Abstract
Bakgrunn
Formålet med undersøkelsen var å evaluere anticancer aktivitet av noskapin (NOS) og gemcitabin (Gem) kombinasjon (NGC) mot ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), og for å klargjøre den underliggende mekanisme handling.
Metoder
Isobolographic metode ble brukt for å beregne kombinasjonsindeksverdier fra cytotoksiske data. In vitro antiangiogen og apoptotisk aktivitet av Nos, ble Gem og NGC evaluert. For in vivo studier, kvinnelige atymiske nu /nu-mus ble xenopodet med H460-tumorer og effekten av Nos, perle, eller NGC ble bestemt. Protein uttrykk ved immunhistokjemisk farging ble evaluert i høstet tumorvev
Resultater
CI-verdier ( 0,59). Var forenlig med synergistisk atferd mellom Nos og perle. NGC behandling viste signifikant hemmet tube dannelse og økt andel av apoptotiske celler. NGC, Gem og Nos behandling redusert tumorvolumet med 82,9 ± 4,5 prosent, 39,4 ± 5,8 prosent og 34,2 ± 5,7 prosent. Spesielt redusert NGC behandling uttrykk celleoverlevelsesproteiner; VEGF, CD31-farging og microvessel tetthet og forbedret DNA fragmentering og spaltet kaspase 3 nivåer sammenlignet med monoterapi behandlede og kontrollgrupper.
Konklusjon
Nos forsterket anticancer aktivitet av perlen i et tilsetningsstoff for å synergistisk måte mot lungekreft via antiangiogenic og apoptotiske veier. Disse funnene tyder potensiell fordel for bruk av NGC kjemoterapi for behandling av lungekreft
Citation. Chougule MB, Patel A, Sachdeva P, Jackson T, Singh M (2011) Forbedret Anticancer Aktivitet av gemcitabin i kombinasjon med noskapin via antiangiogen og apoptotiske Pathway mot ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 6 (11): e27394. doi: 10,1371 /journal.pone.0027394
Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA
mottatt: 6 august 2011; Godkjent: 16 oktober 2011; Publisert: 15.11.2011
Copyright: © 2011 Chougule et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Økonomisk støtte ble gitt av en forskningssentre i Minoritets Institutions (RCMI) award (G12RR03020-11) og en National Institute of General Medical Sciences /Minority Biomedical Research Support (NIGMS /MBRs) award (5S06GM008111-36) fra National Institutes of Health (NIH ). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall. Flertallet av pasienter diagnostisert med lungekreft tilstede med lokalavansert eller metastatisk sykdom [1], [2]. Mer enn 85 prosent av pasienter med lungekreft har ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Flertallet av nydiagnostiserte NSCLC pasienter til stede med sykdom utenfor rammen for kirurgisk helbredelse og avhenger av systemisk kjemoterapi for å forbedre resultatet sitt [3], [4]. Platinum basert kombinasjonsregimer er førstelinjebehandling alternativ i behandling av NSCLC men deres kliniske verktøyet har vært begrenset på grunn av betydelige toksisitet [4], [5]. Til tross for nylige fremskritt i kjemoterapi, responsrate i NSCLC forbli 50 prosent og en tredjedel av pasienter med stadium IV sykdom har en 2-års overlevelse av 20 prosent [3]. Etableringen av en optimal diett for kombinasjonsbehandlinger med tiden brukes og nyutviklede legemidler er et viktig skritt for å oppnå høyere respons og lengre overlevelse [6]. For å løse dette problemet, har oppmerksomheten vært rettet mot å finne nye kreftlegemidler som vil levere tilsvarende eller bedre overlevelse det som oppnås med platina regimer, men med mindre toksisitet. Gemcitabin (Gem) er en pyrimidin nukleosid antimetabolitt middel som er aktivt mot rekke menneskelige maligniteter, inkludert NSCLC med en gunstig toksisitetsprofil [6], [7]. Flere forskere har studert kombinasjonen av Gem og cisplatin, topotecan, proteasehemmere, og ginsenoside RG3 for behandling av lungekreft [8], [9], [10], [11], [12] og rapportert økt kreft effekter [ ,,,0],8], [9], [10], [11], [12], [13].
