke tilgjengelig som materialet ble samlet inn før Ptil æra. Fra vevsprøvene samlet vi konstruerte microarray (TMA) som inneholdt 5-8 prøver av svulstvev (hver prøve som inneholder både svulst epitel og tumor stroma) og 4 prøver av ikke-ondartet vev (hver prøve som inneholder både TINT epitel og TINT stroma ) fra hver pasient [7]. GS ble revurdert når TMA ble konstruert og materialet har tidligere blitt analysert for faktorer som har potensiell prognostisk betydning som tumorvolum, fosforylert AKT (pakt) [6], hyaluronan [9], fosforylert epidermal vekstfaktor-reseptor (pEGFR) [7], vaskulær tetthet, tumorcelle-proliferasjon [10] og akkumulering av forskjellige typer av inflammatoriske celler [8, 12], og disse data ble nå knyttet til dagens LOX funnene. Materialet ble samlet i henhold til svensk lov i en tid da informert samtykke ikke var nødvendig. Den forskningsetiske komité ved Umeå universitet sykehus (Regional Etisk Review Board i Umeå) godkjent av studien og fravikes behovet for samtykke. Pasientinformasjon ble anonymisert og avidentifisert før analysen.
I tillegg ble vevssnitt fra 10 pasienter med prostatakreft som gjennomgikk radikal prostatektomi i 2012 undersøkt for LOX protein og mRNA uttrykk ved hjelp immunhistokjemi og
in situ
hybridisering (se neste avsnitt). Denne studien ble godkjent av Regional Etisk Review Board i Umeå, og alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke.
LOX immunhistokjemi, og
in situ
hybridisering og mRNA uttrykk
de TMA og radikal prostatektomi prøver ble farget for LOX bruker automatisk farging system Ventana Benchmark Ultra (Ventana Medical Systems Inc.). I korte trekk ble fire mikrometer tykke parafinsnitt forbehandlet med CC1 (Tris /borat /EDTA-buffer (pH 8,0), 64min, 95 ° C) for antigen gjenfinning og farget med primært kanin-polyklonalt antistoff mot LOX (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA , NB100-2530, fortynnet 1: 400). Prøvene ble visualisert ved hjelp av Ultra Universal DAB deteksjon Kit (Ventana, Tuscon AZ, USA). Human placenta ble anvendt som en positiv kontroll for LOX, og viser positiv farging i decidua og trophoblast celler. Seksjoner ble digitalisert og analysert ved hjelp av Pannoramic viewer 1.15.2 (3DHistech, Budapest, Ungarn).
in situ
hybridisering for LOX mRNA deteksjon ble utført manuelt med RNAscope 2,0 FFPE Reagent Kit (Advanced Cell Diagnostics Inc., Hayward, CA, USA). I korte trekk ble fire um tykke FFPE vevssnitt deparaffinized og forbehandlet med varme og protease etterfulgt av inkubasjon med proben målretting Hs-LOX i 2 timer ved 40 ° C. Forforsterker, forsterker, og HRP-merkede oligonukleotider ble deretter hybridisert i rekkefølge, etterfulgt av kromogen utfelling utvikling med DAB. Til slutt ble prøver ble motfarget med hematoksylin Meyers, og analysert på et lysfelt-mikroskop. Hver prøve var kvalitetskontrollert for RNA integritet med en RNAscope probe for cyklofilin B (PPIB) RNA (positiv kontroll) og for ikke-spesifikk bakgrunn med en sonde for bakterie dapB RNA (negativ kontroll). Spesifikk RNA farging signal ble identifisert som brun, avbryte prikker.
data svarende til LOX mRNA-nivåer i parede prøver av primærprostatatumor og tilstøtende ikke-ondartet prostatavevet (n = 12), og i kastrering-resistente prostata kreft (CRPC) benmetastaser prøver (n = 30) ble hentet fra tidligere publiserte studier var den menneskelige HT12-v3 Illumina Beadchip genekspresjon utvalg ble brukt i henhold til produsentens protokoll (Illumina, San Diego, CA, USA) og som tidligere beskrevet [39, 40].
