Abstract
Innledning
Anti-EGFR målrettet terapi er av økende betydning i avansert kolorektal kreft og før
KRAS
mutasjonstesting er obligatorisk for terapi. Men hvor anledninger denne skal utføres er fortsatt under debatt. Vi forsøkte å vurdere hos pasienter med lokalavansert endetarmskreft om det er intra-prøven KRAS heterogenitet før og etter preoperativ kjemoradioterapi (CRT), og hvis det er noen endringer i
KRAS
mutasjonsstatus på grunn av denne intervensjonen.
Materialer og metoder
KRAS
mutasjon statusanalyser ble utført i 199 tumorprøver fra 47 pasienter med endetarmskreft. For å evaluere heterogenitet mellom ulike kreft områder innenfor samme svulsten før preoperative CRT, 114 biopsier fra 34 pasienter (gjennomsnittlig 3 biopsier per pasient) ble analysert (pre-terapeutisk intratumoral heterogenitet). For vurderingen av heterogenitet etter CRT rest svulstvev (85 prøver) fra 12 pasienter (gjennomsnitt 4,2 vevsprøver per pasient) ble analysert (post-terapeutisk intratumoral heterogenitet) og vurdering av heterogenitet før og etter CRT ble evaluert i tilsvarende pasientprøver (intervensjons heterogenitet). Primer utvidelse metode (Stillbilde ™) ble brukt for første
KRAS
mutasjonsstatus testing for kodon 12, 13, 61, og 146. uharmoniske resultater etter denne metoden ble revurdert ved hjelp av FDA-godkjente
KRAS
Pyro Kit 24, V1 og
RAS
Extension Pyro Kit 24, V1 Kit (TheraScreen®
KRAS
test).
Resultater
For 20 (43%) av de 47 pasientene, en
KRAS
mutasjonen ble oppdaget. Med 12 av 20, de fleste av disse mutasjonene påvirket kodon 35. Vi har ikke fått bevis for at CRT resulterer i endringer av
KRAS
mutasjon mønster. I tillegg, ingen intratumoral heterogenitet i
KRAS
mutasjonsstatus kan bli bevist. Dette gjaldt for både biopsier før CRT og reseksjon prøvene etterpå. Avviket observert i noen prøver ved bruk av snapshot ™ analysen var på grunn av utilstrekkelig følsomhet av denne teknikken på massive tumor regresjon av CRT som anvendelse av TheraScreen®
KRAS
test avslørte samstemmige resultater.
Konklusjon
Våre resultater tyder på at
KRAS
mutasjon status på primærtumor stedet for endetarmskreft er homogen. Sin vurdering for terapeutiske avgjørelser er gjennomførbart i pre-terapeutiske biopsier så vel som i post-terapeutiske resected prøver. Mengden av levedyktige tumorceller synes å være en viktig bestemmende faktor for analysesensitivitet og bør derfor tas i betraktning for valg av analysemetoden
relasjon:. Jo P, König A, M Schirmer, Kitz J, Conradi LC, Azizian A, et al. (2016) heterogenitet av
KRAS
Mutation Status i endetarms kreft. PLoS ONE 11 (4): e0153278. doi: 10,1371 /journal.pone.0153278
Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, JAPAN
mottatt: 24 august 2015; Godkjent: 25 mars 2016; Publisert: 11 april 2016
Copyright: © 2016 Jo et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data /minimal datasettet er innenfor manuskriptet
Finansiering:.. arbeidet er en del av Clinical Research Unit (KFO 179) og ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG)
Konkurrerer interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Målrettet terapi mot epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) representerer et godt akseptert og effektiv behandlingsstrategi ved metastatisk kolorektalcancer tilknyttet. med økt responsrate og forlenget pasientens overlevelse [1, 2]. I sin onkogene funksjon
EGFR
styrer viktige cellulære funksjoner som differensiering, proliferasjon og overlevelse som gjør det til et verdig mål for anti-kreft terapi [3]. Imidlertid er hemming av denne sentrale signalmolekyl i kolorektal kreft bare lovende når intracellulære effektorer nedstrøms
EGFR
endres ikke ved å aktivere mutasjoner. En av de store intracellulære effektorer sette
EGFR
signaler representerer de små GTPases
KRAS
kontrollere vitale intracellulære signalkaskader som mitogenaktivert-Protein- (kartet-) kinase signalveien. Genomisk mutasjon i
KRAS
genet locus resulterer i en kontinuerlig aktivering av MAPKinase vei uavhengig av ekstracellulære faktorer og fra
EGFR
. Ikke overraskende og på grunn av kontinuerlig stimulering av onkogene signalveier etter mutatively aktivert
KRAS
, hemming av
EGFR
hadde ingen positive eller negative effekter på pasienter med kolorektal kreft huse en
KRAS
mutasjon. Derfor pasienter med mutert
KRAS
er ekskludert fra anti-
EGFR
terapi og bestemmelse av
KRAS
mutasjonsstatus er nødvendig før tiltenkt behandling.
