Abstract
Bakgrunn
TLR9 agonist CpG er i økende grad brukt i prekliniske og kliniske studier som en terapeutisk modalitet for å forbedre svulst immunitet. Den kliniske anvendelse av CpG synes imidlertid mindre vellykket enn det som ville bli forutsagt fra dyrestudier. En årsak kan være de ulike administrasjonsveier benyttet i de fleste mus studier og kliniske studier. Vi undersøkt om effekten av CpG som adjuvans i kreft immunterapi er avhengig av rute for CpG administrasjon, særlig når svulsten er destruert
in situ
.
Metodikk /hovedfunnene
i situ svulst ødeleggelse teknikker er minimalt invasive terapeutiske alternativer for behandling av (nonresectable) solide tumorer. I motsetning til kirurgisk reseksjon, fører tumor ødeleggelse til induksjon av svake men tumor-spesifikk immunitet som kan bli styrket ved coapplication av CpG. Som i situ svulst ødeleggelse av cryosurgery skaper en umiddelbar lokal frigjøring av antigener, vi brukt denne modellen til å studere effekten av CpG å forbedre antitumor immunitet når administreres via forskjellige ruter: peritumoral, intravenøs og subkutan men fjernt fra svulsten. Vi viser at peritumoral administrering er overlegen i aktivering av dendrittiske celler, induksjon av tumor-spesifikke CTL og langvarig beskyttelse tumor. Selv om intravenøs og subkutan (på fjernt stedet) eksponeringer blir ofte brukt i kliniske studier, de bare ga delvis beskyttelse eller ikke klarte å forbedre antitumor responser som induseres av cryosurgery alene.
Konklusjon /Betydning
CpG administrasjon forbedrer effekten av in situ svulst ødeleggelse teknikker, forutsatt at CpG administreres i umiddelbar nærhet av de frigitte antigener. Derfor denne studien bidrar til å gi retninger for å få fullt utbytte av CpG som immunstimulerende i en klinisk setting
Citation:. Nierkens S, den Brok MH, Roelofsen T, Wagenaars JAL, Figdor CG, Ruers TJ, et al . (2009) Svei Administrasjon av TLR9 Agonist CpG Kritisk Bestemmer Effekt av kreft Immunterapi i Mus. PLoS ONE 4 (12): e8368. doi: 10,1371 /journal.pone.0008368
Redaktør: Roberto F. Speck, Universitetssykehuset Zurich, Sveits
mottatt: 11 oktober 2009; Godkjent: 25 november 2009; Publisert: 18.12.2009
Copyright: © 2009 Nierkens et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble gjort mulig ved tilskudd av den nederlandske Cancer Society (KWF-2003-2893, KWF-2004-3137, KWF-2005-3325). SN er stipendiat av den nederlandske Kreftforeningen (KWF, Amsterdam, Nederland). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kirurgisk reseksjon av solide svulster generelt tilbyr den beste muligheten for helbredelse hos kreftpasienter. I mange tilfeller imidlertid tumorlesjoner er ikke kvalifisert for reseksjon og kreve alternative ødeleggelse teknikker, slik som cryosurgery, radiofrekvens eller laser ablasjon. Disse metodene har minimalt invasive behandlinger for et stort spekter av svulster. Faktisk ble radiofrekvens funnet å gi lokal tumorkontroll tilsvarer reseksjon i en undergruppe av pasienter [1], understreker at in situ svulst ødeleggelse teknikker blir stadig mer vellykkede behandlingsmetoder.
I motsetning til kirurgisk reseksjon, in situ svulst ødeleggelse gir et antigen kilde tilgjengelig for immunceller. Involvering av immunsystemet i clearance av kreftceller blir stadig mer verdsatt [2]. Antigen-presenterende celler (APC), slik som dendrittiske celler (DC), er godt utstyrt for å fagocyttere døende celler og fremgangsmåte tumorantigener for presentasjon til T-lymfocytter [3]. Faktisk, nyere data viste at DC i tumor drenering lymfeknuter effektivt skaffe svulst rusk følgende in situ svulst ødeleggelse [4]. Dessverre, selv tumor-ablasjon har vært assosiert med forekomsten av aktivering av immunsystemet hos noen pasienter [5], den utvekst av fjerne mikrometastaser innebærer at ingen eller svake systemiske beskyttende immunresponser indusert.