Scoring av LOX immunoreaktivitets og
in situ
hybridisering
tumor epitel, tumor stroma, TINT epitel og TINT stroma ble identifisert ved morfologisk utseende, og LOX fargeintensitet og spredning ble scoret separat i disse fire forskjellige avdelinger som negative (0), svak (1), moderat (2), eller sterk (3). I TMA, LOX score er medianverdier på fem til åtte scoret prøver av tumorvev eller fire scoret prøver av ikke-ondartet vev for hver pasient. Den immunoreaktivitets (LOX IR) ble scoret uavhengig av to forskjellige etterforskere (C. H., 351 pasienter og M. N., 50 pasienter) uten kjennskap til pasientdata. LOX farging ble observert i cytoplasma og ofte også i kjernen, men disse to kammere var ikke mottok hver for seg.
I tillegg LOX IR og LOX mRNA-ekspresjon ble merket som beskrevet ovenfor på hele seksjoner fra 10 radikal prostatektomi prøver, inkludert både tumor- og ikke-ondartet epitel og stroma.
Hypoksi behandling
in vitro
, RNA Forberedelse og kvantitativ RT-PCR analyse
prostata epitelceller (RWPE-en ) og stromale myofibroblasts (WMPY-1 (ATCC, Manassas, VA, USA) avledet fra den perifere sonen av histologisk normale humane prostata ble dyrket i henhold til produsentens protokoll (ATCC). cellene ble dyrket i 6-brønners plater ved 37 ° C i 24 timer i en hypoksi (1,0% O
2, 5% CO
2, 94% N
2) eller i normoxia (21,0% O
2, 5% CO
2 , 74% N
2). Seks replikater ble anvendt når total-RNA ble fremstilt ved anvendelse av TRIzol-fremgangsmåten i henhold til protokollen (Invitrogen). totalt RNA ble DNase-behandlet (DNase 1, Ambion) for å fjerne kontaminerende DNA, og 0,8 ug ble brukt for syntese av cDNA i henhold til produsentens instruksjoner under anvendelse av Superscript II (Invitrogen). Sanntids QRT-PCR ble utført ved hjelp av Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR System og Taqman Gene Expression analyse (Applied Biosystems). Kvantifiseringen av mRNA-nivåer ble utført i en 20 ul reaksjonsvolum med 20 ng cDNA per reaksjon for LOX (kommersielt tilgjengelig primer og probe-blanding, LOX, Hs00942480_m1, Applied Biosystems). Negative kontroller ble kjørt parallelt, og de relative verdier for hvert gen ble normalisert ved hjelp h18S, (Hs99999901_s1) som referanse genet og analysert i Taqman Analysis Software SDS2.4 (Applied Biosystems).
statistikker
bivariate sammenhenger ble beregnet ved hjelp av Spearman rang korrelasjon test. Sammenhenger mellom nominelle størrelser og kontinuerlige variabler ble analysert ved hjelp av Kendall tau b korrelasjon. Data ble oppsamlet på tidspunktet for prostata kreftdiagnose og inkludere alle pasienter i studien. Pasientene følges med vaktsom venter ble inkludert i Kaplan-Meier overlevelsesanalyser og Cox regresjonsanalyse. Varigheten av overlevelse (EFS) er definert som tiden fra TURP frem til dato for prostatakreft død, død av andre årsaker, eller hvis ingen dødsfallet fant sted, frem til dato for siste oppfølging. Forskjeller i utfall mellom gruppene ble testet med log-rank test. Den prognostiske betydningen av LOX IR ble undersøkt av Cox regresjonsanalyse alene og sammen med GS. Sannsynligheten for overlevelse (P-EFS) er presentert ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM). En intrakorrelasjonsanalyse ble brukt til å validere to forskjellige LOX scorings. Mann-Whitney U-test ble benyttet for sammenligning mellom hypoksiske og kontroll behandlet prostataceller, og for sammenligning mellom CRPC prøver og ikke-ondartet prostata /primære prostatakreft. Den Wilcoxon Signed-rekkene test ble brukt for sammenlikning mellom parede ikke-ondartet prostatavevet og primær prostatakreft prøver. Betydningen terskelen ble satt til 0,05. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS 23,0 programvare (SPSS Inc., Chicago, USA).