anticancer aktivitet av mikrotubul-interfererende midler, taksaner og vinca-alkaloider har blitt godt undersøkt [14]. Imidlertid har den kliniske nytten av taxaner vært begrenset på grunn av medikamentresistens, behov for intravenøs (i.v.) infusjon i løpet av en lang tidsperiode og er forbundet toksisitet [15], [16]. Dette har bedt søk etter microtubule-målsøkende middel som kan administreres oralt, viser gunstige toksisitet profiler og har bedre terapeutiske indekser. Nos demper mikrotubulidynamikk akkurat nok til å aktivere mitotiske sjekkpunkter for å stoppe cellesyklus [17], [18] og demonstrert anti-proliferativ aktivitet mot bredt spekter av kreftceller inkludert mange resistente varianter mens unndra normale celler [18], [19 ], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26]. Videre Nos viste også liten eller ingen toksisitet overfor normale organer og hemmet ikke primære humorale immunrespons i mus [19], [20]. Våre tidligere undersøkelser har vist at oral administrering av Nos viste signifikant anticancer-aktivitet på en doseavhengig måte mot H460-lunge tumorxenografter [24]. Landen et al. viste at det ikke var noen signifikant forbedring i anticancer aktivitet av Nos når den kombineres med paklitaxel [19] muligens på grunn av konkurranse for det samme mål. Bruken av Nos i kombinasjon med vincristin utviser synergistiske antitumoreffekter i leukemiceller in vitro [27]. Imidlertid anticancer potensialet av Nos i kombinasjon med forskjellige anticancer midler i behandlingen av lunge cancer er ikke systematisk undersøkt. Både Nos og Gem har ulik virkningsmekanisme og Nos og Gem kombinasjon (NGC) kan føre til potensiell synergistisk antitumor aktivitet mot lungekreft.
Basert på den enkelte aktivitet av disse midlene og deres forskjellige virkningsmekanismer, vi hypotese om at NGC kan gi additive til synergistiske cytotoksiske effekter i humane lungekreftceller
in vitro Hotell og
in vivo
muligens ved nedbrytning av spesifisitet proteiner, styrke antiangiogen og apoptotisk aktivitet. I foreliggende undersøkelse, evaluert vi anticancer aktivitet av NGC terapi mot NSCLC-celler in vitro og in vivo i H460 murine xenograft lungetumormodell som ikke har vært rapportert tidligere. Målene med denne studien var å (a) undersøke anticancer aktivitet kombinasjon mellom Nos og Gem mot NSCLC celler, og (b) vurdere antitumor effekt av NGC i mus med H460 xenograft lungesvulster og belyse underliggende virkningsmekanisme.
Materialer og metoder
Material
noskapin og gemcitabin ble kjøpt fra Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, USA og Spectrum Chemicals USA hhv. De humane H460 og A549 NSCLC-celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Alle andre kjemikalier var enten reagens eller vev kultur klasse. H460 og A549-celler ble dyrket i RPMI 1640 medium og F12K-medium (Sigma, St. Louis, MO, USA) supplert med 10 prosent fetalt bovint serum hhv. Alt vev kulturmedier inneholdt antibiotisk antimykotisk løsning av penicillin (5000 U /ml), streptomycin (0,1 mg /ml), og neomycin (0,2 mg /ml). Cellene ble holdt ved 37 ° C i nærvær av 5 prosent CO
2 i luft.
