Abstract
I dette innholdet, en liten molekylær ligand av prostata spesifikt membranantigen (SMLP) konjugert poly (kaprolakton) (PCL) -b-poly (etylenglykol) (PEG) kopolymerer med forskjellige blokklengder ble syntetisert for å konstruere en tilfredsstillende medikamentleveringssystem. Fire forskjellige docetaxel lastet polymere miceller (DTX-PMS) ble utarbeidet av dialyse med partikkelstørrelser mindre enn 60 nm som preget av dynamisk lysspredning (DLS) og transmisjonselektronmikroskop (TEM). Optimalisering av de fremstilte miceller ble gjennomført basert på kortsiktig stabilitet og stoff-lasting innhold. Resultatene viste at optimaliserte systemer var i stand til å forbli stabilt i 7 dager. Sammenlignet med Taxotere, DTX-PMs med det samme forholdet mellom hydrofil /hydrofob kjedelengde vises lignende med forsinket frigjøring atferd. Den cytotoksisitet av den optimaliserte målrettet DTX-PCL
12K-PEG
5K-SMLP miceller (DTX-PMs2) og ikke-målrettede DTX-PCL
12K-mPEG
5K miceller (DTX-PMs1) ble bedømt ved MTT-analyser ved anvendelse av prostata spesifikt membran antigen (PSMA) positive prostata adenokarsinom celler (LNCAP). Resultatene viste at den målrettede miceller hadde en mye lavere IC50 enn deres ikke-målrettede motstykker (48 h: 0,87 ± 0,27 vs 13,48 ± 1,03 ug /ml; 72 H: 0,02 ± 0,008 vs 1,35 ± 0,54 ug /ml).
In vitro
cellulært opptak av PMs2 viste fem ganger høyere fluorescens intensitet enn for PMs1 etter 4 timers inkubering. Ifølge disse resultatene, romanen nano-størrelse medikamentleveringssystem basert på DTX-PCL-PEG-SMLP tilbyr store løftet for behandling av prostatakreft
Citation. Jin J, Sui B, Gou J, Liu J, Tang X, Xu H, et al. (2014) PSMA Ligand Conjugated PCL-PEG Polymer Miceller Målrettede til prostata kreft celler. PLoS ONE 9 (11): e112200. doi: 10,1371 /journal.pone.0112200
Redaktør: Gnanasekar Munirathinam, University of Illinois, USA
mottatt: 14 juli 2014; Godkjent: 13 oktober 2014; Publisert: 11.11.2014
Copyright: © 2014 Jin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:.. Forfatterne har ingen finansiering eller støtte til rapporten
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Polymer miceller har fått betydelig oppmerksomhet som lovende anticancerlegemiddelbærere på grunn av deres bemerkelsesverdige fordeler, såsom liten størrelse, smal størrelsesfordeling, høy biokompatibilitet, og solubilisering av hydrofobe medikamenter [1], [2], [3], [4], [5]. Selv-sammensatte polymere miceller med kjerne /skallkonstruksjoner gjør det mulig for systemet å innlemme dårlig vannløselige legemidler i den hydrofobe kjerne og beskytte dem mot nedbrytning i fysiologiske medier [6]. For eksempel, har den hydrofobe kjerne av micellene sammensatt av PCL-PEG et reservoar for innarbeidelse av legemidler, mens det pegylerte skallet sammen med sin nanoscopic størrelse garanterer bæreren forbli ikke-gjenkjent av det retikuloendoteliale system, og gjennomgår en lang-sirkulasjonsperioden i blodet [7], [8], [9].
Selv om polymere miceller oppviste en rekke fordeler, er en stor utfordring deres stedsspesifikk levering av legemidler. Ligand-modifisert polymermicelle stoffet leveringssystemer er i stand til stedsspesifikk levering av legemidler av. Nylig har en rekke aktive rettet mot leveringssystemer er designet av konjugering NPs med ligander som binder spesifikt til biomarkører av ekstracellulære domener av kreftceller. PSMA som folat hydrolase I og glutamat karboksypeptidase II, er et velkjent transmembranprotein [10] i løpet uttrykt på prostatakreft epitelceller [11], [12], og har vist seg å ha et stort potensial for prostatakreft (PCA) terapi. PSMA har en lav ekspresjon i normale prostata epitelceller og benign prostatahyperplasi. Den er også uttrykt i neovaskulatur av de fleste andre faste tumorer, men ikke i vaskulaturen av normalt vev [13], [14]. Alle disse egenskapene gjør PSMA en attraktiv biomarkør for deteksjon, diagnose og behandling av PCa [15], [16]. En ny liten molekyl ligand ((S) -2- (3 – ((S) -5-amino-1-karboksypentyl) ureido) pentandisyre, SMLP) bindes spesifikt til PSMA har vist sin potensiale i behandlingen av kreft i nyere år [17]. Den urea-baserte PSMA-inhibitor, SMLP, har en høy affinitet for PSMA på grunn av sterk hydrogenbinding [10]. Hrkach og Langer
et al.