Bruk av en nylig utviklet musemodell vi tidligere har vist at in situ-tumor ødeleggelse ved hjelp av kryokirurgi eller radiofrekvensablasjon resulterte i induksjon av svake men tumor-spesifikk immunitet [6], [7]. Disse resultatene antydet at kombinasjonen av in situ tumor destruktive behandlingsmetoder med spesifikk immunstimulering kan være en strategi for å forbedre den kliniske resultatet for et økende antall kreftpasienter.
I dette henseende toll-lignende reseptor (TLR ) agonister er av stor interesse som immun adjuvanser. TLR er en familie på patogen anerkjennelse reseptorer som utløses ved gjenkjenning av patogen-forbundet molekylære mønstre uttrykt av en mangfoldig gruppe av smittsomme mikroorganismer. Interessant, den immunstimulerende potens av Bacille Calmette-Guerin (BCG), som allerede er benyttet i 1970-årene for å stimulere antitumorimmunitet [8], er nå kjent for å være BCG DNA som binder til TLR9 [9], [10]. Videre studier viste at DC uttrykke TLR9 og er direkte aktiveres gjennom binding av TLR9 å unmethylated CpG motiver i DNA [8]. DC-aktivering av CpG omfatter en signalkaskade som kulminerte i aktivering av transkripsjonsfaktorer, f.eks nukleær faktor-kB (NF-kB), etter oppregulering av kostimulerende molekyler og produksjon av kjemokiner og cytokiner (for eksempel IL-6, IL-12, TNF-a). Som et resultat av CpG-stimulerte DC indusere Th1-responser og er medvirkende for aktivering av CD8
+ cytotoksiske T-lymfocytter (CTL).
Ja, vi tidligere har rapportert at antitumorresponser ble synergistisk øket når CpG var anvendes som en adjuvans i cryo ablasjon modell. Ko-injeksjon av CpG øket dannelsen av tumor-spesifikke CD8
+ CTL og beskyttet ~ 100% av musene mot en re-utfordring med tumorceller i denne modellen [6]. I andre modeller, har CpG vist seg effektive i å hindre tumor utvekst på en profylaktisk miljø og også utryddet etablerte tumorer i mus [11], [12]. Anvendelsen av CpG i kliniske studier synes imidlertid mindre vellykket enn det som ville bli forutsagt fra dyrestudier. Et vanlig argument som brukes er differensial uttrykk for TLR9 i DC mellom mus og menneske. TLR9 er rikelig uttrykt i plasmacytoid DC (PDC) fra mus og menneske, og i murine myeloid DC (MDC). For human MDC, er TLR9 uttrykk mindre klart som noen studier rapportert svake til negative uttrykk [13], [14], mens en fersk undersøkelse viser at menneskelige MDC ikke inneholder TLR9 protein i mengder sammenlignbare med PDC [15]. Videre MDC og PDC synes å være funksjonelt koblet på begge arter som intensiv krysstale mellom DC undergrupper er viktig for CpG-indusert aktivering av immunsystemet i både mus og mennesker [16], [17].
bemerkes at i murine studier, viser de mest potente CpG virkninger, som CpG leveres sammen med antigenet eller i nær tilknytning til tumorantigener [12], [18], [19], [20]. Dessuten har vi nylig rapportert at samlokalisering av antigen og CpG i DCs endosomal avdelinger in vivo er nært knyttet til evnen til å kryss tilstede antigen og induksjon av påfølgende beskyttende immunitet etter ablasjon [21]. I kliniske studier rute for CpG administrasjon er sjelden basert på plasseringen av svulsten, men er vanligvis ledet av leverandørens forskrifter og /eller enkel administrasjon. Ettersom disse forskjellene i CpG administrasjonsveier kan ha store konsekvenser for den kliniske effekten, sammenlignet vi effekten av CpG administrert via forskjellige ruter i forhold til området av antigen tilgjengelighet i en unik murine tumor ablasjon modell. Våre data viser at intravenøs (i.v.) og subkutan (s.c.) veier CpG administrering (for det meste anvendes i den menneskelige omgivelser) er langt mindre effektive enn peritumoral (P.T.) CpG-injeksjoner. Vi konkluderer med at det fiasko eller suksess av CpG administrasjon kritisk avhenger av plasseringen av CpG administrasjon i forhold til plasseringen av svulsten.