Dyr
Dame nu /nu-mus (seks uker gamle, Harlan, Indianapolis, IN ) ble gruppert og plassert (8 /bur) i sterile mikroisolatorbur caging enheten leveres med Autoclaved Tek-Fresh sengetøy. Dyrene ble plassert på Florida A ii) Gem (30 mg /kg intravenøs bolus, Q3D × 7 tidsplan); iii) Nos 300 mg /kg daglig ved oral inntak; og iv) NGC terapi for 38 dager legg svulst implantasjon
. Noskapin ble løst opp i fosfatbuffer, ble pH 3,5 og Gemcitabin er oppløst i saltfosfatbuffer før administrering til mus. For å se etter tegn på toksisitet, ble dyrene veid to ganger ukentlig. Tumor Dimensjonene ble målt ved anvendelse av en lineær målepunktet og tumorvolum ble beregnet ved hjelp av følgende ligning: (1) hvor, etter
v = tumorvolum
a = største diameter av tumoren
b = minste diameter av tumoren
på dag 38 ble alle dyr avlivet etter fjerning av tumorvev; noen av tumorene ble fiksert i formalin, mens andre ble hurtig frosset i flytende nitrogen og lagret i -80 ° C.
Western blotting av tumorvev
Proteinene ble ekstrahert fra tumorvev ved hjelp av RIPA buffer med protease inhibitor inkubert i 30 minutter på is, og supernatantene ble lagret ved -80 ° C etter sentrifugering. For western blotting (WB), ble en tidligere etablert prosedyre i laboratoriet brukes. [24], [28] Membranene ble undersøkt med primære antistoffer (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) SP1 (1:750), SP3 (1:750), VEGF (1:500), Pakt (1:500) , cyclin D1 (1:500), p53 (1:500), p21 (1:500),), PARP (1:1000), kløyvde PARP (1:1000), kløyvde caspase 3 (1:1000), caspase 8 (1:1000) og caspase 9 (1:1000), Bax (1:1000), Bcl
2 (1:1000), BID (1:500) og p-aktin antistoffer (1:500). Bundet antistoffer ble avslørt med HRP konjugerte sekundære antistoffer (1:2000) ved hjelp SuperSignal West pico kjemiluminescens løsning (Pierce, Rockford, IL). Beta-aktin-protein ble anvendt som en kontroll lasting. Den densitometrisk analyse av bandene ble utført ved hjelp av programmet ImageJ v1.33u.
TUNEL analysen, kløyvde caspase 3 uttrykk og VEGFexpression
tunel, kløyvde caspase-3 og VEGF farging i parafin- innebygde tumorvev seksjoner ble evaluert ved hjelp DeadEndTM Colorimetric apoptose Detection System (Promega, Madison, WI), kløyvde caspase-3 flekker kit (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) og ImmunoCruz ™ ABC farging System (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) henholdsvis, som beskrevet tidligere [26]. Tumor vevssnitt (4-5 um tykt) montert på poly-L-lysin-belagte lysbilde ble deparaffinized av xylen og dehydrert gjennom graderte konsentrasjoner av alkohol, og deretter inkubert med 3 prosent hydrogen peroksydase i 20 minutter for å blokkere endogen peroksidase-aktivitet. Antigen gjenfinning for farging og blokkering av endogen peroksidase ble utført som beskrevet tidligere [26]. Prøvene ble inkubert over natten ved 4 ° C med 1:50 fortynning av primært antistoff ble inkubert med biotinylert sekundært antistoff, etterfulgt av streptavidin. Fargen ble utviklet ved eksponering av peroksidase til et substrat-chromagen, som danner et brunt reaksjonsprodukt. Seksjonene ble deretter kontra med hematoksylin. Tre lysbilder per gruppe var farget og TUNLE, spaltes caspase 3 fargede celler ble identifisert ved mørk brun cytoplasma farging. VEGF-fargede celler ble identifisert ved brun farging. Bildene på lysbildene ble visualisert med et Olympus BX40 lysmikroskop.