Utviklet ACUPA (PSMA ligand) konjugert DTX NPS sammensatt av PEG-b-PLGA eller PEG-b-PLA ved hjelp av en nano-emulgeringsmetode å målrette PSMA og evaluert anti-tumor virkning av NPs
in vitro Hotell og
in vivo product: [18]. Den utmerkede potensialet som kjøretøy-ligand målretting PSMA antyder nødvendigheten i å utvikle mer diversifiserte forberedelse prosesser og bære-materialer i dette feltet.
I denne studien, en nano-størrelse selv-montert medikamentleveringssystem basert på ligand -konjugert PEG-b-PCL-miceller, ble funnet å vise store løftet i feltet av målrettede legemiddelavlevering. Kopolymerer av PCL og PEG er begge velkjente bionedbrytbare og biokompatible materialer er mye brukt i biomedisinske felt [19], [20], [21], [22], [23]. På grunn av innføring av glykolsyre (GA) og melkesyre (LA), som forstyrret ordnet struktur av molekylkjedene, PLGA viste lav krystallinitet. Som et resultat av miceller med kjerner av PCL som viste høyere krystallinitet er mer stabile enn de med PLGA kjerner. Videre, på grunn PLGA er en tilfeldig kopolymer, er det forholdsvis vanskelig å kontrollere forholdet mellom GA til LA nettopp i stor-skala produksjon. Imidlertid er forholdet mellom de to monomerer en nøkkelfaktor for å påvirke den egenskapen av PLGA [24]. Så PCL ble anvendt som kjernedannende blokk på grunn av sin bedre stabilitet og lette å produsere. PCL-mPEG eller PCL-PEG-COOH ble syntetisert ved ringåpningspolymerisasjon av ε-kaprolakton initiert av mPEG-OH eller HOOC-PEG-OH [25], [26]. PCL-MPEG og PCL-PEG-SMLP miceller ble fremstilt ved bruk DTX som modell medikament for å undersøke cytotoksiske effekter på LNCaP celler. Dessuten er en skjematisk illustrasjon av forberedelse og endocytose prosessen med DTX-PCL-PEG-SMLP vist i Figur 1.
Materialer og metoder
Material
L -glutamic syre di-tert-hydroklorid og H-Lys (Z) OT-Bu hydroklorid ble oppnådd fra En lai Bioteknologi Co, LTD (Chengdu, Folkerepublikken Kina). MPEG-OH (Mw: 2 kDa) og MPEG-OH (Mw: 5 kDa) (Aladdin Agent Co, Shanghai, Kina) og OH-PEG-COOH (Mw: 2 kDa), OH-PEG-COOH (Mw : 5 kDa) (Shanghai Seebio Bioteknologi Co, shanghai, Kina) ble dehydrert ved azeotrop destillasjon med toluen før bruk. DTX (Shanghai Sanwei Pharma Ltd, Co, Shanghai, P R Kina) og celluloseester dialyse bag med en molekylær cut-off av 7000 Da (Bioscience Ltd, Co, Shanghai, P R Kina) ble brukt som mottatt. ε-kaprolakton (ε-CL, Aladdin Agent Co., Shanghai, P R Kina) ble tørket over CaH
2 ved romtemperatur i 48 timer og destillert under redusert trykk. Tinnoktoat ble kjøpt fra Aladdin Agent Co (Shanghai, P R Kina). Alle organiske løsemidler som brukes i syntese prosedyrer ble kjøpt fra National Medicine Chemical Reagens Ltd Co (Shanghai, Kina).
prostata LNCaP og PC3 cellelinjer ble hentet fra Type Culture Collection av den kinesiske Academy of Sciences (Shanghai, Kina). LNCaP Cellene ble dyrket ved hjelp av celle bind kulturflasker (Corning, USA).
Metoder
Syntese av PCL-mPEG (PMs1) og PCL-PEG-SMLP (PMs2) kopolymerer.