Resultater
LOX uttrykk i maligne og ikke-maligne menneskelige prostata vev
Å vurdere betydningen av LOX i prostatakreft, en TMA inkludert svulstvev og tumor-tilstøtende ikke-ondartet prostatavevet (vev kjerner ble samplet på tilfeldige avstander fra svulstvev) fra 351 prostatakreftpasienter med lang oppfølging ble analysert og scoret etter LOX immunhistokjemi i fire forskjellige avdelinger; ikke-ondartet prostata epitel (NYANSE epitel), ikke-ondartet prostata stroma (NYANSE stroma), prostata svulst epitel og prostata svulst stroma. I TINT epitel en moderat LOX immun farging ble generelt observert i basal epitelceller mens luminal epiteliale cellefarging var variabel mellom pasienter og scoret fra ingen eller svak flekker til moderat eller sterk (median stillingen 2, fig 1A). LOX-ekspresjon i TINT stroma ble påvist i glatte muskelceller og fibroblaster og fargeintensitet varierte mellom pasienter fra svak til sterk (median vurdering 2,5, figur 1A). Tumor epitelceller var generelt positive og fargeintensitet i både tumor epitel og tumor stroma variert mellom svulster (median scorer to for begge områdene, data ikke vist). LOX flekker score i de ulike avdelingene ble alle korrelert til hverandre (data ikke vist). De sterkeste sammenhengene ble funnet mellom LOX score i TINT epitel og den tilsvarende TINT stroma (
Rs = 0
50
,
p .. 0
001 .) Hotell og mellom svulst epitel og svulsten stroma (
Rs = 0
44
,
p. 0
001
) . For å måle konsistens, to etterforskere scoret LOX immunreaksjon selvstendig og en intra-klasse korrelasjonsanalyse ga en Chronbach alfa på 0,81 indikerer en gyldig scoring.
(A) Representant immunhistokjemisk farging av LOX (brun) i avsnitt av ikke-maligne prostata vevsprøver (TINT epitel og TINT stroma) fra to pasienter med prostatakreft (original forstørrelser x 200). Sak Et show svak epitel farging (skår 1) og Tilfelle B sterk epitel farging (skår 3). (B) sammenhengende seksjoner fra ikke-ondartet prostatavevet farget med
in situ
hybridisering eller immunhistokjemi for LOX. Merk at mRNA (brune prikker) og protein (brun) uttrykk i enkelte kjertler var knyttet, i stroma i motsetning mRNA var generelt lav, men protein ofte oppdages (original forstørrelser x200). (C) LOX mRNA-ekspresjon i ikke-ondartet prostatavevet (TINT) (n = 12), i primær prostata kreftvev (n = 12), og i kastrerings-resistente benmetastaser (CRPC) (n = 30) ved hjelp av Illumina gen uttrykk array.
for å undersøke plasseringen av LOX produksjon i prostata vi brukte
in situ
hybridisering. Som TMA materialet var for gammel for denne analysen, vi undersøkt og scoret LOX immunfarging og LOX mRNA uttrykk indeksen i 10 radikal prostatektomi prøver ( 3 år gamle materiale). LOX-protein ekspresjon i de radikale prostatectomies var lik den farging i den i TMA viser variabel fargeintensitet i både normale og tumor epiteliale og stromale celler (figur 1B). LOX mRNA var hovedsakelig uttrykt i luminal prostata epitelceller og i tumorceller med få positive celler i den ikke-maligne og maligne prostata stroma, som viser at LOX ble hovedsakelig fremstilt i prostata epithelial og tumorceller (figur 1B). Videre LOX mRNA uttrykk indeksen i epitelceller korrelert med LOX flekker score (
R
S
=
0
.
