Abstract
Styring av hormon-refraktær prostata kreft er en stor utfordring i behandlingen av denne svulsten, og identifisering av nye androgen-reseptorantagonister er nødvendig for å gjengi behandlingen mer effektiv. Vi analyserte aktiviteten til to nye androgen-reseptorantagonister (
S
) -11 og (
R
) -9, i
in vitro Hotell og
in vivo
eksperimentelle modeller av hormon-sensitive eller kastrering resistent prostatakreft (CRPC).
In vitro
eksperimenter ble utført på LNCaP, LNCaP-AR, LNCaP-Rbic og Vcap menneskelige prostata kreft celler. Cytotoksisk aktivitet ble vurdert ved SRB og BrdU opptak, AR trans av luciferase reporter analysen og PSA nivåer av Real Time RT-PCR og ELISA-analyser. Cellesyklusprogresjon messige markører ble undersøkt ved western blot.
In vivo
eksperimenter ble utført på SCID-mus xenopodet med celler med forskjellig følsomhet for hormonell behandling. I hormonfølsom LNCaP og LNCaP-AR celler, sistnevnte uttrykker høye androgen reseptor nivåer, (
R
) -9 og (
S
) -11 utstilt en høyere cytotoksisk effekt i forhold til det av referanseforbindelsen ((
R
) -bicalutamide), også i nærvær av det syntetiske androgen R1881. Videre er den cytotoksiske effekten som produseres av (
R
) -9 var høyere enn den for (
S
) -11 i de to hormon motstandsdyktig LNCaP-AR og VCap-celler. En betydelig reduksjon i PSA-nivåer ble observert etter eksponering for begge molekyler. Videre (
S
) -11 og (
R
) -9 syntese hemmet DNA ved å blokkere androgen-indusert økning i cyclin D1 protein nivåer.
In vivo
studier på den toksikologiske profilen (
R
) -9 ikke avsløre tilstedeværelsen av uønskede hendelser. Videre (
R
) -9 hemmet tumorvekst i ulike
in vivo
modeller, spesielt LNCaP-Rbic xenografter, representant for tilbakevendende sykdom. Våre
in vitro
resultatene markere antitumoraktivitet av de to nye molekyler (
R
) -9 og (
S
) -11, noe som gjør dem en potensielt attraktivt alternativ for behandling av CRPC
Citation. Tesei A, Leonetti C, Di Donato M, Gabucci E, Porru M, Varchi G, et al. (2013) Effekt av små molekyler Moduler androgen Receptor (SARMs) i menneskelig prostata kreft Models. PLoS ONE 8 (5): e62657. doi: 10,1371 /journal.pone.0062657
Redaktør: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia
mottatt: 12. desember 2012; Godkjent: 25 mars 2013; Publisert: 8. mai 2013
Copyright: © 2013 Tesei et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Gabriella Castoria og Marzia Di Donato mottatt midler fra Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC-IG11520) og Minis Italiano per la Ricerca SCIENTIFICA (PRIN 2010NFEB9L_002). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikten til å erklære for Anna Tesei , Greta Varchi og Andrea Guerrini. Drs. Anna Tesei, Greta Varchi og Andrea Guerrini er oppfinnere på patentsøknad (# WO /2010/092546) som er basert på funn som er beskrevet i denne studien. Det er for tiden ingen produkter i utvikling eller markedsført til å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Prostatakreft er den nest hyppigst diagnostisert kreft og den sjette største årsaken til kreftdød blant menn over hele verden [1]. I utviklede land, inkludert Italia, er det den vanligste kreftformen hos menn og andre bare til lungekreft i form av kreftdødelighet [2], [3]. Kirurgi, strålebehandling og /eller androgen deprivasjon er de mest effektive kliniske behandlingsformer i de tidlige stadier av sykdommen. Spesielt fører hormonbehandling til remisjon, som vanligvis varer fra 2 til 3 år. Ikke desto mindre, prostatakreft metastasizes ofte til ben og nesten alltid utvikler seg til en androgen uavhengig tilstand, med en dårlig prognose, og en median overlevelse i området fra 10 til 20 måneder [4]. Hittil har mye av forskning på prostatakreft blitt rettet mot androgener, med hovedfokus på måter å redusere sirkulerende androgener og av hemme androgen reseptor (AR) funksjonalitet.