Kopolymerer med en rekke blokklengder ble fremstilt ved ring-åpning kopolymerisering av ε-CL initiert av hydroksyl av PEG. Kort sagt ble en forutbestemt mengde av ε-CL og stanno-oktoat tilsatt til en reaksjonsbeholder inneholdende mPEG-OH eller OH-PEG-COOH under en tørr argonatmosfære (tinnoktoat /ε-CL i 1:1000 molforhold). Deretter ble reaksjonsbeholderen plassert i et oljebad og holdt ved 120 ° C i 24 timer. Da de rå-kopolymerene ble oppløst i DCM og utfelt i kald dietyleter for å fjerne den ikke-reagerte monomer og oligomer. Deretter ble produktet filtrert og tørket for å oppnå et hvitt bunnfall.
PCL
12k-PEG
5k-COOH (1 g, 0,059 mmol) ble oppløst i 5 ml vannfritt tetrahydrofuran (THF) med 1-etyl-3- [3-dimetylaminopropyl] -karbodiimid-hydroklorid (EDC) (57,4 mg, 0,3 mmol, 5 ekv) og N-hydroksysuksinimid (NHS) (27,6 mg, 0,24 mmol, 4 ekv). Deretter ble oppløsningen blandingen ble omrørt ved romtemperatur i mer enn 12 timer under argonatmosfære. PCL
12k-PEG
5k-NHS-kopolymer ble utfelt i is-kald dietyleter, og dette ga et hvitt bunnfall som ble oppsamlet og tørket for å oppnå det ønskede produkt som et hvitt pulver (utbytte, 90%). SMLP (300 mg) ble oppløst i vannfri THF (20 ml) for å fremstille 10 mg /ml (SMLP /THF) aqua. PCL-PEG-NHS (500 mg, 0,03 mmol) og diisopropyletylamin (0,7 ml) ble tilsatt til 5 ml (SMLP /THF) aqua, og reaksjonsløsningen ble omrørt ved romtemperatur i 20 timer under argon. Etter fullførelse av reaksjonen ble oppløsningen renset ved dialyse i 24 timer og tørket ved lyofilisering for å oppnå et hvitt fnuggaktig pulver (utbytte 90%). Strukturen av endelig copolymer var preget av
1 H NMR-spektroskopi.
PCL
4.8K-mPEG
2K og PCL
4.8k-PEG
2k-SMLP ble forberedt Ved bruk av samme metode som tidligere nevnt.
Polymer karakterisering.
1H-nukleær magnetisk resonans (
1 H NMR) av alle prøvene ble registrert på en Bruker DMX 300 eller 600 spektrometer (Rica, MA). Kjemiske skift (δ) ble gitt i ppm anvendelse av tetrametylsilan som indre standard. Fourier transform infrarød-spektra ble registrert på et Bruker Tensor 27 spektrometer, og prøver ble fremstilt ved bruk av KBr-plater (Scharlau Chemie, Barcelona, Spania). Gelpermeasjonskromatografi (GPC) analyse ble utført på en Waters 1515 GPC instrument (Waters Corp, Milford, MA) utstyrt med tre styragel kolonner (Waters Corp, 10
5, 10
4, og 103 A) i tandem og en 2414 differensial brytningsindeks detektor. DMF ble valgt som elueringsmiddel ved en strømningshastighet på 1,0 ml /min ved 35 ° C. Prøve konsentrasjoner var ca 2 mg /ml. Molekylvektene ble kalibrert ved hjelp av polystyren standarder.
Utarbeidelse av polymere miceller.
DTX-lastet miceller ble utarbeidet av dialyse. Først, 7 mg DTX og 50 mg copolymer ble fullstendig oppløst i 2 ml THF. Deretter 4 ml fosfatbufret saltoppløsning (PBS; 10 mM, pH 7,4 eller 10 mM, pH 5,5) ble tilsatt dråpevis til løsningen under kontinuerlig omrøring i en time. Deretter, THF ble fjernet ved dialyse mot PBS (10 mM, pH 7,4 eller 10 mM, pH 5,5) i løpet av 24 timer under anvendelse av en celluloseester dialyseposen (MWCO: 7000 Da). Det ytre medium ble erstattet tre ganger (2, 6 og 12 timer). Til slutt ble blandingen passert gjennom en 0,45 mikrometer filter membran for å fjerne eventuelle fellings.
Narkotika lasting innhold og Innkapslingseffektivitet.
For å bestemme narkotika-lasting innhold og innkapsling effektivitet, 500 mL DTX-lastet micellær oppløsning og 5 ml THF ble overført til en 25 ml målekolbe, ultralydbehandlet ved 180 V i 10 minutter i et ultralydbad og deretter fortynnet med mobil fase. Konsentrasjonen i den resulterende oppløsning ble deretter bestemt ved HPLC. Kromatografisk analyse ble utført ved anvendelse av en Hitachi L-2130 pumpe og en Hitachi L-2400 UV-Vis detektor drevet ved en bølgelengde på 230 nm, ved bruk av en enhetlig C18-kolonne (5 um, 150 x 4,6 mm). En mobil fase av acetonitril og vann (60/40, v /v) ble valgt. Strømningshastigheten ble satt til 1 ml /min. Responsen toppareal sammenlignet med den DTX-konsentrasjon var lineær over området 0,5-30 ug /ml (R «> 2 = 0,9999).