Materialer og metoder
Mus og tumorceller
C57BL /6n mus (6-8 uker gamle) ble kjøpt fra Charles River Wiga (Sulzfeld, Tyskland) og holdt under patogenfrie barriere forholdene på Central Animal Laboratory (Nijmegen, Nederland). Drikkevann og standard laboratorie mat pellets ble gitt ad libitum og mus fikk lov til å bosette seg i minst en uke før tilfeldig oppdrag i spesifikke behandlingsgruppene. Forsøkene ble utført i henhold til retningslinjene for dyr vare på Nijmegen dyreforsøk komiteen.
OVA-transfekterte murine melanoma cellelinje B16F10 (B16OVA, klone MO5) ble vennlig levert av dr. K. Rock [22] og dyrket i komplett medium (MEM, 5% føtalt bovint serum (Greiner Bio-on), 100 U /ml penicillin G-natrium og 100 ug /ml streptomycin (Pen /Strep), MEM natriumpyruvat (1 mM), NaH
2CO
3, MEM vitaminer, MEM ikke-essensielle aminosyrer (alle fra Invitrogen), 20 uM β-merkaptoetanol (β-ME)) supplert med 30 ug /ml hygromycin og 1 mg /ml G418. Den B16F10 melanom-cellelinjen ble oppnådd fra American Type Culture Collection og holdt i komplett medium.
tumormodell og kryokirurgi
Tumorceller ble suspendert i en blanding av PBS og Matrigel (02:01 ) og 0.5 * 10
6 celler i et totalvolum på 50 ul ble injisert sc til høyre femur. Når tumordiameter målt mellom 6-8 mm (vanligvis på dag 9-10), mus ble tilfeldig inndelt i behandlingsgrupper (ikke-behandlede, NT, cryo-ablasjon; cryo). Cryo ablasjon ble utført under isofluran /O
2 /N
2o anestesi ved hjelp av en flytende nitrogen cryo ablasjon system (CS76, Frigitronics, Shelton, CT) av hvilken spissen er avkjølt av en kontinuerlig strøm av sirkulerende flytende nitrogen. I løpet av 2 behandlings sykluser av frysing og tining svulsten var makroskopisk frosset, og samtidig la omliggende sunt vev intakt. For å overvåke induksjon av langvarig tumor beskyttelse, mus ble gjen utfordret med 25 * 10
3 B16OVA celler 40 dager etter cryo ablasjon. To måneder senere, mus som overlevde den første svulsten re-utfordringen fikk en andre re-utfordringen med 5 * 10
4 B16OVA eller B16F10 celler. Mus ble avlivet når tumorvolum overskredet 1000 mm
3, eller når tumorer bremse gjennom hudbarrieren.
CpG 1668 ( «5-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3») med phosphorothioated ryggrad ble innkjøpt fra Sigma Genosys (Haverhill, UK). CpG ble injisert i PBS P.T. (100 ug fordelt over 3 injeksjoner på 10 ul rundt svulsten), i.v. (100 ug i 100 ul), eller s.c. (100 ug i 30 ul til venstre femur i mus, dvs. på kontra laterale side av musen referert til plasseringen av svulsten). Injeksjonene ble utført innen 30 minutter etter ablasjon. Vi brukte CpG 1668, som er en type B CpG, ligner på klinisk kvalitet tilgjengelig CpG i dag brukes i kliniske studier.
berikelse og Analyser av DC
For å analysere DC biologi, DC var isolert fra inguinale lymfeknuter drenering av svulsten. Lymfeknuter ble skåret ut og most bruker nåler eller glassplater og fordøyd i collagenase type II og DNase i 15 min. Etter tilsetning av EDTA og re-susp ble cellene anvendt på et filter for å fjerne rusk og DC ble beriket av positiv seleksjon ved hjelp av anti-CD11c-merket (N418) magnetiske mikroperler (Miltenyi Biotec BV).