antiandrogener, klassifisert som steroid eller ikke-steroid forbindelser , hemmer androgen aktivitet ved kompetitivt blokkerer interaksjonen mellom testosteron og /eller dihydrotestosteron (DHT) og AR. Steroid anti-androgener, blant disse cyproteronacetat er den mest representative, har nylig vært gjenstand for mye diskusjon på grunn av deres bivirkninger, i likhet med de som fremkalles ved kastrering terapi [5]. Det er også bekymring for deres tilsynelatende levertoksisitet fra langvarig bruk og tromboemboliske komplikasjoner forårsaket av deres potensial progestogenic handling [6].
steroide antiandrogener, for eksempel bikalutamid (CASODEX), flutamide (Eulexin®) og nilutamid (Nilandron®) ser ut til å være bedre tolerert enn sine steroid analoger og er for tiden den eneste tilgjengelige midler for å unngå kastrering i endokrin behandling av prostatakreft [5]. Disse forbindelser blir ofte referert til som «rene antiandrogener», fordi de bindes utelukkende til AR. Bicalutamide er best tolereres av disse stoffene, [7] – [9], men som de to andre, det fungerer som en agonist når AR mutasjoner oppstår (W741C e H874Y) og /eller i tilfeller av AR overekspresjon, som forekommer i hormon ildfast prostatakreft. Det er nå bred enighet om nøkkelrolle for AR i etiologien og progresjon av prostatakreft (PC), selv når det utvikler seg fra androgen-sensitive til kastrering-resistent sykdom (CRPC). Dette støttes av bevis for at AR ekspresjon er bevart i de fleste prostatakreft prøver, uavhengig av fasen og karakter, og av det faktum at bare en liten andel av CRCP pasienter opplever tap av AR-uttrykking, sannsynligvis gjennom AR-promoteren metylering [10]. Videre har studier på tumorprøver fra CRPC pasienter viste flere mekanismer som brukes av kreftceller til å reaktivere AR signalering,
f.eks
AR forsterkning eller mutasjon, endringer i uttrykket av enzymer involvert i steroidogenesis, og intracrine androgen produksjon [11 ] – [25]. Til tross for den kliniske fordelen av både første- og andrelinje hormon terapi, de mest brukte antiandrogens, inkludert bikalutamid, har lav AR affinitet [26]. Disse funnene har ført til jakten på nye molekyler med høyere AR-affinitet for å øke klinisk effekt.
Den nåværende preklinisk studie forsøkte å undersøke aktivitet og virkningsmekanismer av nye små organiske molekyler som er i stand til å fungere som androgen-reseptorantagonister i LNCaP-celler, som rommer en mutasjon ved kodon 877 av AR ligand-bindende domene [27], og i forskjellige cellelinjer er representative for CRPC forhold.
Materialer og metoder
legemidler og kjemikalier
Pure (
R
) -bicalutamide (den aktive enantiomeren av ikke-steroide anti-androgen, CASODEX) og forbindelser (
S
) -11 og (
R
) -9 ble oversiktlig syntetisert ved meget diastereoselektiv prosedyrer (patentsøknad nr. WO2010 /116342A2 og nr. WO2010 /092546A1 [28]), som starter fra (D) -eplesyre, (D) og -phenylglicine (D) -fenylalanin, respektivt. (
S
) -11 og (
R
) -9 ble oppløst i aceton og etanol (10 mM), respektivt, mens den syntetiske androgen methyltrienolone R1881 (Chemos-GmbH, Regenstauf, Tyskland ) ble solubilisert i DMSO (35,2 mM) og oppbevart ved -20 ° C inntil bruk. CASODEX ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Milan, Italia).
konstruerer
cDNA som koder for villtype Här var i pSG5 [29]. Den 3416 konstruksjon, som inneholder fire eksemplarer av villtype slp-HRE2 (59-TGGTCAgccAGTTCT-39), ble klonet i NheI nettstedet i pTKTATA-Luc [30].