generelt
KRAS
mutasjonsstatus vurderes ved å analysere primær svulstvev. Men på grunn av intratumoral heterogenitet [4-6]
KRAS
mutasjon heterogenitet innenfor ulike områder av svulsten kan være en potensiell bekymring som nylig rapportert minst for utvalgte pasienter [7, 8]. Et fenomen som ikke bare er begrenset til tykktarmskreft som vist ved Queirós et al. [9]. Forskjeller i
KRAS
mutasjonsstatus mellom primærtumor og fjernmetastaser [7, 10]. samt avhengighet [11] tumorstadiet har også blitt rapportert. Det er absolutt et høyt samsvar mellom primærtumor og metastaser som nylig avslørt av en meta-analyse fra Han og kollegaer [12]. Men det bør også tas i betraktning at mutasjonen testmetoder benyttes kan være kilde av rapporterte avvik som nylig påpekt av Sherwood et al. i lungekreft [13].
I motsetning til tykktarmskreft preoperativ kjemoradioterapi (CRT) er behandling strategiske valget hos pasienter med lokalavansert endetarmskreft. Det er imidlertid ingen enighet om tidspunktet for fastsettelsen av
KRAS
mutasjonsstatus. I tillegg potensielle resultater om samstemmighet av
KRAS
mutasjonsstatus i pre- og post-terapeutiske tumorprøver (referert til som intertumoral heterogenitet) er sjeldne og motstridende natur [14-16]. Videre er det ingen resultater som demonstrerer reproduserbarheten
KRAS
testing i den primære biopsi, så vel som i den resekterte prøven i den samme tumorvevet (referert til som intratumoral heterogenitet). Vi har derfor som mål å vurdere
KRAS
status i flere pre-terapeutiske biopsier samt i resected vevsprøver. Målet var å sammenligne mutasjonsstatus før og etter kjemoradioterapi i endetarmskreft, og for å avklare om mutasjoner forskjellene i behandlingsnaive svulstene oppstår i det hele tatt.
Materialer og metoder
Pasienter og behandling
Pasienter inkludert i denne analysen ble behandlet ved Institutt for General, visceral og Pediatric Surgery og Strålebehandling og Radiation Oncology, University Medical Center Göttingen, og ble innrullert eller behandlet i henhold til prøve retningslinjer CAO /ARO /AIO-94 [ ,,,0],17] eller CAO /ARO /AIO-04 [18] (EudraCT-nummer 2006-002385-20-NCT00349076) av den tyske Endetarms Cancer Study Group. Alle pasientene ble fulgt opp i henhold til prøveprotokoller og ga skriftlig informert samtykke enten fra pasienter eller deres juridiske representanter. Denne studien dannet med de etiske prinsippene i Helsinkideklarasjonen (Seoul, 2008) og ble godkjent av Universitetet i Göttetiske komité i Göttingen, Tyskland (søknadsnummer 20/9/95, 9/8/08).