Medikament-innhold lasting og innkapslingseffektivitet ble beregnet ut fra følgende ligninger :
partikkelstørrelse målinger
partikkelstørrelse og fordeling av miceller ble målt ved DLS ved hjelp NICOMP 380 Submicron Particle Sizer (Particle dimensjonering systemer, Santa Barbara, California).. En laserstråle med en bølgelengde på 632,8 nm ble brukt. Spredningsvinkelen ble innstilt på 90 ° når målingene ble utført.
overflatemorfologi.
Prøver for TEM observasjon ble fremstilt ved å plassere en dråpe av prøveoppløsning (2 mg /ml for kopolymer) videre til et kobbergitter belagt med karbon. Overflødig Løsningen ble tørket bort med filterpapir. Gitteret ble tillatt å tørke i ytterligere 15 minutter. Deretter ble prøvene undersøkt ved hjelp av en Hitachi H-600 TEM operert ved en akselererende spenning på 100 kV.
In Vitro
Release.
in vitro
DTX frigjøringskinetikk narkotika lastet micelle løsninger eller DTX injeksjon (Taxotere, Sanofi-Aventis, Paris, Frankrike) som inneholder 300 mikrogram DTX ble utført ved hjelp av dialyse diffusjon. Stoffet belastede micellær oppløsning og fritt medikament løsning ble plassert i dialyseposer (MWCO: 14000). Disse posene ble neddykket i 15 ml PBS pH 7,4 (10 mM) eller pH 5,5 (10 mM) inneholdende 0,5% w /v Tween 80. Deretter ble flaskene plassert i en risteinkubator ved en ristehastighet på 100 rpm under 37 ° C ± 0,5 ° C. Alle frigjørings media ble byttet ut med frisk PBS ved forhåndsbestemte intervaller (1 H, 2 timer, 4 timer, 8 timer, 12 timer, 24 timer, 36 h, 48 h, 60 h, 72 h, 84 h og 96 h) i rekkefølge for å måle medikamentkonsentrasjonen. Konsentrasjonen av DTX ble målt ved HPLC.
Cellekultur og cytotoksisitet.
prostata LNCaP og PC3 cellelinjene ble dyrket i RPMI 1640 medium og Hams F12K (Invitrogen, USA), supplert med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, USA), henholdsvis. Kulturene ble opprettholdt i en 95% luft fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2 ved 37 ° C.
MTT-analysen ble utført for å evaluere cytotoksisiteten av DTX-PMs1 (nontargeted) og DTX-PMs2 ( målrettet). LNCaP-celler ble suspendert i kulturmedium og sådd med 5000 celler /brønn i 96-brønners plater i 24 timer. Deretter dispergeres DTX-PMs1, DTX-PMs2, og DMSO-oppløsning av DTX (DSD) inneholdende fire medikamentkonsentrasjoner (0,1, 1, 10 og 20 ug /ml) i hver prøve ble inkubert i LNCaP-celler. Til slutt ble cellelevedyktigheten ble bestemt etter 48 timer og 72 timer ved anvendelse av en mikroplateleser (Bio-Rad imark, USA).
IC50 for hvert system ble deretter beregnet. Alle analyser ble utført med fem parallelle prøver.
cellulært opptak studier.
I denne studien kumarin 6 ble anvendt som en fluorescerende probe. Androgen-avhengige og androgen-uavhengig prostatacellelinjer (LNCaP og PC3, henholdsvis) ble anvendt. Cellulært opptak av målceller og ikke-målrettede PMS (200 ug /ml) som bærer kumarin 6 (100 ug /ml) (PMs1 og PMs2, henholdsvis) ble utført på LNCaP og PC3 cellelinjer for å undersøke innflytelsen av SMLP konjugering på cellulært opptak. Cellene ble inkubert i 96-brønners plater med miceller i 4 timer, vasket med kald PBS tre ganger, og deretter fiksert med 70% etanol i 2 timer ved -20 ° C. En konkurransedyktig hemming studie ble også utført ved bruk av fri SMLP å verifisere om PMS ble fraktet inn i celler i en SMLP-mediert måte. Fri SMLP med tre forskjellige konsentrasjoner (4 ug /ml, 20 pg /ml og 100 ug /ml) ble tilsatt til mediet sammen med PMs2, inkubert i 4 timer, vasket tre ganger med kald PBS og fiksert med 70% etanol i 2 timer ved -20 ° C. Cellekjerner ble farget med Hoechst 33342.