70
,
p .. 0
05
)
Vi har tidligere undersøkt transkriptomet av prostata svulstvev i radikale prostatectomies, i ikke-ondartet prostatavevet i de samme pasientene (samplet 0,5-3 cm fra nærmeste svulst foci, median avstand 1 cm), og i kastreringsresistent (CRPC) benmetastaser av separate pasienter [39, 40]. I disse prøvene transkripsjon nivået av LOX mRNA var lik i non-maligne og ondartet primære svulstvev (fig 1C). Imidlertid LOX mRNA-nivåene var signifikant høyere i CRPC skjelettmetastaser sammenlignet med nivåene i de primære prostata tumorer (figur 1C). LOX mRNA nivåer i ikke-ondartet prostatavevet dukket relatert til avstand fra tumor (data ikke vist) i tråd med resultatene nedenfor viser at LOX flekker i TINT epitel i vaktsom venter-kohorten ble bare marginalt relatert til tumorstadium (og dermed ikke nært relatert til tumorstørrelse og gjennomsnittlig avstand til nærmeste svulst).
LOX immunoreaktivitets er assosiert med markører for tumor aggressivitet
Analyser ble utført for å undersøke mulige sammenhenger mellom LOX uttrykk i fire forskjellige prostatavevet kamre til kliniske parametre og histologiske karakteristika for tumor. LOX stillingen i tumor epitel var positivt assosiert med GS, tumorstadium, tilstedeværelse av metastaser ved diagnose, tumor microvessel tetthet og tumorformering (tabell 1). LOX score i TINT epitel ble korrelert til tumorstadium, og svulsten og ikke-ondartet microvessel tetthet (tabell 1). Men LOX poengsum i tumor stroma og TINT stroma dukket ikke er relatert til disse tumoregenskaper (data ikke vist).
I tillegg har vi undersøkt om LOX Poengsummen ble assosiert med andre faktorer som oppdages i tumor og TINT vev som forholde seg til pasientens overlevelse [6-9]. Tumor epitelial LOX resultatet positivt korrelert til pEGFR IR både i tumor og fargetone epitel, samt hyaluronan i tumor og fargebalanse stroma. Tumor epitel LOX Poengsummen ble også positivt korrelert til Pakt i TINT epitel (tabell 1). LOX IR i TINT epitel ble positivt korrelert til pEGFR og Pakt både i svulsten og TINT epitel (tabell 1). Dette tyder på nye relasjoner mellom LOX uttrykk i svulsten og prostata TINT epitel og disse faktorene. Mastceller og S100A9 positive makrofager viste ingen sammenheng med LOX IR (data ikke vist).
LOX immunoreaktivitets i prostata TINT epitel spår kreft spesifikk overlevelse
Pasienter med høy LOX uttrykk (≥ medianverdien 2.0) i TINT epitel hadde en signifikant redusert kreft spesifikk overlevelse sammenlignet med resten (15-års sannsynlighet for arrangementet overlevelse (P-EFS) var 58 ± 5% og 81 ± 8% i de to gruppene, fig 2). Videre ble en høy TINT epitelial LOX stillingen forbundet med økt relativ risiko for prostatakreft spesifikk død i en univariat Cox regresjonsanalyse (tabell 2). I tillegg LOX IR TINT epitel ga additiv prognostisk informasjon til GS i en multivariat Cox regresjonsanalyse (tabell 2). Det var ingen signifikante relasjoner mellom pasient overlevelse og LOX IR i tumor epitel, tumor stroma eller TINT stroma (data ikke vist).
Pasientene deles inn i to grupper avhengig av LOX immunoreaktivitets (IR) i ikke-ondartet luminal epitelial prostatavevet (TINT epitel).