CD31 uttrykk og vurdering av microvessel Tetthet
For CD31 uttrykk etter vask med PBS, ble seksjonene forbehandlet i citratbuffer i en mikrobølgeovn i 20 min ved 92-98 ° C. Etter to vaskinger med PBS, ble prøvene inkubert i 10 prosent normalt geiteserum (Atlanta Biologicals, GA, USA) i 20 minutter for å redusere ikke-spesifikk antistoffbinding. Deretter ble seksjonene deretter inkubert med et 1:500 fortynnet mus CD31-monoklonalt antistoff (Cell Signaling Tech, MA), som er anerkjent som en endotel-celleoverflatemarkør, ved romtemperatur i 1 time, etterfulgt av en 30 minutters behandling med HRP kanin /Mouse (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Seksjonen ble utviklet med diaminobenzidene-hydrogen peroxydasesubstrat, og lett kontra med hematoksylin. For å beregne microvessel tetthet (MVD), ble tre mest vaskulære områder av svulsten ( «hot spots») valgt og middelverdier oppnådd ved å telle fartøy. En enkelt microvessel ble definert som en diskret klynge av celler som var positive for CD31-farging, uten krav om tilstedeværelsen av et lumen. Microvessel tellinger ble utført ved X400 (X40 objektiv og X10 okulær objektivet, 0,74 mm
2 per felt).
statistikker
En vei ANOVA etterfulgt av Tukey multiple sammenligningstest ble utført for å fastslå betydningen av forskjeller mellom grupper ved hjelp GraphPad PRISM versjon 3.0 software (SanDiego, CA). Forskjeller ble betraktet som signifikant i alle forsøk på
P
0,01 (*, vesentlig forskjellig fra ubehandlede kontroller;.
**, signifikant forskjellig fra Nos og Gem enkle behandlinger
Resultater
Synergistic
in vitro
cytotoksisitet av NGC behandling
in vitro cytotoksiske studier med Nos mot H460 og A549 celler viste IC
50 verdier på 34,7 ± 2,5 mikrometer og 61,25 ± 5,6 uM respektivt. Gem viste IC
50 på 0,7 ± 0,1 ug /ml og 0,6 ± 0,2 ug /ml mot H460 og A459 NSCLC-celler. De kombinerte effekten av Gem og Nos på celleproliferasjon ble evaluert ved isobolographic analyse. CI- verdiene varierte fra 0,34 ± 0,02 til 0,59 ± 0,04 for 50 prosent celle drepe tyder synergistisk til sterk synergistisk atferd mellom Nos og Gem mot både NSCLC cellelinjer (figur 1A). isobologrammer for 50% effektnivå viser at IC
50 -equivalent konsentrasjoner for ulike Nos /Gem kombinasjoner ble plassert under streken av additivity, indikerer synergis activityof Nos og Gem kombinasjon (fig. 1B). Utskillelsen av punktene i isobologram var konsistent med at av CI verdier.
Ulike konsentrasjoner av Nos ble ansatt for å studere effekten på IC50 av Gem. Variable prosenter av legemiddelkonsentrasjoner og gjensidig ikke-eksklusive ligninger ble brukt til å bestemme CI. CI verdiene representerer gjennomsnittet av fire eksperimenter. CI 1.3: antagonisme; CI 1,1-1,3: moderat antagonisme; CI 0,9-1,1: additiv effekt; CI 0,8-0,9: svak synergisme; CI 0,6-0,8: moderat synergisme; CI 0,4-0,6: synergisme; CI 0,2-0,4. Sterk synergi
Antiangiogen effekt-rør-analysen
Nos (30 mm), Gem (0,3 mikrogram /ml) og 30 mikrometer Nos + 0,3 mikrogram /ml Gem behandling i 6 timer viste dårlig organizationof HUVEC rør-lignende strukturer og en reduksjon i kapillar-rør gren punktformasjoner (fig. 2A) sammenlignet med kontroll-gruppen som viste en rik nettvare av forgrenings anastomosering av kapillær-lignende tubuli med flersentkryss (fig. 2). NGC behandling redusert formulering av gjennomsnittlig forgreningspunktet ved 68 ± 5 prosent sammenlignet med 26 ± 3 prosent av Nos alene og med 29 ± 4 prosent Gem alene (Fig. 2B).