Cellene ble undersøkt ved hjelp av et Content ImageXpress Micro XL Widefield Høy Screening System (ImageXpress Micro XL, Molecular Devices, USA) med MetaXpress Software. Bildene av cellene ble bestemt av differensial interferens kontrast kanal teknikk og bilder av kumarin 6-lastet PMs og kjerner av celler farget med Hoechst 33342 ble registrert med følgende kanaler: blå kanalen (Hoechst 33342) med eksitasjon ved 350 nm og grønne kanalen (kumarin 6) med eksitasjon ved 485 nm. Deretter ble MetaXpress programvare som brukes til å kvantifisere fluorescens intensitet per celle.
Statistikk.
Alle data ble behandlet ved hjelp av Origin 8.5 software og presentert som gjennomsnitt ± SD, og analysert ved hjelp av Student
t
-test. Statistiske analyser ble utført og P . 0,01 ble ansett som statistisk sikkerhet
Diskusjon
Syntese og karakterisering av PCL-MPEG og PCL-PEG-COOH kopolymerer
Resultater og p> en amfifil blokk-kopolymer som består av en PCL-blokk som den hydrofobe del og en PEG-blokk som den hydrofile delen ble syntetisert via ringåpningspolymeriseringen ved hjelp av hydroksyl-terminerte PEG som et makromolekylært initiator.
molekyl~~POS=TRUNC vektene~~POS=HEADCOMP for kopolymerene ble beregnet ut fra sup
1 H NMR-data ved å sammenligne toppintensitetene til de metylenprotoner av PEG med metylenprotoner av PCL, som vist i figur 2E. Forholdet mellom den hydrofobe blokk til den hydrofile blokken ble bestemt fra de relative intensitetene av PCL-proton signalet ved 2,31 ppm og PEG-proton signalet ved 3,62 ppm. For GPC-analyse, bare en topp vist i GPC-kurven (figur 2A), som betyr at det ringåpning kopolymerisering av ε-kaprolakton med PEG-OH ble fullført og alle restene ble fjernet etter rensing. Polydispersiteten av copolymer (Mw /Mn) er skissert i tabell 1.
Syntese og karakterisering av PCL-PEG-SMLP
Surface funksjon av copolymer PCL- PEG-COOH med SMLP ble oppnådd under standard amid-koblingsbetingelser, i nærvær av EDC og NHS [27], [28]. Koblingseffektiviteten med amin-nukleofiler kan økes ved dannelse av en NHS-ester-mellomproduktet [29].
Syntese av polymer PCL-PEG-SMLP ble utført ved den følgende metode. Først ble karboksyl av PCL-PEG-COOH aktivert med EDC og NHS for å oppnå den mellomliggende PCL-PEG-NHS. Deretter ble den aktive ester (NHS) på PCL-PEG-NHS omsettes med den aminfunksjonelle gruppen i SMLP for å oppnå det endelige polymer PCL-PEG-SMLP (figur 3).
Polymer av PCL
12k-PEG
5k-SMLP ble karakterisert ved hjelp av FT-IR, som vist i figur 2F. De viktigste toppene er vist i figur 2F ved 1671 og 1557 cm
-1 ble tilskrevet amid bånd I (karbonylgruppen) og amid II bånd (amino-gruppe) henholdsvis, mens forsvinningen av disse toppene (figur 2G) viste dannelsen av amidbindingen mellom SMLP og PCL
12k-PEG
5k-COOH. Strukturen av konjugatet ble ytterligere undersøkt ved
1 H NMR. Figur 2C viser den
1H-NMR-spektrum av konjugering av liganden og kopolymeren PCL
12k-PEG
5k-COOH. Det karakteristiske signalet som fremkommer ved 3,60 ppm (a) ble tildelt til PEG-enheten. Toppene av PCL enhetene vises på 4.4 til 4.8 ppm (b) 2,28 til 2,33 ppm (c), 1,61 til 1,70 ppm (d) og 1,35 til 1,43 ppm (e), som vist i figur 2C. Videre ble signalene ved 2,49 ppm og 3,25 til 3,49 ppm som er tilordnet de oppløsningsmidlet peak (DMSO) og vanntopp, respektivt. I henhold til figur 2E, er det ingen SMLP relaterte signaler som vises i
1H-NMR-spektrum av ukonjugert PCL
12k-PEG
5k-COOH, som indikerer at det ikke er noen interferens med SMLP signaler som er vist på figur 2C .Comparing toppene av PCL-PEG-SMLP i figur 2C og toppene ligand SMLP i figur 2B, de kjemiske skift var identiske. Gre resultatene av FT-IR og
1 H NMR viste at liganden SMLP hadde blitt konjugert til PCL
12K-PEG
5K-COOH. Renheten av ligand konjugert polymerer, som er kritisk i forbindelse med
in vitro
utførelsen av miceller, ble verifisert ved gelpermeasjonskromatografi. Som vist i figur 2D, ble ingen spor av fri SMLP observert i kromatogrammer av enten PCL
12K-PEG
5K-SMLP eller PCL
4.8K-PEG
2K-SMLP, noe som indikerer at dreven fri ligand ble helt fjernet.