Konstatering av pre- og post-terapeutisk Tumor biopsi
Kreft biopsier ble samlet før preoperative CRT under diagnostiske prosedyrer. Bruke typiske biopsitang biopsier ga på størrelse med et knappenålshode. Etter operasjonen resttumor ble tatt fra resected prøver. På grunn av svulst regresjon hele svulsten regionen ble forankret og ble senere vurdert av patologen. Mutasjonen status ble vurdert i formalinfiksert-parafininnstøpte (FFPE) vevsprøver (4% bufret formalin) fra pre-terapeutiske tumor biopsier og post-terapeutiske resected prøver.
Tumor DNA Fremstilling og isolering
FFPE- lysbilder fra pre-terapeutiske og resected prøver ble uavhengig og blindet revurderes etter to erfarne gastrointestinal patolog (JK, PS). Tumorregresjon gradering (TRG) ble vurdert i prosent av regresjon i samsvar med Dworak Grading [19]. I uharmoniske tilfeller ble lysbilder revurdert av både patologer og en endelig beslutning ble gjort. Vi har lagt til de respektive tumor regresjon karakterer og relevante kliniske data for de pretherapeutic biopsier for alle pasientprøvene i tabell 1. mikrodisseksjon for tumorcelle berikelse å oppnå et innhold på 70-80% ble utført manuelt. Teknikken ble utført som nylig rapportert av Hunt og kolleger [20]. Kort fortalt ble FFPE- vevssnitt deparaffinized og farget med hematoksylin. Representative svulst områder ble identifisert ved hjelp av et mikroskop på en 40 gangers forstørrelse. Dissection ble utført ved hjelp av en spiss kirurgisk kniv. Svulstvev ble overført til et rør og DNA-ekstraksjon ble utført senere ved hjelp av Qiagen AllPrep DNA /RNA FFPE Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens anvisninger.
Mutation analyse
Primer Extension metode snapshot ™ analysen.
Primer utvidelse metoden ble brukt til å analysere kjent hot-spot
KRAS
mutasjoner i endetarmskreft [21] som tidligere beskrevet [22] . I korthet, ble regioner av hotspot mutasjoner i kodon 12, 13, 61 og 146 amplifisert ved multipleks PCR ved anvendelse av Qiagen Multiplex Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) med konstant 20 ng DNA-inngang. Denne totale mengden starter DNA ble beholdt også for følsomhet testing, der DNA med enkelt kjent
KRAS
mutasjoner ble fortynnet med DNA husing villtype konfigurasjon ved angitt
KRAS
loci. Derfor, for å åtte blandinger med 100, 50, 40, 30, 20, 10, 1, og 0% av mutant-inneholdende DNA for hver av de fire avlest mutasjoner ble fremstilt før underkast multipleks PCR. Etter reker alkalisk fosfatase og Escherichia coli eksonuklease I (USB, Staufen, Tyskland) behandlings spesifikke primere bindende grenser til de potensielle mutasjon nettstedene ble brukt og forlenget med fluorescens-merket dideoksynukleotid hjelp av snapshot ™ Multiplex Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Genescan ™ 120 LIZ
® Størrelse Standard ble brukt som en intern DNA dimensjonering stige for kapillær elektroforese (3100 Genetic Analyzer, Aplied Biosystems, Foster City, CA, USA). Resultatene ble analysert med Genescan ™ Analysis Versjon 3.5.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Primereksten teknikk har tidligere blitt vist å være en gyldig teknikk for å identifisere mutasjoner eller polymorfismer [23, 24].
I tilfelle av avvikende resultater for KRAS mutasjon testing ble evaluert på nytt følsomheten med TheraScreen® KRAS testing av systemet.
TheraScreen® RAS Test.