Cellelinjer og kultur
de menneskelige prostatakreftcellelinjer utvunnet LNCaP og Vcap ble oppnådd fra American Tissue Culture Collection (Rockville, MD, USA). Den LNCaP-AR cellelinje, avledet fra LNCaP og konstruert for å stabilt uttrykke høye nivåer av AR, ble vennlig levert av Dr. Charles L. Sawyers (Howard Hughes Medical Institute Investigator ved Memorial Sloan Kettering Cancer Center i New York, U.S.A.). The (
R)
-bicalutamide motstandsdyktig subklon av LNCaP celler (LNCaP-Rbic) ble isolert i vårt laboratorium ved dyrking LNCaP foreldrenes cellelinje i 50 uker med 20 mikrometer av (
R
) – bikalutamid.
VCap-celler ble opprettholdt i DMEM-medium supplert med 10% føtalt kalveserum (Mascia Brunelli SpA, Milano, Italia). LnCap og LNCaP-AR-celler ble holdt i RPMI-medium supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS) og 1% glutamin (Mascia Brunelli S.p.A., Milano, Italia). LNCaP-Rbic-celler ble opprettholdt på samme måte supplert med (
R
) -bicalutamide. Med mindre annet er angitt, ble cellene anvendt i den eksponensielle vekstfase i alle forsøk. COS 7-celler ble dyrket i DME supplert med fenol rød, 5% føtalt kalveserum (FCS), insulin (6 ng /ml), L-glutamin (2 mM), penicillin (100 U /ml), streptomycin (100 U /ml) og hydrokortison (3,75 ng /ml). Cellene ble gjort hvilende ved hjelp av fenolrødt-fritt DMEM og dekstran trekullbehandlet kalveserum. Alle disse prosedyrene har blitt beskrevet tidligere [31] -. [33]
Transfeksjon, Nuclear Trans og trans analysen
For AR trans analyse (Fig. S5), COS-7 celler på 70 % konfluens ble transfektert med 1 ug av renset plasmid ved hjelp av Superfect reagens (Qiagen, Hilden, Tyskland). Cellene ble deretter gjort stillestående og venstre ustimulert eller stimulert med 10 nM R1881 i 60 minutter i fravær eller nærvær av studien forbindelser. For trans analysen (fig. S4), ble Cos-7-celler sådd ut ved 70% konfluens i fenolrødt-fritt DME inneholdende 5% trekull-strippet serum. Etter 48 timer ble cellene transfektert ved Superfect med 0,8 pg av 3416-pTK-TATA-Luc, alene eller sammen med 0,2 ug av pSG5-Har-uttrykkende plasmid. Etter 18 timer ble transfekterte celler stimulert med 10 nM R1881 (løst opp i 0,001% etanol, sluttkonsentrasjon) i 24 timer i fravær eller nærvær av de angitte forbindelser. Kontrollceller ble behandlet med bærer alene. Cellelysater ble fremstilt og luciferaseaktivitet ble målt ved anvendelse av et luciferase-analysesystemet (Promega). Resultatene ble korrigert ved hjelp av CH110-uttrykte-galaktosidase-aktivitet.
AR Ligand Binding Studies Fortrengnings i LNCaP-celler
LNCaP-celler ble opprettholdt som tidligere rapportert [32] og gjort stillestående ved hjelp av fenol rød-fri medium og dekstran trekull-strippet serum [32]. Celler ved 70% konfluens ble inkubert ved tilsetning av 10 nM [3H] R1881 (98 Ci /mmol; Perkin Eimer) til mediet i fravær eller nærvær av den angitte overskudd av radio inerte forbindelser. Etter en 4-timers inkubering ved 37 ° C ble cellene vasket tre ganger med iskald PBS og samlet ved forsiktig skraping i kjølerommet ved hjelp av 600 ul iskald PBS inneholdende 0,05% EDTA (vekt /volum). Antall celler i en alikvot på 100 ul ble tellet. En alikvot (200 pl) av cellesuspensjonen ble sendt inn i duplikat til utvinning av intracellulært radioaktivitet under anvendelse av 500 ul iskald etanol (100%) i 1 time [33]. Etter 24 timer ved 37 ° C, ble radioaktiviteten tellet i en væskescintillasjonsteller. Spesifikk binding av [3H] R1881 ble bestemt i separate brønner ved å legge den angitte overkant av umerket R1881 til inkubasjonsmediet.