utarbeidelse og karakterisering av miceller
i dette arbeidet ble dialyse anvendes for å frem docetaxel-miceller, som fører til vellykket utarbeidelse av nontargeted [PCL
12K-mPEG
5k (PMs1), PCL
4.8k-mPEG
2K (PMs3)] og målrettet [PCL
12K-PEG
5K-SMLP (PMs2), PCL
4.8K-PEG
2K-SMLP (PMs4)] miceller. I tillegg, nanopartikler med diameter større enn 100 nm er mer sannsynlig å bli eliminert av det retikuloendoteliale system [30], mens deres motstykker med diameter mindre enn 100 nm var mer tilbøyelige til å akkumuleres i svulstvevet [31], [32].
De gjennomsnittlige diameter på miceller (PMs1, PMs2, PMs3 og PMs4) utarbeidet av dialyse var 51,4 ± 1,3 nm, 50,5 ± 1,1 nm, 37,1 ± 0,5 nm og 38,6 ± 0,7 nm, henholdsvis. Polydispersitetsindeksen (PDI) verdier av de fire micellene er vist i tabell 1. DLS grafer av PMs1 og PMs2 er vist i Figur 4 (A, B). Morfologien og lav PDI av micellene ble ytterligere bekreftet ved TEM avbildning. TEM fotografi (fig 4, A
1 og B2) av PMs1 og PMs2 var i overensstemmelse med resultatene av DLS. Den mindre diameter av PMS-oppnådd fra TEM-tester sammenlignet med DLS kunne tilskrives den krymping av PEG skallet indusert av vannet fordamper før TEM måling [33]. Som et resultat, er gitt av DLS diameter var større enn den av TEM på grunn av hydratisering av PEG skallet.
TEM grafer av DTX-PMs1 (A
1) og DTX-PMs2 (B
2).
for å evaluere den maksimale narkotika-lasting innhold og stoff-lasting effektivitet av de fire miceller, ble en enkel kortsiktig stabilitet studie av DTX-lastet innhold utført og resultatene er vist i figur 5. Først ble overskudd av DTX tilsatt under tilberedningen av de fire DTX-PMS. Den overbelastede PMS ble holdt ved romtemperatur og samplet på forhånd bestemt tid. Deretter ble DTX-lasting innhold av prøvene målt ved HPLC ved anvendelse av metoden beskrevet. Profilen viste at den første DTX-lasting innhold av de fire PMS var 10,4%, 10,8%, 9,6% og 9,8%, respektivt. Verdiene av DTX-lasting innhold falt gradvis og holdt seg konstant etter 12 timer for PCL
12k-PEG
5k og 24 timer for PCL
4.8k-PEG
2k (Figur 5, sirklet i firkanter ). Reduksjonen i medikament-lasting innholdet kan skyldes forekomsten av faseseparasjon mellom DTX og PCL. Stoffet lasting innhold etter en 7 dager testperioden kan anses som kapasiteten til PCL for lasting DTX. Dessuten kan jo høyere kapasitet PMs1 og PMs2 sammenlignet med PMs3 og PMs4 tilskrives de lengre PCL kjeder av PMs1 og PMs2. Med det samme forholdet av den hydrofile blokklengden til den hydrofobe blokklengden, blir det endelige medikament-lasting innhold og innkapslingseffektiviteten av de fire PMS vist i tabell 1. Resultatene viste en god korttidsstabilitet av DTX-lasting innhold , narkotika-lasting innhold og effektivitet, noe som bekrefter at miceller basert på PCL
12K-PEG
5K-SMLP og PCL
12K-mPEG
5k kopolymerer var optimale formuleringer.