KRAS
Pyro Kit 24, V1 (Qiagen, Hilden) (dekk mutasjoner i
KRAS
kodon 12 , 13, og 61 av den menneskelige
KRAS
genet) og
RAS
Extension Pyro Kit 24, V1 (Qiagen, Hilden) (dekk mutasjoner i
KRAS
kodon 59, 61, 117 og 146 av den menneskelige
KRAS
genet) er utført for validering påvisning av mutasjoner av
KRAS
genet i genomisk DNA fra endetarmskreft prøven. Den PyroMark Q24 MDx plattform plattformen har blitt brukt til å kjøre TheraScreen® analysen med programvaren Q24, versjon 2.0.7 med følgende plugins,
KRAS
PlugIn v1.2.0 og
RAS
Extention PlugIn v .1.2.1.2.
Vi forsterket områder av interesse i den ekstraherte DNA ved hjelp av primere i
KRAS
Pyro analysen (Qiagen, Hilden, Tyskland). Vi senere immobilisert, vasket, og denaturert de amplifiserte produkter ved hjelp av vakuum arbeidsstasjon og utsatt disse produktene til pyrosekvensering ved hjelp av PyroMark Q24 Pyrosequencer (Qiagen, Hilden, Tyskland) for å oppdage og kvantifisere
KRAS
mutasjoner. Initial DNA-inngang for hver prøve var 100 ng.
Cellelinjer.
Følgende menneskelige kolorektal kreft cellelinjer husing indikert, tydelig
KRAS
mutasjon har blitt brukt i forsøkene beskrevet i dette manuskriptet: DLD1 (ATCC CCL-221) for G13D, SW1116 (ATCC CCL-233) for G12A, LS174T (ATCC CCL-188) for G12D, og SKCO1 (ATCC HTB-39) for G12V. Som en negativ kontroll ble villtype KRAS genomisk DNA oppnådd fra den humane fibroblastcellelinje BJ (ATCC: CRL-2522). Alle cellelinjer har blitt kjøpt fra ATCC (Manassas, Virginia, USA).
Resultater
Behandling av pasienter som lider av lokalavansert endetarmskreft (UICC stadium II og III) omfatter neoadjuvant kjemoradioterapi, reseksjon og adjuvant kjemoterapi. I vår studie 32 (68,1%) menn og 15 (31,9%) kvinnelige pasienter fikk neoadjuvant CRT fulgt av kirurgisk reseksjon og adjuvant kjemoterapi (fig 1). Neoadjuvant CRT inkludert bestråling av presacral plass med en samlet dose på 50,4 Gy (enkeltdose på 1,8 Gy) ledsaget av enten 5-fluorouracil (n = 24; 51,1%), eller en kombinasjon av en intravenøs infusjon av oksaliplatin og en kontinuerlig infusjon av 5-fluorouracil (n = 23; 48,9%). Innen 4 til 6 uker etter ferdigstillelse av neoadjuvant CRT primærtumor reseksjon ble gjennomført, inkludert komplett mesorectal eksisjon etterfulgt av adjuvant kjemoterapi.
KRAS
mutasjonsstatus ble bestemt PCR-basert Snapshot ™ teknikk fra biopsier innhentet av indeksen rektoskopi og fra resected prøver som vist i figur 1.
Primer Extension Metode analysen Nøyaktighet
en av de store fallgruver i PCR-basert deteksjon av genomisk mutasjon representerer sensitiviteten deteksjonsgrensen og kvaliteten av primere som brukes i forsterkningstrinn. For å vurdere vår primer system brukte vi menneskelige kolorektal kreft cellelinjer som bærer tydelige genomisk
KRAS
mutasjoner. For å vurdere påvisningsgrensen for primer-ekstensjon analysen vi simulert mulig forurensning av tumorceller med fibroblaster. Nettopp, brukte vi fire etablerte cellelinjer som modell for en av de vurderte KRAS-mutasjoner: DLD1 for G13D, SW1116 for G12A, LS174T for G12D, og SKCO1 for G12V. For villtype
KRAS
status genomisk menneske fibroblastcellelinje BJ ble ansatt. Genomisk DNA fra hver av de fire tumorcellelinjer ble seriefortynnet med den til BJ linje og utsatt for amplifikasjon ved PCR etterfulgt av øyeblikksbilde ™ assay for å. evaluere følsomheten for denne fremgangsmåte. Derfor bestemte vi den signalstyrke, dvs. området under kurven (AUC), av topper som representerer enten villtype eller mutant
KRAS
allel i preparerte serielle fortynninger av positiv og negativ kontroll og beregnet en parvis forholdet mellom tilsvarende topper (fig 2).