In vitro kjemosensitivitet analysen
Sulforhodamine B (SRB) assay ble brukt i henhold til fremgangsmåten ved Skehan et al. [34]. I korthet ble cellene oppsamlet ved trypsinering, telles og sådd ut i en tetthet på 5000 celler /brønn i 96-brønners flatbunnede mikrotiterplater (100 ul cellesuspensjon /brønn). Forsøk ble kjørt i octuplicate og hvert eksperiment ble gjentatt tre ganger. Den optiske tetthet av celler ble bestemt ved en bølgelengde på 490 nm ved en kolorimetrisk plateleser. Dose-responskurver ble skapt av Excel-programvare og 50% hemmende konsentrasjon (IC
50) verdier ble bestemt grafisk fra tomter.
Kvantitativ Real-time PCR
Totalt cellulært RNA ble isolert bruker RNeasy MINIKIT (Qiagen). En mikrogram av RNA ble revers transkribert til cDNA ved hjelp iScript (BioRad, Hercules, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Real-time PCR ble utført ved hjelp av MyiQ Ensfarget Real-Time PCR Detection System (BioRad) og SYBR Grønn jeg fargestoff kjemi. Den stabilt uttrykte endogene β2-mikroglobulin genet ble forsterket som en kontroll for kvalitet og kvantitet av innspill RNA. Primere for mRNA forsterkning GAPDH, frem 5′-CGCTACTCTCTCTTTCTGGC-3 «, reverse 5′-AGACACATAGCAATTCAGAAT-3»; HPRT frem 5’AGACTTTGCTTTCCTTGGTCAGG -3 «, omvendt 5’GTCTGGCTTATATCCAACATTCG -3»; PSA frem 5’GCAGCATTGAACCAGAGGAG -3 «, omvendt 5’CCATGACGTGATACCTTGA -3») ble utformet ved hjelp av Beacon Designer programvare (versjon 7.2, BioRad). Sanntids PCR ble utført i triplikat reaksjoner ved et sluttvolum på 25 ml inneholdende 50 ng av cDNA-templat, SYBR grønn blanding, og 200 nM av forover og revers primere. Prøvene ble holdt ved 95 ° C i 10 minutter og 30 sekunder, etterfulgt av 40 amplifiseringscykluser ved 95 ° C i 15 sekunder, og deretter ved 60 ° C i 30 sekunder for GAPDH, HPRT og PSA. Produkt spesifisitet ble kontrollert ved smeltepunktet analyse. Forsterkningsvirkningsgrad, noe som aldri varieres ved 5% i de forskjellige forsøk, ble anvendt for å bestemme den relative ekspresjon av mRNA oppnådd ved anvendelse av Gene Expression makro-programvare (versjon 1.1) (BioRad). Mengden av mRNA ble normalisert til de endogene genene referanse GAPDH og HPRT, og uttrykt som n-fold nivåer i forhold til ubehandlede prøver.
real-time RT-PCR-reaksjoner ble utført i triplikat og variasjonskoeffisienten ( CV), beregnet ut fra de tre Ct verdier, var alltid 1,5%. Reproduserbarhet av den relative mRNA-ekspresjon ble beregnet ut fra resultatene fra to eksperimenter hvor prosedyren ble utført på forskjellige retrotranscription produkter som er avledet fra det samme mRNA prøve. CV var alltid. 10%
Fastsettelse av PSA nivåer
En PSA ELISA kit levert av Abnova (Taiwan Corporation, Taiwan) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. Konsentrasjonen av PSA ble målt spektrofotometrisk ved 450 nm i kulturmediet.
BrdU innlemmelse
Etter
in vivo
merking med 100 mikrometer BrdU (Sigma), hvilende celler på dekk ble fikset og permeabilized. BrdU-inkorporering ble analysert ved immunofluorescens ved hjelp av fortynnet (1:50 i PBS) muse-monoklonalt anti-BrdU-antistoff (klon BU-1, fra GE Healthcare), som tidligere rapportert [35]. Mus antistoff ble påvist ved anvendelse av fortynnet (1:200 i PBS) Texas rød-konjugert geit-anti-mus-antistoff (Jackson Laboratories).