Å studere skjebnen til antigenet og CpG etter Cryo ablasjon, ble tumorer injisert med fluorescens-merket OVA-protein (OVA-Alexa488 eller OVA-Alexa647, 20 ug /20 ul) og Cy5-merkede CpG (CpG-Cy). CD11c-anrikede celler ble inkubert med Fc blokk (CD16 /CD32; 2.4G2) og farget med anti-CD11c (HL3), biotinylert anti-CD80 (1G10 /B7) eller isotype kontroller og streptavidin-PE, alt oppnådd fra BD Biosciences. Uttrykk for CD80 ble analysert i OVA
+ og OVA
– celler gating på CD11c
+ celler ved flowcytometri (FACS Calibur, Becton Dickinson Co, San Jose, California). Det ble tidligere rapportert at opptaket av modellen antigen OVA ved benmarg-avledede like stor grad avhenger av mannosereseptoren [23]. Derfor vi gjentok våre eksperimenter med BSA-Alexa488 og ingen forskjeller i opptak av DC in vivo ble observert mellom de to antigener (data ikke vist).
Ex Vivo T Cell Monitoring
Celler fra milt og tumordrenerende lymfeknuter ble stimulert i 5 timer med PMA (0,5 ug /ml) /ionomycin (0,1 ug /ml) i nærvær av Brefeldin A (10 ug /ml). Celler ble analysert for CD8 og intracellulær ekspresjon av IFN-γ ved hjelp av strømningscytometri. I tillegg, ble celler stimulert med anti-CD3 eller OVA-protein i 96 timer for å analysere sekresjon av IFN-γ i supernatanten. IFN-y ELISA ble utført i henhold til produsentens instruksjoner (BD Biosciences).
antigenspesifikke CTL
For å studere effekten av differensial CpG administrasjonen å indusere antigenspesifikke CTL, milten og tumor-drenering lymfeknuter ble isolert ti dager etter ablasjon. Blandede cellesuspensjoner av lymfeknute og milt ble sådd ut i 24-brønners plater i fullstendig IMDM supplert med hIL2 (10 U /ml) og stimulert med bestrålte (1600 rad) B16OVA-celler (5 * 10
4 celler /brønn) som var blitt behandlet over natten med r-IFN-γ (50 U /ml) for å oppregulerer MHC klasse i presentasjonen. På dag 3-4 av kultur, ble cellene høstet og døde celleavfall ble fjernet ved hjelp av en Ficoll gradient. Celler ble dyrket i friske 24-brønners plater for ytterligere 4-5 dager. For å visualisere tumor-spesifikke CTL ble cellene farget med FITC-konjugert CD4 (L3T4) eller CD8 (53 til 6,7) og APC-konjugerte OVA Kb tetramers (Sanquin, Amsterdam, Nederland) og analysert ved flowcytometri.
Statistiske analyser
data ble analysert ved hjelp av en to-tailed Student t test eller enveis ANOVA for multiple sammenligninger med Bonferroni som post hoc test.
Resultater
Opphopning for aktiverte Antigen-Loaded Eldre dendrittiske celler i drenering lymfeknuter avhenger Svei CpG
grunning av CD8
+ CTL avhenger unike med DC for å fange ekstracellulære antigener og presentere dem på MHC klasse I. Denne prosessen, kjent som kryss presentasjon [24], kan bli sterkt forbedret ved aktivering av DC via TLR9 [25]. I denne studien undersøkte vi effekten av rute for CpG administrasjon på DC funksjon og antitumor responser etter Cryo ablasjon.
Som vist i figur 1A, peritumoral CpG injeksjoner markant økte absolutte antall DC som akkumuleres i svulsten drenerende lymfeknuter 2 dager etter injeksjon i både tumorbærende ikke-behandlede mus og mus utsatt for cryosurgery. Subkutan injeksjon av CpG ved kontra laterale side påvirker ikke antallet DC. Interessant, intravenøs CpG injeksjoner økt opphopning av CD11c
+ DC i svulsten drenerende lymfeknuter bare når den kombineres med cryo ablasjon (Fig. 1a).