for alle
KRAS
mutasjon varianter, kan vi vise at den påførte snapshot ™ teknikk representerer en pålitelig test analysen. Spesifikk
KRAS
mutasjoner G13D og G12A kunne påvises med sikkerhet opp til et forurensende fortynning med 90% fibroblast DNA, som av G12D selv opp til 99% og at av G12V opptil 80% demonstrere høy følsomhet og tydelig som tyder på dette metoden er i stand til å oppdage alt regnet
KRAS
mutasjoner i microdissected biopsier og resected prøven. Videre er det i alle testprøvene på riktig måte oppnås at det er forventet
KRAS
mutasjon variant er definert av den anvendte kreftcellelinje.
I hvert tilfelle er signalintensiteten representert som AUC (areal under kurven ) av toppen påvises i elektroferogrammet for den mutante (AUCmut) i forhold til villtype (AUCwt) allel ble beregnet. Dette forhold ble hver henvist til prøven inneholdende 100% inngang DNA i kreftcellelinje med de respektive mutasjon (er satt til 1,0). En regresjon linje ble beregnet med koeffisienten (R «> 2) angitt. Hver serie ble vurdert tre ganger uavhengig av hverandre med standardavviket for hver fortynning betegnet som feilfelt.
KRAS
status mellom pre-terapeutiske biopsier
versus
tilsvarende post-terapeutisk resected prøven
KRAS
mutasjonsstatus av biopsier innhentet på indeksen rektoskopi og tilsvarende resected prøver etter kjemoradioterapi og påfølgende reseksjon ble undersøkt hos 47 pasienter (fig 1). I 20 av de 47 pasienter (42,6%) oppdaget vi en mutasjon i exon enten 2, 3 eller 4 (fig 3). De fleste av disse mutasjonene (12/20) påvirket kodon 35. Avvik av
KRAS
mutasjonsstatus i prøver tatt på indeksen rektoskopi og i prøver fra de tilsvarende pasienter etter CRT ble funnet i seks pasienter (12,8% ) ved bruk av snapshot ™ analysen. Alle av dem viste en
KRAS
mutasjon i pre-terapeutisk biopsi, men var fast bestemt på å være vill-type hvis ble utført analyse på et representativt vevsblokk av resected prøven.
de avvikende prober ble revurdert med en ekstra test systemet med TheraScreen® KRAS analysen. Ved hjelp av denne ekstra test analysen, fire av disse seks prøvene viste en konkordant KRAS mutasjon i prøver tatt på indeksen rektoskopi og i de matchet resected prøven. De resterende to sakene kunne ikke ha blitt revurdert siden ingen DNA var tilgjengelig for revurdering (tabell 2). I tillegg er TheraScreen® KRAS analysen avslørte samme KRAS mutasjon i prøver fra indeks rektoskopi og kirurgisk reseksjon som la oss foreslå disse resultatene å være pålitelig.