Immunofluorescence Analysis
Cellene på objektglassene ble fiksert og permeabilisert [36 ]. Villtype Har ectopically uttrykt i Cos-7 celler ble visualisert [37] med kanin polyklonale anti-C19 antistoff (Santa Cruz). Det primære antistoff ble påvist ved anvendelse av fortynnet (1:100 i PBS) Texas rød-konjugert geit-anti-kanin-antistoff (Jackson Laboratories). Dekk ble til slutt farget med Hoechst 33258, invertert og montert i Mowiol (Calbiochem). Feltene ble analysert med en DMBL Leica (Leica Microsystems S.r.l., Milano, Italia) fluorescerende mikroskop ved hjelp av en HCXPL Apo 63 × olje mål. Bilder ble tatt med DC480 kamera (Leica) og anskaffet ved hjelp FW4000 (Leica) programvare, som beskrevet [36], [37].
lysatene og Western Blot analyse
Cellelysater (ved 2 mg /ml proteinkonsentrasjon) ble fremstilt som tidligere beskrevet [32]. Cyclin D1, p27 og CDK4 ble oppdaget ved hjelp av de aktuelle antistoffene [38]. AR ble påvist ved hjelp av kanin polyklonale anti-AR antistoffer (C-19, Santa Cruz), som rapportert [36] Immune-reaktive proteiner ble avslørt ved hjelp av ECL Detection System (fra GE Healthcare)
In vivo
Eksperimenter
Fem- seks ukers gamle mannlige SCID-CB-17 /IcrHanHsd-Prkdcscid mus ble kjøpt fra Harlan Laboratories (Correzzana, Italia). Seks til åtte uker gamle CD-1 hann nakne (nu /nu) mus ble innkjøpt fra Charles River Laboratories (Calco, Italia). Alle dyreforsøk ble utført på Animal Facility (SAFU) av Regina Elena National Cancer Institute i Roma, Italia. På den tiden der forsøkene ble utført, var det ingen aktiv Etisk Komité for forsøksdyr på Regina Elena National Cancer Institute. Men Animal Facility ved Institutt hadde fått full autorisasjon til å utføre in vivo forsøk fra det italienske helsedepartementet, som også godkjent denne studien. Alle prosedyrer som involverer dyr og deres omsorg ble gjennomført i samsvar med institusjonelle retningslinjer, som er i samsvar med nasjonal (DL No. 116, GU, Suppl 40, februar 213 18, 1992;. Circolare No. 8, GU, juli 1994) og internasjonale lover (EØF råds~~POS=TRUNC direktiv~~POS=HEADCOMP 86/609, OJ L 358. 1, 12 desember 1987, guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, United States National Research Council, 1996). Dyrene ble avlivet av etiske grunner ved halshugging når tumorer nådde et gjennomsnitt på 3,0 g i vekt eller når de ble døende i observasjonsperioden.
For (
R
) -9 toksikologiske eksperimenter , friske mus ble behandlet oralt ved gavage daglig med 10, 25, 50 og 100 mg /kg (
R
) -bicalutamide eller (
R
) -9 i 28 påfølgende dager. For antitumoraktivitetsforsøk ble mus injisert subkutant i flanken med VCap, LNCaP og LNCaP-RBic prostatakreftceller ved 10
6 celler /mus i 100 pl løsning som består av 50% Matrigel og 50% serumfritt medium. Etter ca en måned (når en tumormasse på 5-150 mg var tydelig) mus randomisert fordelt i grupper, og behandling ble startet. Mus ble behandlet oralt ved daglig inntak for.
4 sammenhengende uker med (
R
) -bicalutamide, (
R
) -9 eller CASODEX på 10 mg /kg . Forbindelser ble oppløst i 80% PEG-400 og 20% Tween-80. Kontrollmus ble behandlet med bærer for den samme behandlingsperioden. Fem mus i hver gruppe ble undersøkt. Tumorstørrelse ble målt tre ganger i uken i to dimensjoner med en skyvelære, og tumorvekten ble beregnet ved anvendelse av følgende formel: henholdsvis en x b
2/2, hvor a og b er de lange og korte diameter av tumoren,.
Antitumor tumor~~POS=HEADCOMP effekt av behandlingene ble vurdert av følgende endepunkter:% TWI, prosent svulst vekt hemming; (B) tumorvekstforsinkelse, evalueres som T-C, hvor T og C er mediantider for behandlede og kontroll tumorer, henholdsvis, for å oppnå tilsvarende størrelse (
dvs.