For tube-analysen, HUVEC celler inkubert med Nos (30 uM), Gem (0,4 ug /ml) og NGC på polymeriserte Matrigel ved 37 ° C. Etter 6 timer ble røret dannelsen av endotelceller fotografert og kapillarrøret forgrening dannelse ble kvantifisert (n = 3). For TUNEL assay, ble H460-celler behandlet med Gem 0,4 ug /ml, Nos 30 uM, og, NGC og A549-celler ble behandlet med Gem 0,3 ug /ml, Nos 50 uM, og, NGC. Kontrollceller var ubehandlet. Micron bar = 10 mikrometer. Celler ble kvantifisert ved å telle 100 celler fra 6 tilfeldige mikroskopiske felt. Data er uttrykt som gjennomsnitt + SD (n = 6).
Induksjon av apoptose i H460 og A549 celler
Fig. 2C viser at apoptose indusert i H460 og A549 celler etter behandling med Gem, eller Nos, eller NGC. NGC behandling førte til apoptose i 59 ± 4 prosent av behandlede H460 celler sammenlignet med 27 ± 3 prosent og 20 ± 2 prosent i Gem og Nos henholdsvis etter 72 timer (fig 2D og 2E). Tilsvarende NGC behandling av A549-celler førte til 67 ± 5,0 prosent apoptotiske celler sammenlignet med 32 ± 2,0 prosent og 20 prosent ± 3,0 i henholdsvis Gem og Nos (figur 2D og 2E). Alle behandlinger var signifikant forskjellig fra kontrollen (* P 0,01). Gem eller Nos behandling var signifikant forskjellig fra NGC behandling (**, P 0,001).
Anti-tumor aktivitet av NGC i H460 xenografter
Resultatene (Fig. 3) viser at tumor volumet betydelig redusert etter behandling med Gem, Nos, eller NGC sammenlignet med kontroll. Tumor volum for NGC behandling i gjennomsnitt 418.74 ± 55,53 mm
3 sammenlignet med 1605.08 ± 253,29 mm
3 for Nos behandling eller 1498.33 ± 149,38 mm
3 for Gem behandling (tumor volum ± SE) på dag 38 post svulst implantasjon. Videre har vi ikke observere noen vekttap eller andre tegn på toksisitet hos mus behandlet med NGC eller Nos eller perle.
Musene ble behandlet med Gem 30 mg /kg intravenøst bolus, Q3D × 7 tidsplan, Nos 300 mg /kg /dag, og NGC. Kontrollgruppen fikk bare kjøretøy. Data presentert er midler og SE (n = 8). Dette eksperimentet ble gjentatt to ganger.