intratumorale heterogenitet innen biopsier fra indeksen rektoskopi og kirurgisk resected prøver
et potensielt problem i fastsettelsen av
KRAS
mutasjonsstatus ved å samle en enkelt biopsi representerer prøvetaking feil. Denne fallgruve i diagnosen er basert på antagelsen om at forskjellige kloner av tumorceller finnes i solide svulster huse potensial heterogenitet i
KRAS
mutasjoner. For å vurdere rollen til intratumoral heterogenitet mellom flere biopsier i svulsten,
KRAS
mutasjonsstatus ble vurdert i flere biopsier innhentet på indeksen rektoskopi samt i tumorvev fra kirurgisk resected prøven. For denne analysen kun saker med mer enn en vevsprøve (biopsi fra indeksen rektoskopi: range 2-5 biopsier per pasient, kirurgisk resected eksemplarer: 3-5 vevsblokker per pasient) ble inkludert (figur 4)
.
i gjennomsnitt, fikk vi tre biopsier på indeksen rektoskopi og utsatt disse prøvene for
KRAS
analyse. Bare i en enkelt pasient fant vi uharmoniske resultater for
KRAS
testing i to forskjellige biopsier fra samme svulst analysert av snapshot ™ analysen. En prøve viste en G12V mutasjon og den andre
KRAS
vill tpye status. Disse to uharmoniske DNA-prøver ble henvist til TheraScreen® KRAS testing. Dessverre analysen sviktet siden ingen toppene var synlig. For re-testing ikke tilstrekkelig DNA beløpet var tilgjengelig.
På grunn av den høye tumorregresjon indusert av preoperative CRT den intratumoral heterogenitet i kirurgisk resected prøven kunne bare bli vurdert i en undergruppe av 12 pasienter, for hvem mer enn en tumorbærende blokken var tilgjengelig (gjennomsnitt av 4,2 blokker /pasient). I seks av 12 pasienter fant vi en homogen
KRAS
status sammenligne minst to blokker ved bruk av snapshot ™ analysen. I de andre 6 pasienter oppdaget vi avvikende resultater for
KRAS
mutasjonsstatus (tabell 3). Etter revurdering med TheraScreen®
KRAS
test vi kan igjen bekrefte akkurat som
KRAS
mutasjoner, som ble konstatert i før biopsi av snapshot ™ analysen. Ved korrigering av uharmoniske data alle tumorvev viste en homogen
KRAS
status.
Diskusjoner
Som den viktigste resultatet av denne studien i endetarmskreft det synes å være noen åpenbar heterogenitet i
KRAS
mutasjonsstatus. Dette gjelder for prøver tatt fra svulster ved samme anledning og for prøver konstatert før og på CRT. Denne analysen er basert på et stort antall for- og posttherapeutic prøver og representerer derfor en sjelden datasett. Gitt en sensitiv deteksjonsmetode i forhold til mengden av levedyktige tumorceller, bestemmelsen av
KRAS
mutasjonstatus kan gjennomføres på en pålitelig måte i tumorprøver av pre-terapeutiske biopsi erholdt ved indeksen rektoskopi så vel i den resekterte eksemplarer etter neoadjuvant kjemoradioterapi. Med hensyn til pre-terapeutiske prøver naive for radio- og kjemoterapi øyeblikksbildet ™ analysen ser ut til å gi en pålitelig deteksjon verktøy, spesielt hvis flere biopsier blir analysert for å minimere risikoen for falske negative resultater. De samlede tallene for
KRAS
-mutated svulster i pre-terapeutiske biopsier av 43% (20/47) matchet ganske mye aktuell litteratur data i denne utgaven. Videre er fordelingen av de enkeltmutasjoner observerte var også mye på linje med den hittil rapportert [25, 26]. Dette gjør oss trygge på at øyeblikksbildet ™ analysen gir pålitelige resultater i pre-terapeutiske prøver, dvs. når tilstrekkelig antall levedyktige kreftceller er til stede. Angående prøver innhentet på kjemoradioterapi, antyder studien at en bestemt sensitiv metode som FDA-godkjente Pyro TheraScreen® kit bør foretrekkes.