Hypoksi oppregulerer LOX i ikke-maligne prostataceller
in vitro
LOX uttrykk har vist seg å være regulert av hypoksi [18, 41] og implantering av kreftceller indusert hypoksi i de ikke-maligne deler av tumor-bærende lapp prostata hos rotter [17]. Hypoksi kan derfor være en forklaring på den høye LOX uttrykk sett i den ikke-ondartet prostata epitel av noen prostatakreftpasienter som hypoksi er vanlig i de epiteliale avdelinger i ikke-maligne og ondartet menneskelig prostata vev [42]. I tråd med dette viser vi at menneskelige prostata epitelceller (RWPE-1) og stromal myofibroblast (WPMY-1) celler inkubert i hypoksi i 24 timer
in vitro
hadde betydelig høyere LOX mRNA nivåer i forhold til normoksisk kontroller (Fig 3). Størrelsen av LOX oppregulering var høyest i RWPE-1-celler (11-ganger sammenlignet med to-fold i WPMY-1). Dette tyder på at hypoksi kunne oppregulerer LOX-ekspresjon i normal prostata epitel og stroma.
Relativ LOX mRNA-ekspresjon i humane prostata epitelceller (RWPE-1) og human prostata stromale myofibroblasts (WPMY-1) dyrket
in vitro
i normoksisk eller hypoksiske betingelser for 24 timer. Verdier er gjennomsnitt ± SEM, **
p
0,01.
diskusjon
Tidligere studier i en rottemodell antydet at nærværet av en prostatakreft øket LOX uttrykk ikke bare i tumoren, men også i resten av tumorbærende prostata lobe [17]. Hensikten med denne studien var derfor å undersøke om dette kan være situasjonen også hos pasienter. Dette viste seg å være tilfelle, og høye nivåer av LOX i den tumor-tilstøtende ikke-ondartet prostata epitel (TINT epitel) var assosiert med kortere cancer spesifikk overlevelse i prostatakreftpasienter. Videre LOX score i prostata TINT epitel ga additiv prognostisk informasjon til GS. Vi har i dyremodeller tidligere vist at adaptive endringer forekommer i den omgivende tumorbærende organ, og at slike endringer kan brukes til å prognosticate prostata kreft hos pasienter [2, 5-10, 13]. Her viser vi at LOX score i prostata TINT epitel korrelerer med mange faktorer som tidligere undersøkt i TINT epitel (pEGFR, Pakt) og TINT stroma (microvessel tetthet) og vist å forholde seg til tumor aggressivitet og utfallet [6-8, 10].
serum PSA nivå og Gleason score av tumorholdige biopsier har, av grunner som er skissert i innledningen, begrenset evne til å forutsi tumor atferd i de fleste nydiagnostiserte tilfeller [1]. Derfor kan andre diagnostiske og prognostiske markører, for eksempel i det omgivende normale vev prostata derfor være potensielt nyttig, spesielt som ikke-ondartet prostata alltid er samplet i prostatabiopsier [2, 4]. Vår studie antyder at LOX ekspresjon i epitelet av den ikke-ondartet del av den tumor-bærende organ kan hvis validert i flere studier tjene som en selvstendig prognostisk markør for prostatakreft. Men sammenlignet med pEGFR [7] og Pakt [6] LOX flekker i TINT er tilsynelatende mindre informativ.
Videre, og i tråd med noen tidligere rapporter [34, 35] viser vi at LOX-IR i prostata svulst epitel ble korrelert til flere kliniske egenskaper relatert til tumor aggressivitet som GS, tumor stadium, microvessel tetthet, tumor spredning og metastaser. Nye relasjoner mellom LOX uttrykk i tumor epitel og pEGFR, Pakt og hyaluronan ble også funnet. Hyaluronan ble nylig foreslått å fungere som en induktor av LOX uttrykk i brystkreftceller, noe som kan forklare den positive korrelasjon til LOX IR i tumor epitelceller [43].
Ren et al. viste at LOX mRNA-ekspresjon ble overveiende uttrykt i normale humane og mus prostata epitelceller, med lavere nivåer uttrykt i prostata stroma [36]. Dette og funn i vår
in situ
hybridisering indikerer at LOX er hovedsakelig produsert av prostata epitel. Andre genekspresjon studier har vist at LOX er uttrykt i både normal prostata epitel og stroma [37]. I tråd med disse studiene viser vi at LOX protein ble funnet i både human prostata ikke ondartet epitel og stroma men at nivåene av LOX varierte mellom pasienter. En årsak til de høye LOX nivåer i prostata TINT kan være at svulsten, ved mekanismer ukjente, induserer LOX uttrykk i ikke-maligne prostataceller. Dette støttes av våre funn at ortotopiske rotte prostata kreftceller implantert i prostata hos rotter resulterte i økt uttrykk av LOX mRNA i TINT forhold til tumor-free kontroll vev [17].