(n = 3).
in vitro
slipper
in vitro
utgivelsen oppførsel av fire DTX-PMs ble undersøkt ved dialyse diffusjon metoden [34]. Frigivelsen av virkemåten Taxotere ble anvendt som en kontroll, og de DTX frigjøringsprofilene for de fire PMS ved pH 7,4 (simulert miljø av normale vev) og pH 5,5 (simulert miljø av tumorvev) er vist i figur 6. Nesten 90% av DTX ble løslatt fra Taxotere innen 24 timer. I motsetning til Taxotere, alle miceller oppviste en hurtig frigjøring av DTX i den innledende fasen (første 24 h), og en forlenget frigivelse over følgende 72 timer. Videre lignende frigjøringsprofilene av PMs1 og PMs2 indikerte at ligand konjugering ikke påvirke utgivelsen mønster.
For de fire PMs, fordi poly ester strukturen i PCL er følsom for syre, utgivelsen av DTX fra micellene var lavere ved pH 7,4 enn ved pH 5,5. Denne effekten fremmet utgivelsen av DTX i tumorvev og i endosomer som er surere enn blod [35]. Mengden av ikke-frigjort DTX var 20-25%. Denne andelen av narkotika eksisterte i micelle kjerner; fanget i Nedbøren generert av varme og tween 80 indusert micellar sammenbrudd og absorbert på dialyse bag og glass [36].
Cell cytotoksisitet
PSMA er en validert molekylær markør overexpressed av LNCaP celler [37] [38]. Den cytotoksisitet forsterke effekten av PSMA ligand (SMLP) konjugert DTX-PMs ble evaluert av in vitro cytotoksiske eksperimenter med LNCaP og PC3 cellene, henholdsvis. Den biokompatibilitet av PCL
12K-mPEG
5K og PCL
12K-PEG
5K-SMLP ble bekreftet ved inkubasjon rusfrie miceller sammensatt av disse to polymerer ved forskjellige konsentrasjoner med LNCaP celler og PC3 celler hhv. Cellelevedyktigheten ble ikke påvirket i løpet av en 72 timers inkuberingsperiode som bekreftet god biokompatibilitet av disse polymerer (figur 7). Resultatene viste også at cellene ikke kan bli forstyrret i nærvær av ligander.
(n = 5).
I denne studien, DMSO løsning av DTX (DSD) var anvendes i stedet for Taxotere som en positiv kontroll på grunn Tween 80 i Taxotere er cytotoksisk, og dette kan påvirke resultatene [39]. I henhold til resultatene av MTT-analyser (figur 8), etter en 48 timers inkubering, cytotoksisiteten til PMs1 var nesten den samme som DSD. Imidlertid PMs2 viste en betydelig lavere LNCaP cellelevedyktighet ved alle konsentrasjoner. I PC3 cellelinjer, var imidlertid ingen signifikant forskjell ble observert i celleviabilitet blant DSD, PMs1 og PMs2 (figur 8). Dette indikerte at liganden konjugering er fordelaktig i å lette cellulært opptak av miceller: som PMs1 og PMs2 viste lignende frigjøringsprofiler, kan den reduserte cellelevedyktighet skyldes økt intracellulær akkumulering av legemidlet via reseptor-mediert endocytose. Etter 72 timers inkubering, både PMs1 og PMs2 viste signifikante forskjeller fra DSD i LNCaP cellelinje, og PMs2 viste størst cytotoksisitet. Dessuten var signifikant mindre celle viabilities observert i PC3 cellelinjer behandlet med enten PMs1 eller PMs2 enn DSD ved medikamentkonsentrasjon på 20 ug /ml, noe som betyr at utilstrekkelig cellulært opptak av miceller kan bli kompensert ved økt inkubasjonstid og medikamentkonsentrasjon. Men det var ingen signifikante forskjeller mellom PMs1 og DSD etter 48 timer inkubasjon i LNCaP celler. Dette fenomenet bekreftet vedvarende legemiddeldosering atferd DTX fra PMs1
in vitro
(*) signifikant forskjellig fra DSD.; (#) Signifikant forskjellig fra PMs1; (N = 5). Merk: * P 0,01,
# P 0,01
Cellen levedyktighet PMs2 20 mikrogram /ml var nesten halvparten av PMs1 for LNCaP celler etter enten 48 timer eller 72 timer. inkubasjon. Disse data viste at DTX-PMs2 var mindre effektiv i å forbedre cytotoksisitet i PC3-celler, mens det selektivt hemmer proliferasjon av LNCaP-celler. I den andre ord, disse resultatene tyder på høy affinitet av SMLP for PSMA kunne forsterke cytotoksisiteten i LNCaP-celler. Etter 72 timers inkubering på LNCaP-celler med mengden av DTX gitt ved en fast konsentrasjon på 20 ug /ml, celleveksthemming pr DSD, PMs1 og PMs2 var 58,4%, 67,7% og 83,9%, respektivt.