Effekter på spesifisitet proteiner, angiogene og apoptotiske proteiner i H460 xenograft lungesvulster
NGC og Gem redusert uttrykk av SP1 og sp3 i høstet svulster i forhold til kontrollmus (fig 4). NGC behandling redusert ekspresjon av VEGF-proteinet uttrykket til 0,26 ganger sammenlignet til 0.12 ganger med skrifter og 0.13 ganger med Gem behandling, henholdsvis av kontrollene i tilbakedannede tumorer (figur 4). Uttrykket av survivin protein ble signifikant redusert med 0,67 ganger 0,29 ganger og 0,37 ganger med NGC, Gem og Nos behandling sammenlignet med kontroll gruppe henholdsvis (figur 4). NGC viste signifikant reduksjon i ekspresjon av pakt sammenlignet med kontroll-gruppen. I tilbakedannede tumorer, NGC og Gem betydelig redusert Cyclin D1 uttrykk til en 0,39, 0,20 og 0,15 ganger, henholdsvis av kontroller (fig 4). Nos, Gem og NGC behandling betydelig økt p53 uttrykk til 1,2, 1,3 og 1,6 ganger i tilbakedannede tumorprøver i forhold til å kontrollere hhv. (Fig 4) Uttrykk for p21 ble betydelig økt til 1,31 ganger med NGC behandling sammenlignet med 1,15 og 1,13 ganger med henholdsvis Nos og Gem behandling (figur 4). Resultater er vist i figur 5 viser at Nos, Gem og NGC behandling viste signifikant økt uttrykk av spaltet PARP, Bax, BID, caspase 3, kløyvde caspase 3, caspase 8 og caspase 9, og redusert uttrykk av PARP og Bcl
2 sammen for å kontrollere gruppe. Uttrykket av apoptotiske og antiapoptotic proteiner i NGC behandling var signifikant forskjellig fra monoterapi behandlingsgruppene
Lane 1, ubehandlede kontroll svulster.; kolonne 2, oral Nos 300 mg /kg; spor 3, Gem 30 mg /kg i.v. bolus, Q3D × 7 tidsplan; kjørefelt 4; NGC. p-aktin protein fungerer som en lasting kontroll. Lignende resultater ble observert i triplikate eksperimenter. Protein ekspresjonsnivåer (i forhold til p-aktin) ble bestemt. Gjennomsnitt ± SE for tre replikate bestemmelser
Lane 1, ubehandlede kontroll svulster.; kolonne 2, oral Nos 300 mg /kg; spor 3, Gem 30 mg /kg i.v. bolus, Q3D × 7 tidsplan; kjørefelt 4; NGC. p-aktin protein fungerer som en lasting kontroll. Lignende resultater ble observert i gjentatte eksperimenter. Protein ekspresjonsnivåer (i forhold til p-aktin) ble bestemt. Gjennomsnitt ± SE for tre replikere bestemmelser.
DNA-fragmentering og kløyvet caspase-3 uttrykk i tumorvev
Single-agenten behandling med enten Nos eller perle indusert DNA-fragmentering, som ble ytterligere betydelig (** P 0,001) økte med NGC behandling. NGC behandling førte til apoptose i 80 ± 5,0 (** P 0,01) prosent av tumorcellene, mens Nos og Gem indusert apoptose i 34 ± 3,0 prosent og 42 ± 4,0 prosent av tumorcellene henholdsvis (fig. 6). Gem, Nos, og NGC indusert kløyvde caspase-3 uttrykk i tumorer som var signifikant forskjellig i forhold til å kontrollere svulster. NGC, Gem og Nos behandling viste henholdsvis 62 ± 4,0, 34 ± 2,0, og 26 ± 2,0 prosent økt ekspresjon av spaltet caspase 3 i tumorer vev sammenlignet med kontrollgruppen (Fig. 6).
Data er uttrykt som mener + SD (N = 6).
Hemming av angiogenese og MVD i svulstvev
Den høyeste uttrykk for VEGF ble sett i tumorvev høstet fra ubehandlet mus (fig. 6 ). Redusert VEGF farging ble observert i tumorer behandlet med NGC (0,28 ganger) sammenlignet med tumorer behandlet med Gem (0,15 ganger) eller Nos (0,1 ganger) alene. Denne respons ble godt korrelert til nedregulering av VEGF-protein observert i tumorlysatene fra mus behandlet med de samme forbindelser (fig. 4). CD31 (+) endotelceller ble identifisert ved hjelp av IHC-teknikken i høstede tumorvevet, og resultatene er vist i fig. 6. farging av mikrokar i NGC, Gem og Nos behandlede gruppene var signifikant redusert til 0,21, 0,08, og 0,06 ganger sammenlignet med kontrollgruppen. Den gjennomsnittlige microvessel per felt i grupper behandlet med Nos, Gem og NGC ble funnet å være 148,7 ± 18,6, 135,3 ± 17,5 og 91,8 6,1 henholdsvis i forhold til 197,7 ± 22,4 i kontrollgruppen.