1000 mg.); c) stabilisering, regresjon eller fullstendig respons ble påvist ved palpability.
Etikk erklæringen
Alle prosedyrer som involverer dyr og deres omsorg ble gjennomført i samsvar med institusjonelle retningslinjer, som er i samsvar med nasjonal (DL Nei . 116, GU, Suppl 40, februar 213 18, 1992;. Circolare No. 8, GU, juli 1994) og internasjonale lover (EØF råds~~POS=TRUNC direktiv~~POS=HEADCOMP 86/609, OJ L 358. 1, 12 desember 1987; guide for Stell og bruk av forsøksdyr, United States National Research Council, 1996).
Statistical Analysis
for analyse av PSA protein assay, forskjeller mellom målte verdiene etter de ulike behandlingene ble analysert ved hjelp av den t-test for uparede observasjoner
En
P
verdi. 0,05 ble betraktet som signifikant. For analyse av kvantitative real-time PCR eksperimenter, ble enveis ANOVA med Dunnetts post test utført ved hjelp GraphPad Prism versjon 4.00 for Windows (GraphPad Software, San Diego California USA). Data fra BrdU inkorporering, ER-Luc reporter genet og kjernekraft trans analysene ble analysert av paret
t-test
. En
P
verdi 0,05 ble betraktet som signifikant. For
in vivo
eksperimenter, den t-test (uparet, tosidige) ble brukt til å sammenligne middelverdier (Programvare Primer for biostatistikk, McGraw-Hill, New York, NY, USA). Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant når
P
. 0,05
Resultater
Compound Struktur
Vårt arbeid fokusert på identifisering av potensielle blyforbindelser av en ny klasse av selektive androgen reseptor modulatorer (SARMs), syntetisert av en innovativ og svært diastereoselektiv metodikk, for ytterligere preklinisk og klinisk utvikling. De antagonistiske og agonistiske aktiviteter om 30 forskjellige steroide, syntetiske AR ligander gjennom en struktur-aktivitetsforhold studie har allerede blitt beskrevet [28]. Spesielt vurderes vi
in vitro
antitumor aktivitet av to nye bikalutamid lignende propanamid molekyler, (
S
) -11 og (
R
) -9, ( fig. 1A). Deres kjemiske strukturer forskjellig fra det av bikalutamid, i nærvær av et nitrogenatom i stedet for hydroksylgruppen i det sentrale karbonatom, og i substituenten ved chiral stereosenteret,
f.eks
. en benzylgruppe og en fenylgruppe, respektivt. Dessuten, (
S
) -11 er karakterisert ved tilstedeværelsen av et hydantoin del, noe som ytterligere påvirker dens sterisk hindring.
(A) Kjemisk struktur og molekylvekt (MW) på (
R
) -bicalutamide, (
S
) -11 og (
R
) -9. (B) AR ligandbindende forskyvning analyse i LNCaP celler. Hvile LNCaP-celler ble inkubert med 10 nM [3H] R1881 i fravær eller nærvær av den angitte overskudd (fra 0,5 uM til 4 pM) av radio inerte forbindelser. Intracellulær radioaktivitet ble analysert. Innfelt i panel B viser AR bindingssteder analysert i 10
3 celler inkubert med 10 nM [3H] R1881 (R1881 *) i fravær eller nærvær av den indikerte overskudd av umerket (
R
) -9, (
S
) -11 eller (
R
) -bicalutamide (
R
) -bic. Data fra tre forskjellige forsøk ble samlet og resterende binding ble beregnet og uttrykt som% av total AR-bindingssteder.
n
= antall forsøk. Den statistiske signifikans av resultatene ble også evaluert av paret
t
test og P-verdier 0,005 ble betraktet som signifikant. Ingen betydning ble tilskrevet forskjellen i den gjenværende binding mellom celler inkubert med 10 nM [3H] R1881 i nærvær av (
S
) -11 eller (
R
) -9 og de inkubert med 10 nM [3H] R1881 i nærvær av (
R
) -bicalutamide ((
R
) -bic). LNCaP-celler ble også inkubert med 10 nM [3H] R1881 i fravær eller nærvær av 100 gangers overskudd (1 uM) av umerket R1881 eller CASODEX. Residual binding var 13% og 14% for umerket R1881 eller CASODEX hhv.