IC50 for hver prøve er vist i tabell 2. for LNCaP-celler, IC50 av DTX-PMs2 var mye lavere enn for DTX-PMs1 og DSD etter 48 timers eller 72 timers inkubering. Imidlertid IC50 av DTX-PMs1 var nesten det samme som for DSD etter 48 timers inkubering, men var 5 ganger lavere etter 72 timers inkubering med LNCaP-celler, dette ytterligere bekreftet den kompenserende virkning i cytotoksisitet av miceller ved lengre inkubasjonstid. Selv DTX-PMs2 (målrettet) viste den høyeste celledrepende effektivitet, DTX-PMs1 vises også en effekt på LNCaP celler. Siden de to miceller besatt lignende frigjøringsprofilene, ble forskjellene i cytotoksisitet relatert til deres ulike celle-entry evne som ble reflektert av forskjellene i slektskap til PSMA.
Cellular Opptak
for å studere effekten av PSMA målrettende ligand på det cellulære opptak av PMS ble fluorescens mikroskopi utført på LNCaP-celler med begge målrettede (PMs2) og ikke-målrettede (PMs1) miceller merket med kumarin-6. Etter 4 timer inkubasjon ved 37 ° C, ble HCSS bilder av LNCaP-celler tatt og er vist i figur 9A. Fluorescensintensiteten i celler inkubert med målrettede miceller (PMs2) var betydelig høyere enn for den ikke-målrettede motstykke (PMs1), og kvantifisert fluorescensintensitet ble estimert til å være 5 ganger (figur 9C). Evnen til SMLP konjugering i å forbedre cellulært opptak kan bli reflektert i celleviabilitet analyser. Hvis du vil kontrollere hvilken rolle SMLP i endocytose videre, ble en ligand konkurrerer eksperiment utført. Som vist i figur 8B, tilsetning av frie ligander ved forskjellige konsentrasjoner gradvis redusert opptak av PMs2, og mengden av endocytose miceller nådde et tilsvarende nivå av sin ikke-målrettede motstykke ved høy konsentrasjon av SMLP (100 ug /ml, figur 10B) , noe som indikerte tilstedeværelse av fri SMLP i mediet hemmet endocytose av PMs2 ved å binde seg til overflaten PSMA på en konkurrerende måte mot micelle-konjugert SMLP. For ytterligere å verifisere forbedring av ligand i mediering av endocytose, ble cellulært opptak studier av begge preparater med /uten SMLP ligand utført i PC-3 cellelinje som ikke uttrykker PSMA-proteinet [40]. Som vist i figur 9 (B og C), targeted- og ikke-målrettede miceller viste lignende intracellulære fluorescerende intensitet, noe som betyr at konjugering av SMLP er en viktig faktor for å fremme cellulært opptak av preparerte miceller i PSMA uttrykker celler. Også de ovenfor angitte resultater viste at PMs2 ble endocytose inn i LNCaP-celler via flere ruter: del av micellene ble tatt opp av LNCaP-celler i en SMLP-mediert måte, mens det var miceller inn celler via andre veier, inkludert caveolin endocytose eller clathrin- og caveolin uavhengig endocytose [41] som cellulært opptak av miceller ble ikke fullstendig hemmet av SMLP tillegg. Disse resultatene forklarte høyere cytotoksisitet av målrettede miceller (PMs2) i MTT analyser og indikerte fordel for PMS med en måls ligand i prostata kreft terapi.
cellekjerner ble farget med Hoechst 33342 med den blå kanalen, de kumarin 6-lastet PMS er den grønne kanalen. Den cellulære opptaket ble visualisert ved hjelp av overliggende bilder som vises av kjerner kanal og PMS-kanalen. Fluorescensintensiteten /celle kurve over 100 pg /ml kumarin 6-lastet PMs1 og PMs2 med en konsentrasjon på 200 mikrogram /ml etter fire timers inkubering med LNCaP-celler og PC3-celler (C).
Konklusjoner
i denne studien, en roman selvbygging av DTX-PEG-PCL-SMLP miceller rettet mot LNCaP celler ble utviklet. Med den samme hydrofile /hydrofobe blokklengden forhold, en serie av polymere miceller med diametere mindre enn 60 nm ble fremstilt ved hjelp av dialyse. Stabil ikke-målrettede PMs og målrettede PMs med konstant narkotika-lasting innhold ble oppnådd av kortsiktige stabilitetsanalyser. Pålitelig narkotika lasting og vedvarende slippe oppførsel ble oppnådd på grunn av fjerning av over-lastet narkotika.