(A) Absolutte tall fra CD11c
+ celler i drenering lymfeknuter 2 dager etter ablasjon. Tumor-bærende mus ble ubehandlet (NT), eller ble underkastet Cryo ablasjon (cryo). I tillegg har enkelte grupper av mus mottok CpG via de angitte ruter. Parentes angir signifikante forskjeller (p 0,05) mellom angitte grupper (n = 4-6 /gruppe, 2 lignende eksperimenter). (B) Opptak av antigen etter cryo ablasjon. OVA-Alexa488 ble injisert i B16OVA svulster (6-9 mm) Like før Cryo ablasjon å overvåke skjebnen til antigen etter in situ svulst ødeleggelse. Musene ble i tillegg behandlet med CpG via de angitte ruter. To dager etter ablasjon, ble opptaket av antigen analysert i CD11c
+ celler beriket fra bassenger av tumor drenering lymfeknuter. Tall i panelene viser prosentandelen av OVA
+ av alt CD11c
+ celler. Data fra en representant mus er vist per gruppe. (C) Kvantitativ analyse av replikater av eksperimenter som er vist i (b) (5 mus /gruppe, er representative for 2 forsøk). (D) Opptak av antigen og CpG av CD11c
+ celler overvåkes etter P.T. og i.v. CpG-Cy5 administrasjon og intra-tumor injeksjon av OVA-Alexa488. Data fra en representant mus er vist (n = 4 /gruppe). (E) Ekspresjon av CD80 på CD11c
+ antigen belastede celler. * Angir signifikant forskjellig (p 0,05) fra alle andre grupper (n = 5 /gruppe, 2 tilsvarende forsøk)
Antigen internalisering og modningen status for DC er to viktige krav for induksjon av. produktive antigen-spesifikke immunresponser. Vi har tidligere vist at kryo ablasjon kombinert med P.T. CpG administrasjon synergi opp-regulerer uttrykket av kostimulerende molekyler [26]. For å studere hvorvidt rute for CpG administrering differensielt påvirker evnen til DC for å ta opp antigen, ble OVA-Alexa-488 injisert i tumoren like før ablasjon som en surrogatmarkør for løselige antigener som blir hurtig frigjort fra tumor følgende kryokirurgi [ ,,,0],27]. Peritumoral CpG injeksjon samtidig med ablasjon synergi økt opptak av antigen ved drenering lymfeknuter DC. I motsetning til dette, både i.v. og subkutant injeksjoner mislyktes i å forbedre antigen opptak i enten tumorbærende ikke-behandlede mus eller mus som utsettes for cryosurgery (fig. 1B-C). Påføring av fluorescens-merket CpG, vi i tillegg funnet at de fleste av alle lymfeknute DC fra mus eksponert for CpG via P.T. eller intravenøst injeksjoner hadde internalisert CpG. Mengden av CpG pr DC var imidlertid mye høyere etter P.T. administrasjon (Fig. 1D) og OVA
+ DC hadde fått økte nivåer av CpG forhold til OVA
+ DC fra mus som fikk intravenøs CpG injeksjoner. Til slutt, s.c. og i.v. CpG injeksjoner bare litt økt CD80 uttrykk på antigen-lastet DC, mens P.T. CpG administrasjon betydelig forbedret nivåer av co-stimulerende markører (Fig. 1E).
Sammen utgjør disse resultatene viser at P.T. CpG injeksjoner betydelig øke antall antigen og CpG-lastet, CD80-uttrykke drenering lymfeknute DC etter Cryo ablasjon in vivo. Administrasjon av CpG via intravenøs rute resulterer i akkumulering av drenerende lymfeknute DC etter ablasjon men disse DC oppviser bare svakt forbedret nivå av internalisert antigen og CD80-ekspresjon sammenlignet med cryo ablasjon alene. Subkutane injeksjoner av CpG på kontra laterale side gjøre øke antall DC i den lokale lymfeknuter (data ikke vist), men ikke i den tumor-drenerende lymfeknute og ikke klarer å forbedre antigen opptak og CD80-ekspresjon.
Svei CpG Administration Bestemmer Grunning av CD4
+ og CD8
+ T celler
for å få ytterligere innsikt i konsekvensene av differensial DC fenotyper indusert av CpG administrasjon via forskjellige ruter in vivo splenocyttene og lymfocytter fra tumordrenerende lymfeknuter ble analysert. Vi har observert at prosentandelen av IFN-γ
+ CD4
+ og IFN-γ
+ CD8
+ T-celler etter ikke-spesifikk (fig. 2A) eller spesifikk re-stimulering (fig. 2B), ble samt cellularitet av de lymfoide organer (ikke vist) som påvirkes av CpG injeksjonsstedet. Peritumoral CpG injeksjoner økt IFN-γ
+ celler hovedsakelig i tumor-drenering lymfeknuter og også litt i milten. Etter intravenøs injeksjoner antall IFN-γ
+ celler ble hovedsakelig øket i milten. CD8
+ IFN-γ
+ T-celler ble litt forbedret i lymfeknute drenering av ablated nettstedet. Subkutane injeksjoner CpG contra lateral av tumoren ikke påvirke IFN-γ
+ T-celletall i den tumor-drenerende lymfeknute.