Diskusjoner
dårlig klinisk resultat av den aktuelle kjemoterapi nødvendiggjør søk etter nyere terapeutiske strategier for behandling av NSCLC [1], [3], [4]. Utviklingen av potente nonplatinum baserte kombinasjonskjemoterapi med færre uønskede bivirkninger som vil bidra til å forbedre klinisk resultat hos lungekreftpasienter [3], [4], [5]. Bruken av lovende anti-mikrotubulære midler har vært begrenset på grunn av medikamentresistens, forlenget i.v. infusjon og tilhørende uønskede bivirkninger [15], [16]. Nos er en sikrere oralt aktiv mikrotubuli-middel [19], [20], [23] og har vist in vitro og in vivo antitumoraktivitet mot forskjellige krefttyper [19], [20], [21], [22] [23]. Våre tidligere studier vist at Nos utstilt kreft aktivitet i murine H460 xenograft modell med ingen uønskede bivirkninger [24]. Perlen er en av de mest effektive midler mot lungekreft som hemmer DNA-syntese og ribonukleotidreduktase [6], [7]. Således er det forventet at NGC kjemoterapi kan utøve additiv eller synergistisk anticancer aktivitet, og vil ha lavere uønskede bivirkninger på grunn av redusert dose behov for Gem.
De hurtig voksende H460 og langsomt voksende A549-celler [28] ble selektert for å fastslå aktiviteten av Nos og Gem kombinasjon ved under IC
50 konsentrasjoner ved hjelp av vanlig brukt isobolographic metoden [28], [29], [30]. I den foreliggende undersøkelse, isobolographic analyse av dataene viste at Nos forbedret cytotoksisiteten av Gem (CI-verdier lt; 0,59) i A549 og H460-humane NSCLC-celler i en synergistisk måte (figur 1A). Den synergistiske aktivitet ble også observert i isobologram, hvor IC
50 ekvivalente konsentrasjoner for forskjellige NGC ble plassert under den linje av additivitet (figur 1B). Vi har nylig rapportert at CI-verdier lt; 1,0 indikerer synergistisk aktivitet mellom DIM-C-pPhC
6 H
5and Docetaxel i NSCLC celler [28]
For å studere mulig mekanisme involvert i. forbedret cytotoksisitet av Gem av Nos, evaluert vi HUVEC tube dannelse og apoptose av tumorceller [31]. Newcomb et al. rapportert at Nos (0-150 mm) hemmet
in vitro
tube-formasjonen i 2H11 endotelceller [32]. Tilsvarende Laquente et al viste også hemming av spredning av HUVEC celler ved Gem [33], og dermed har vi vurdert den antiangiogene potensialet i NGC. Det har ikke vært studie så langt for å evaluere effekten av GNC på HUVEC tube formasjonen. NGC viste de lineære strukturer av nettverket ble betydelig forstyrret forhold til monoterapi behandling eller kontroller. NGC viste synergistisk anti-angiogen aktivitet ved hemming av rør dannelse i forhold til Nos eller perle alene (figur 2).
Induksjon av apoptose er viktige mekanismer for cytostatika og signifikant induksjon av apoptose som var tydelig fra positiv TUNEL farging og kromatin kondens i NGC behandling sammenlignet med monoterapi. I likhet med våre resultater, kombinasjonsbehandling av Nos (150 mg /kg /dag med sonde) og
60Co stråling (enkelt fraksjon – 25 Gy) viste signifikant (
P
0,01) økte TUNEL positiv GL261 celler sammenlignet med monoterapi behandling [33].