Våre resultater støtte funn av Ondrejka et al. [14] som ikke fant noen avvik når
KRAS
status på 17 pasienter med endetarmskreft ble vurdert før og etter neoadjuvant CRT. De første resultatene av neste generasjons sekvensering og kvantitative analyser viser
KRAS
mutasjoner i de aller fleste av neoplastiske celler [27]. I en studie nylig publisert av demer et al. [15] i to av 25 pasienter en avvik
KRAS
status i prøver tatt før og etter behandling ble oppdaget. Som de to teknikkene brukt (sekvensering og snapshot ™) er mye knyttet det kan en hypotese om at følsomheten i den studien var sammenlignbare til øyeblikksbildet ™ teknikken med vår studie og kan ha unnlatt å identifisere mutasjoner i svært degradert prøver. Denne antakelsen er i tråd med Boissière-Michot et al. [16] som nylig påpekt at spesielt i endetarmskreft etter CRT falsk negativ påvisning av
KRAS
mutasjonsstatus representerer et relevant problem som kan føre til alvorlig feilbehandling. Dette refererer til tekniske problemer som andre viktig resultat av denne studien.
Mens Snapshot ™ analysen ser ut til å ha en god følsomhet til å oppdage
KRAS
mutasjoner i levedyktige vev (dvs. pre-terapeutiske biopsier ) denne teknikken ikke tilstrekkelig til å detektere mutert loci ved neoadjuvant CRT. Den mest sannsynlige forklaringen er en massiv terapi-provosert forfallet av tumorceller. Inflammatoriske og stromale reaksjoner resulterer i en betydelig økning av ikke-muterte celler i tumorområdet således «fortynning» de gjenværende maligne celler. Imidlertid er anvendelsen av en meget følsom teknikk for mutasjonsanalyse avslørte feilaktig observerte endringer. Dette er i tråd med en studie av Gonzalez de Castro D et al. å ha sammenlignet følsomheten Sanger-sekvensering, der snapshot ™ teknikken er faktisk basert, med Cobas, TheraScreen og massiv parallell pyrosekvensering [28] Ved lave fraksjoner av mutant DNA Sanger-sekvensering var mindre følsom enn de andre undersøkte metoder.
Boissière-Michot et al. [16] har foreslått at høyere følsomhet kan oppnås ved laser mikrodisseksjon og bruken av TheraScreen® analysen. I den foreliggende studien kan vi vise at manuell mikrodisseksjon ser ut til å være tilstrekkelig til å samle tilstrekkelige mengder av tumorceller for DNA-analyse. Dette kan være relevant for klinisk praksis, spesielt i mindre spesialiserte sentre hvor laser mikrodisseksjon av svulstvev er ikke ofte tilgjengelig.
Som påpekt data på
KRAS
status testing er fortsatt sjeldne å vurdere den sanne frekvensen av avvikende tilfeller. Ved å legge den her største pasient kohort og analysere
KRAS
status i ulike pre-terapeutiske biopsier fra samme svulst vi kan legge til ekstra tillit til klinisk praksis av
KRAS
testing i endetarmskreft. Videre er vi enige med Boissière-Michot et al. [16] at den type teknikk som brukes for testing bør utføres i henhold til den tilgjengelige tumorvev og økonomiske ressurser er av viktighet hvis innledende tumorvevet er av mindre kvantitet eller kvalitet. Dette er av betydning som pasienter som får anti-EGFR terapi å ha en
KRAS
mutasjon lider unødvendige bivirkninger [29].
Konklusjoner
I sammendraget, tyder våre resultater på pålitelig vurdering av
KRAS
mutasjonsstatus for terapeutiske avgjørelser i pre-terapeutiske biopsier samt i post-terapeutisk rest svulstvev. Disharmoni kan være en svært sjelden hendelse, og dette praktisk ignorable. Øyeblikksbildet ™ analysen kan brukes kostnadseffektivt for mutasjonsanalyse av tumorprøver med høy tumor celleinnhold, mens mer følsomme og dyre tester bør reserveres for mangelfulle saker og for prøver med en lav mengde av tumorceller slik som de etter CRT.