(A) Prosentandeler av IFN-y
+ T-celler i løpet CD4
+ eller CD8
+ populasjoner etter cryo ablasjon +/- CpG. B16-OVA tumor-bærende mus ble behandlet med cryo ablasjon kombinert med CpG administrering via de angitte ruter. Syv dager etter ablasjon, milt, tumor-drenering lymfeknuter og ikke-drenerende lymfeknuter ble isolert. Celler ble stimulert med PMA /ionomycin og farget for CD8, CD4 og IFN-γ. * Indikerer signifikante forskjeller (p 0,05) mellom indikert CpG-behandlede gruppen og den naive og Cryo gruppe. (B) IFN-γ produksjonen etter cryo ablasjon +/- CpG. Celler ble stimulert med OVA i 96 timer og IFN-γ ble målt i supernatanten ved hjelp av ELISA. De midlere nivåer av Cryo + CpG i.v. grupper i begge organer er vesentlig forskjellig fra alle andre grupper (n = 6 /gruppe, 2 forsøk).
Til slutt, telling av OVA-spesifikke CD8
+ T-celler 10 dager etter cryosurgery bekreftet den overlegne induksjon av antigen-spesifikk CTL når CpG ble administrert pt (3,1% ± 1,1 av alle CD8
+, fig. 3). I forhold til Cryo ablasjon alene (0,7% ± 0,2), hverken intravenøst eller subkutant CpG injeksjoner ga en signifikant økning i CTL (1,5% ± 0,4, 0,60 ± 0,2%). Den samme tendensen, men ikke signifikant, ble funnet for CTL spesifikk for B16 indre tumor peptid TRP-2 (ikke vist).
(A) Representative dot plots av CD8
+ OVA-Kb tetramer
+ celler av individuelle mus. Mus med B16OVA svulster (6-9 mm) ble utsatt for Cryo ablasjon alene eller mottatt ytterligere CpG injeksjoner via de angitte ruter. Ti dager etter tumor-ødeleggelse, celler fra milt og tumor drenerende lymfeknuter ble isolert og re-stimulert med IFN-y-behandlede y-bestrålte B16OVA tumorceller. Kulturer ble renset ved en Ficoll-trinn etter 3-4 dagers dyrking og på dag 8-9 celler ble analysert for tilstedeværelse av tumor-spesifikk CTL ved hjelp av APC-merket OVA-K
b tetramers. Celler ble separert på CD8
+ T-celler. Data fra en representant mus per gruppe er vist. (B) Kvantitativ analyse av kollektive data som vist i (A) (midlere nivåer av 2 separate forsøk (4-6 mus pr gruppe /eksperiment)). * Indikerer signifikante forskjeller (p 0,05). Av den angitte gruppen sammenlignet med alle andre grupper
Sammen er disse dataene dermed tyde på at den forbedrede lasting og modning av DC følgende P.T. CpG administrasjon korrelerer med den observerte økningen i lokal lymfocyttaktivering.
Peritumoral CpG Injeksjoner er overlegne i Induksjon av Long-Term Antitumor Immunity
De nevnte data viser at injeksjonsstedet av CpG i forhold til den ablateres tumorområdet er en viktig determinant i induksjon av tumor-spesifikke CTL-responser. For ytterligere å undersøke dens viktighet, ble tumorbærende mus behandlet med cryo-ablasjon og CpG ble gitt enten P.T., s.c. eller intravenøst Førti dager etter ablasjon, ble tumorfrie mus utfordret med en dødelig dose av tumorceller.