Etter å ha etablert effektiviteten av NGC behandling
in vitro
, neste vurderte vi
in vivo
antitumor effekt av NGC i H460 xenograft lungesvulster i nu /nu mus. Vi valgte sub-terapeutiske doser av Nos (300 mg /kg /dayand Gem (30 mg /kg iv bolus, iv bolus, Q3D × 7 tidsplan) basert på våre tidligere studier som har vist doseavhengig anticancer aktivitet (300 450 550 mg /kg /dag) av Nos mot H460 xenograft musemodell [24]. Vi
in vivo
resultater viser additiv oppførsel av NGC i murine H460 xenograft tumormodell (figur 3A). Forrige rapporterte studier viste at anticancer aktiviteten av Nos varierer med type og følsomheten av kreftceller [19], [20], [21]. Interessant nok NGC behandling viste ikke-signifikant endring i vekttap som tyder på fordelaktig toksikologisk profil Nos og Gem. NGC behandling vil være en fordel i forhold til konvensjonell Gem + taxan behandling av lungekreft på grunn av forbedret pasientens etterlevelse av oral administrering av Nos med minimale uønskede bivirkninger. Flere studier har gitt bevis for at forbedret tumorveksthemning kan oppnås ved å kombinere perle med andre midler, for eksempel bortezomib [34] , Telomelysin [35], Dihydroartemisinin [36], Paclitaxel [37], og topotekan [38] sammenlignet med monoterapi behandling.
in vivo
additiv aktivitet av NGC behandling kan tilskrives dårlig biotilgjengelighet ( 30%), kortere plasma halveringstid ( 4,5 h) og omfattende førstepassasjemetabolisme av Nos redusere tilgjengeligheten Nos på tumorstedet [39], [40], [41]. Våre fremtidige studier vil fokusere på å forbedre biotilgjengeligheten av Nos å utforske sin kreft potensial i kombinasjon med perle.
Basert på
in vitro
antiangiogen og apoptotiske aktiviteten vi har evaluert uttrykk for Sp proteiner, celle overlevelse, VEGF og apoptotiske proteiner. Sp proteiner er transkripsjonsfaktorer som er overuttrykt i mange humane tumorer [42], [43]. Lou et al. viste at transformasjon av fibroblaster resulterte i økning i SP1 uttrykk ved 8-18 ganger og viste dannelse av svært ondartede svulster i atymiske xenograft modeller [44]. For tiden tid, viste vi at NGC behandling viste signifikant (p 0,01) reduksjon i uttrykket av SP1 og SP3 proteiner sammenlignet med monoterapi behandlingsgruppen og kontrollgruppen. Tidligere studier har vist at VEGF uttrykk er delvis avhengig av Sp proteiner [45], og det er også bevis for at survivin uttrykket er Sp avhengig [46]. Gem, Nos og NGC behandling redusert uttrykk for survivin i lungesvulster (fig 4A og 4B). Survivin er et medlem av inhibitoren av apoptose familie som inhiberer caspaseaktivering og virker som en negativ regulator [46]. Derfor er nedregulering av ekspresjon Survivin resulterer i aktivering av kaspaser og derved induserer apoptose i tumorceller. Vi observerte også at NGC behandling betydelig redusert uttrykk av VEGF (Fig 4D) i tilbakedannede tumorer sammenlignet med monoterapi behandling. Tilsvarende Papineni et al viste at tolfenamsyre hemmer kreftfaren gjennom undertrykkelse av Sp proteiner og flere Sp-avhengige gener og proteiner som VEGF, survivin, cyclin D1 og BCL-2 [47]. Nos alene og NGC behandling viste redusert ekspresjon av VEGF og Survivin, som kan korreleres til degradering av Sp1 og SP3. Videre våre IHC resultater viser at NGC behandling redusert VEGF og CD 31 flekker i tumorvev høstet fra mus sammenlignet med monoterapi behandling og kontroll (figur 6A).