Binding Displacement Studier
Vi har evaluert først evne (
S
) -11 og (
R
) -9 for spesifikt å forskyve den ligandbindende aktivitet av AR i hele LNCaP-celler. For dette formål, ble hvilende celler inkubert med 10 nM [3H] R1881 i fravær eller nærvær av den angitte overskudd av radio inerte forbindelser. Cellene ble gjort hvilende ved behandling av serum med dekstran-kull for å fjerne frie steroider og deretter samlet ved forsiktig skraping for å bevare bindingen av membranen AR for å vurdere den som en del av bindingsresultatene. Resultater fra ulike uavhengige eksperimenter ble analysert, avslører at både (
S
) -11 og (
R
) -9 forbindelser fortrengt den [3H] R1881 binding med ca 45% og 80% når brukt ved 0,5 uM og 1 um, henholdsvis (fig. 1B og innfelte). Nesten total [3H] R1881 forskyvning ble påvist når hver forbindelse ble brukt ved 2 uM eller 4 uM (fig. 1B og innfelte). Lignende data ble observert ved hjelp av umerket R1881 eller CASODEX (Fig. 1B legende) eller når det ble utført binding forskyvning analyse i COS-celler som uttrykker ectopically-Har (data ikke vist). Den anti-androgen (
R
) -bicalutamide vesentlig oppførte seg som (
S
) -11 og (
R
) -9, selv om det var litt mer effektive enn (
S
) -11 og (
R
) -9 i forskyve AR ligandbindende når det brukes ved lave konsentrasjoner (0,5 eller 1 mm). Fra et statistisk synspunkt (Fig. 1B legende), disse forskjellene synes ubetydelig. Samlet sett tyder disse funnene at (
S
) -11 og (
R
) -9 forbindelser bind AR.
cytotoksiske aktivitet in vitro
så vurdert på
in vitro
cytotoksisk aktivitet (
R
) -9 og (
S
) -11 i et panel av prostata kreft cellelinjer på ulike stadier av hormonet respons og representant for forskjellige patologiske trekk ved menneskelig prostatakreft (fig. 2).
Cytotoksisk aktivitet (
R
) -bicalutamide, (
S
) -11and (
R
) -9 i menneskelige prostata kreft cellelinjer LNCaP, LNCaP-Rbic, LNCaP-AR og Vcap etter en 144-timers eksponering, målt ved SRB analyse (gjennomsnitt av tre uavhengige forsøk). Konsentrasjonene (mm) av (
R
) -bicalutamide, (
S
) -11 og (
R
) -9 forårsaker 50% reduksjon i celleoverlevelse (IC
50) er vist til høyre for kurvene.
Celler ble utsatt for skalare medikamentkonsentrasjoner som varierer fra 0.02 uM til 20 uM i 144 timer. (
R
) -bicalutamide viste ingen dose-effekt-kurver i motstandsdyktig LNCaP-Rbic cellelinje eller i Vcap celler husing høye nivåer av vill type AR. Selv om en svak dose-effekt trenden ble observert i de cellelinjer som naturlig uttrykker AR (LNCaP) eller celler konstruert for å overuttrykker reseptoren (LNCaP-AR), IC
50 (2 uM) ble bare observert i LNCaP-cellelinje (Fig . 2).
(
S
) -11 viste en beskjeden aktivitet i det hele tatt, men den høyeste konsentrasjonen (20 mm) der vi observert en beskjeden cytotoksisk effekt i Vcap celler (fig. 2 ). I de andre cellelinjene en sterk cytocidale effekt ble påvist med IC
50 verdier i området fra 11,2 pM til 13 pM. (
R
) -9 produsert en effekt lik som (
S
) -11 i bare LNCaP-Rbic men induserte en doserelatert og sterk cytotoksiske effekt i de andre cellelinjer, naturlig eller kunstig uttrykke AR, alltid nådde IC
50 verdier, selv i Vcap celler (6 mm).