Cryosurgery kombinert med P.T. CpG administrasjoner beskyttet ~90% av alle mus, mens s.c. og i.v. CpG injeksjoner ikke klarte å forbedre responsen indusert av cryosurgery alene (fig. 4A). Selv intravenøst CpG administrering mislyktes i å øke overlevelse, og tumorvekst var betydelig langsommere enn i mus behandlet med s.c. injeksjoner eller med cryo-ablasjon alene (figur 4B.). Disse data indikerer at i.v. CpG injeksjoner kan fremkalle antitumorresponser som er i stand til å begrense tumorvekst og forlenge overlevelsen til en viss grad. Likevel, når mus fikk dødelig svulst utfordrer intravenøst CpG injeksjoner beskyttet bare 50% av musene, mens i tilfelle av P.T. CpG injeksjoner ~90% av musene overlevde. CpG forbehandling av naive mus ikke gir noen beskyttelse mot dødelige kreft utfordringer uavhengig av tilførselsvei (data ikke vist).
(A) Kaplan-Meier overlevelseskurver av naive mus kontra mus som har blitt behandlet med cryo ablasjon alene, eller i kombinasjon med samtidig CpG administrering via de angitte ruter. Etablerte B16OVA svulster på høyre femur ble behandlet med cryo ablasjon alene eller i kombinasjon med CpG administrasjoner via forskjellige ruter: P.T., i.v., eller s.c. contra lateral av svulsten. Førti dager senere, naive og tumorfrie mus (8-13 mus per gruppe) fikk en såkalt re-utfordring med tumorceller (25.000 B16OVA celler). (B) Tumor størrelse bestemmes hver 2-3 dager etter behandling. Dataene er representative for to uavhengige eksperimenter.
Vi har tidligere vist at tidspunktet for CpG administrasjon er avgjørende for effekten av P.T. CpG injeksjoner når det kombineres med ablasjon. Den reduserte effekten av intravenøs administrert CpG i dagens eksperimenter kan derfor forholde seg til forsinkelsen som CpG-ODN nå utgitt antigener ved ablasjon stedet. CpG ble derfor injisert en dag før, samtidig med, eller en dag etter ablasjon. Administrasjon av CpG en dag før ablasjon resultert i tilsvarende resultater som observert for CpG injeksjoner samtidig med ablasjon (40-45% av musene overlevde). I motsetning til dette, CpG administrering en dag etter ablasjon mislyktes i å forbedre antitumorimmunitet som induseres av cryo ablasjon alene (Fig. 5). Den reduserte effekten av intravenøs CpG administrasjoner i forhold til P.T. eksponering er således ikke grunn av tidsaspekter.
Etablerte B16OVA tumorer ble behandlet med cryo ablasjon alene eller i kombinasjon med i.v. CpG administrasjon samtidig med ablasjon, eller en dag før eller etter ablasjon. Førti dager senere, naive og behandlede tumor-frie mus (7-10 mus per gruppe) fikk en såkalt re-utfordring med tumorceller (25.000-50.000 B16OVA celler) på kontra lateral flanke og overlevelse ble overvåket. Representant for 2 forsøk er vist.
Diskusjoner
Selv om musemodeller har klart vist potente antitumor effekter av CpG, har kliniske resultater så langt vært skuffende, med siste fase 2 og 3 studier i ikke-småcellet lungekreft blir droppet på grunn av svikt i fm CpG-ODN administrasjonen å forbedre klinisk utfall [28]. I den foreliggende undersøkelse, viser vi at administreringsveien bestemmer effekten av CpG for å stimulere immunresponser etter in situ tumor ødeleggelse. Peritumoral CpG administrering øker antallet av aktiverte, modne, antigen-bærende DC i den tumor-drenerende lymfeknute og stimulerer dannelsen av tumor-spesifikke CTL som fører til vertminnerespons mot tumorantigener. Subkutane CpG injeksjoner fjernt fra svulsten ikke klarer å forbedre antitumor immunitet. Også systemisk CpG administrasjon gjennom intravenøs injeksjon bare gir begrenset beskyttelse (50%) sammenlignet med peritumoral injeksjon (90% beskyttelse).