Vi har nylig vist at rotte prostatavevet NYANSE gen-ekspresjon mønster er kjennetegnet ved prosesser som inflammasjon, transformerende vekstfaktor-β (TGF-β) signal- og hypoksi [17]. Implantasjon av kreftceller i rotte prostata også indusert hypoksi, som vist ved pimonidazole farging i de ikke-maligne deler av det tumorbærende prostata lapp [17]. Vi her viser at hypoksi signifikant oppregulert LOX mRNA uttrykk i menneskelige prostata epitelceller og prostata myofibroblasts
in vitro
, og menneskelige prostata vev (både svulsten og omkringliggende normale) er generelt hypoksisk [42]. Hypoksi kan således forklare den økte LOX nivåene i fargede og at økte nivåer av LOX er en konsekvens av tumordannelse. En fersk studie av Cox et al. impliserer at hypoksiske brystsvulster utskiller LOX som senere induserer pre-metastatiske benlesjoner [22]. Her ble LOX stillingen i tumor epitelceller funnet å være assosiert med benmetastaser og LOX stillingen i TINT epitel for overlevelse, noe som tyder på at LOX utskilt fra svulst og viktigere også fra de ikke-ondartede delene av den tumor-bærende prostata kunne delta i pre-metastatisk nisje formasjon også i prostatakreft. Videre studier er nødvendig for å undersøke denne muligheten og den relative betydningen av svulst vs. TINT utskilt LOX. Hypotesen om at de ikke-maligne deler av tumorbærende prostata kan være en betydelig bidragsyter er støttet av vår observasjon at LOX mRNA nivåer er like i menneske prostatakreft og i tilstøtende ikke-ondartet prostatavevet [39, 40].
TGF-β har blitt vist av andre til å oppregulere LOX i prostata og brysttumorceller [36, 44] og aggressive prostata kreftceller uttrykker mer TGF-β enn lat tumorer og høy TGF-β ekspresjon i tumor epitelceller er assosiert med et dårlig resultat i vår kohort av prostatakreftpasienter [45]. TGF-β stimulering av normal prostata epitel kan dermed føre til økt LOX uttrykk og kan forklare noe av den økte LOX i fargetone. Videre er positiv korrelasjon av LOX med pEGFR og pakt foreslår at økt LOX ekspresjon er koplet til prostata epitelial celleaktivering. Videre studier er nødvendig for å undersøke hvordan prostatakreft kan stimulere ikke-maligne prostata-celler for å øke deres LOX uttrykk.
Denne studien viser at høy LOX syntese i tumor epitelial og i epitelcellene i den tumor-bærende organ kan stimulere prostata svulst vekst og spredning. Dette funnet er i samsvar med flere andre undersøkelser er nevnt i innledningen. Noen studier har imidlertid foreslå at LOX kan også være hemmende og et gradvis tap av LOX er sett i prostata kreft metastaser [36], men ikke i den nåværende. I en eksperimentell undersøkelse ble det benyttet en LOX-inhibitor (BAPN) hos rotter implantert med prostatakreft og funnet at LOX sannsynligvis stimulerte tidlig tumorvekst, og omvendt være hemmende i allerede etablerte tumorer (Nilsson et al., Upublisert). Den funksjonelle rollen LOX i prostata kreft kan dermed være kontekstavhengig.
En mulig svakhet med denne studien er spesifisiteten av LOX antistoff brukes for immunhistokjemi. Antistoffet dannet mot et syntetisk peptid svarende til en intern region av human LOX (innen rester 200-300) og detekterer modne LOX og glykosylerte varianter på Western blot (www.novusbio.com).