innflytelse på Hormonell Stimulus
Vi har også undersøkt innblanding av antiandrogener på effekten av R1881 i naive LNCaP og avledede LNCaP-AR linjer, sistnevnte konstruert for å uttrykke høyere nivåer av vill-type AR ((fig. 3A). Langvarig eksponering for R1881 10 nM økt celledeling av prostatakreft linjer med ca 1,5- 2,5 ganger. samtidig eksponering av celler til R1881 og (
R
) -bicalutamide, (
S
) -11 eller (
R
) -9 i 72 timer trykt veksten stimulus gitt av syntetiske androgen. spesielt (
R
) -9 viste seg å være den mest effektive for å hemme hormon proliferative stimulering, med utgangspunkt i en 5-uM konsentrasjon. Videre, som forventet, en signifikant økning (
P
0,01) i PSA-nivåene ble observert i kulturmediet av LNCaP (43%) og LNCaP-AR (62%) celler etter en 48-timers eksponering for 10 nM av syntetisk androgen R1881 (fig. S1). I motsetning til dette, alle antiandrogen forbindelsene benyttet i konsentrasjoner på 20 uM inhiberte PSA sekresjon i kulturmediet fra begge cellelinjer. Spesielt begge (
R
) -9 og (
S
) -11 forårsaket en reduksjon i PSA nivåer betydelig høyere (
P
0,01) enn det som produseres med (
R
) -bicalutamide (
P
0,01).
(A) Evaluering av SRB analyse av antitumoraktivitet av skalar konsentrasjoner av (
R
) -bicalutamide, (
S
) -11 eller (
R
) -9 i hormon-responsive LNCaP og AR-overekspresjon LNCaP-AR celler i nærvær eller ikke av det syntetiske androgen, R1881 (10 nM). Stolper representerer gjennomsnittet av to uavhengige eksperimenter. (B), (C) Evaluering av mRNA nivåer av PSA-genet etter en 24-timers eksponering for ulike konsentrasjon (
S
) -11 (C) eller (
R
) –
ni product: (D) i nærvær eller fravær av R1881 (punktene er gjennomsnittet av to uavhengige eksperimenter, *
P
0,05).
Vi har også undersøkt tidlig modulering av AR transkripsjonen aktivitet som utøves av de to nye molekyler ved eksponeringstider og konsentrasjoner ikke i stand til å indusere massiv celledreping.
En betydelig økning i PSA mRNA nivåer ble observert (
P
0,005). De oppnådde data synes å indikere at (
R
) -9 ved lave konsentrasjoner er mer effektiv enn (
S
) -11 ved inhibering av transkripsjonen aktivitet av AR.
virkning på BrdU-inkorporering
Vi evaluerte effekten av begge forbindelser på androgen-indusert DNA-syntese av LNCaP-celler i tre forskjellige forsøk. (
R
) -9 (fig. 4A) og (
S
) -11 (Fig. 4B) betydelig hemmet BrdU inkorporering stimulert med 10 nM R1881 behandling av LNCaP celler laget hvile bruker fenol rød-fritt medium og dekstran trekullbehandlet serum. Den inhibitoriske effekt var lik eller sterkere enn det som oppnås ved bruk av det samme konsentrasjonsområde (10-20 pM) av Casodex (Fig. 4 A og B) eller (
R
) -bicalutamide (tabell 1). (
R
) -9 og (
S
) -11 igjen hemmet signifikant BrdU-inkorporering stimulert med 10 nM R1881 behandling av LNCaP-AR celler laget hvilende som beskrevet ovenfor for LNCaP (fig. S2).
i A og B, hvilende LNCaP-celler på objektglassene ble ubehandlet (kontroll) eller behandlet i 18 timer med det syntetiske androgen R1881 (10 nM) i fravær eller nærvær av de angitte antagonister (brukt ved 10 eller 20 uM). Etter
in vivo
pulserende med 100 mikrometer BrdU ble BrdU inkorporering analysert ved immunfluorescens og uttrykt som% av totalt antall kjerner. I A og B, tallene på toppen av hver søyle representerer gjennomsnittet av tre uavhengige forsøk (
n = 3
), med standardavvik (SD) 1. Den statistiske signifikans av resultatene i A og B ble vurdert med sammenkoblede
t
test.
P
verdier var 0,005 for celler stimulert med 10 nM R1881. Fig.