Bruk av en ny klinisk relevant in situ tumor ødeleggelse modell, vi har tidligere rapportert at det lykkes eller mislykkes av CpG som en vaksine adjuvans avhenger av samlokalisering av antigen og CpG innen endosomal DC avdelinger og dermed på tidspunktet for CpG administrasjon. Dendrittiske celler var bare i stand til å kryss-presentere antigener og fremme CTL induksjon i forhold der antigen og CpG ble samlokalisert i DC. Faktisk, P.T. CpG administrasjon en dag før eller etter tumor ablasjon, i stedet for samtidig CpG injeksjon, allerede hatt en stor innvirkning på sin effekt [21]. Basert på disse funnene, setter vi ut for å bestemme effekten av administrasjonsveien på CpG i denne modellen systemet. Mens subkutant CpG injeksjoner fjernt fra svulsten ikke klarer å starte noen antitumor immunitet, intravenøs CpG administrasjon gitt noen overlevelsesgevinst (ikke signifikant) over cryo ablasjon alene. Disse forskjeller i effekt av CpG ikke forholde seg til forskjeller i timing, så forskjellig timing regimer for intravenøs CpG administrasjon ble ikke bedre sin effekt. Disse data viser at både tid og rute for administrering CpG bestemme effekten av CpG terapi og innebærer at tilgjengeligheten av CpG i tid og sted i (lymfoid vev) er en viktig faktor i hjelpestoff CpG.
det har tidligere blitt postulert at utfallet av CpG-ODN administrering via en spesifikk rute kan være avhengig av type av celler som er oppstått ved den ODN ved en bestemt anatomiske område [29]. De responsive celler i lymfeknutene drenering injeksjonsstedet kan aktivere en annen vei for TLR9 signale enn celler i milten. Etter avtale med denne hypotesen er de observasjoner som intra-tumor [25], P.T. [26], [30], eller intra lymfatiske [31] administrering av CpG viste den forventede Th1 fremmende effekt og var svært effektiv i forbedring av T-celle-mediert immunitet. I motsetning til dette, systemisk (i.v. eller i.p.) anvendelse av CpG resulterte i T-celle-undertrykkelse i stedet for aktivering av immunsystemet [32], [33], [34]. Lignende indikasjoner kom fra menneskelige studier hvor subkutant administrering av antigen pluss CpG induserte en systemisk Th1-lignende cytokin uttrykk i serum, mens intravenøse injeksjoner forårsaket ingen slike effekter [35].
Her viser vi at DC tatt fra svulsten drenerende lymfeknute etter intravenøs CpG eksponering har internalisert suboptimale nivåer av antigen og ikke klarer å uttrykke høye nivåer av co-stimulerende molekyler. Dette kan være på grunn av den manglende evne av innkommende DC å internalisere eller overføre antigen etter en foregående møte med CpG. Som både fastboende DC og migrere DC er nødvendig for induksjon av produktiv CTL grunning [36] Dette kan begrense induksjon av funksjonelle CTL. I tillegg ble det tidligere vist at i.v. administrasjon indusert uttrykk for indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) i DC, et enzym knyttet til immunregulering og dannelse av regulatoriske T-celler (Treg), som fører til undertrykt T-celle ekspansjon og CTL-aktivitet. Selv om vi ikke undersøke immun regulatoriske egenskaper av DC direkte, observerte vi betydelig økt antall CD4
+ foxp3
+ Treg i milten av mus behandlet i.v. med CpG (data ikke vist). Treg hemme induksjon av antitumorimmunresponser og er kjent for å bli regulert via flere mekanismer [37]. Den observerte sub-optimal modning av DC i tumoren drenerende lymfeknute kombinert med induksjon av IDO-uttrykkende DC i milten etter i.v. CpG administrasjon kan hindre optimal aktivering av immunsystemet.
Denne studien understreker at i kreft immunterapi CpG bør gis i umiddelbar nærhet av de frigitte tumorantigener. I kliniske studier CpG er vanligvis administreres uavhengig av tumor antigen meldingen [38]. Fra et klinisk synspunkt er det foretrukket å administrere CpG på et lett tilgjengelig sted og i store mengder i henhold til den begrunnelse at det vil reise til tumoren sted. Men viser vi her at verken subkutant administrasjon på et fjernt område eller intravenøst injeksjon utnytte adjuvant kapasitet på CpG. I tråd med våre data viser at samlokalisering av antigen og CpG favoriserer immunitet, ble potente immunstimulerende svarene av CpG også funnet hos mennesker når antigen (rekombinant hepatitt B overflateantigen) og CpG (CPG 7909) var co-injisert [39]
