Abstract
Utvidelse av myeloid-avstamning leukocytter i tumorbærende mus har blitt foreslått som en årsak til systemisk immunsuppresjon. Vi viser at strålebehandling av svulster fører til en nedgang i myeloid celletall i blodet og en reduksjon i miltstørrelse. Hyppigheten av myeloide celler ikke avtar til nivået sett i tumorfrie mus: viser vi at metastatisk sykdom kan hindre myeloide celletall fra å vende tilbake til baseline, og at tumorresidiv fra restsykdom korrelerer med re-utvidelse av myeloide avstamning celler. Strålebehandling resulterer i økt proliferasjon av T-celler i milten og mens T-celle respons på fremmede antigener ikke blir endret av tumorbelastning eller myeloid celle utvidelse, blir svarene på tumorassosierte antigener øket etter strålebehandling. Disse dataene viser at myeloide celletallene er direkte knyttet til primærtumor byrde, at denne befolknings kontrakter etter strålebehandling, og at strålebehandling kan åpne et terapeutisk vindu for immunterapi av restsykdom
Citation. Crittenden MR, Savage T, Cottam B, Bahjat KS, Redmond WL, Bambina S, et al. (2013) The Peripheral myelogen Expansion Drevet av Murine Cancer Progresjon reverseres ved strålebehandling av svulsten. PLoS ONE 8 (7): e69527. doi: 10,1371 /journal.pone.0069527
Redaktør: Maria G. Castro, University of Michigan School of Medicine, USA
mottatt: 5 april 2013; Godkjent: 11 juni 2013; Publisert: 25.07.2013
Copyright: © 2013 Crittenden et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av forskningsmidler fra et Susan G Komen for Cure Career Catalyst Award (KG110131) og en American Cancer Society stipendiat Grant (RSG-12-168-01-LIB) til MJG, og en Wayne D. Kuni og Joan E . Kuni Foundation Kuni Scholar Award til MRC. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
myeloide celler har en viktig rolle i utvikling og progresjon av kreft. Tumorassosierte makrofager er kritiske for angiogenese, invasjon, metastase, immunsuppresjon og effekten av behandlingen [1], [2], [3]. Nylig studier har fokusert på populasjonen av myeloide celler som ofte utvides i perifert blod hos kreftpasienter [4], [5]. Visse musemodeller er forbundet med ekstreme myeloid utvidelser detekterbare i svulsten, milt og perifert blod, og disse myeloide celler er i stand til å undertrykke T-celleaktivering
in vitro product: [6], [7], [8].
transplanttumormodeller med sine clonally identiske kreftceller gir en nyttig modell for å studere de viktigste funksjonene i myeloid ekspansjon. Dersom myeloid utvidelse er knyttet til antall kreftceller, og deretter behandling av den primære tumor skal forhindre myeloid ekspansjon. Gemcitabin og 5-FU kjemoterapi er blitt vist å kontrollere myeloid ekspansjonen i milten av tumor-bærende mus [9], [10], [11]. Men hver av disse midler er blitt beskrevet å ha en direkte inhibitorisk effekt på myeloide populasjoner
in vitro product: [10], [11]. Selv om disse er ikke spesielt myelotoksiske chemotherapies, kan de potensielle systemiske effekter av kjemoterapi på aktivt prolifererende myeloide forløpere forvirre bidraget fra redusert tumorbyrde. Kirurgisk fjerning av den primære tumoren fører også til en reduksjon i myeloide celler [9], [12]. Det er interessant at denne effekten er ufullstendig, som cellene ikke tilbake til naive nivåer. Disse dataene tyder på at svulster har en effekt på myeloide celler som vedvarer utover eksisjon. Men i denne modellen effekten av tumor excision er forbigående, som myeloid utvidelse returnerer med gjentakelse av den primære tumor og metastaser [12]. Derfor kan disse dataene bli tolket som tyder på at gjenværende kreftceller kan hindre en full normalisering av myeloide tall. Ved den kirurgiske modell kan trauma også fungere som en problemfaktor. Trauma har vist seg å føre til en mobilisering av myeloide celler med lignende fenotypiske, morfologiske og funksjonsegenskaper til tumor-indusert myeloide celler [13]. Dette trauma-indusert myeloid utvidelse kan skjule omfanget av reduksjonen i myeloide celler forårsaket av kirurgisk fjerning av primærtumor, og legge til noen myeloid utvidelse opprettholdes av restsykdom.
Konsekvensen av tumor strålebehandling til systemisk myeloide populasjoner er ikke blitt beskrevet. Strålebehandling kan leveres i et høyt sete-spesifikk måte, noe som resulterer i kontroll av målrettede tumorer og under normale omstendigheter er det ingen effekt på tumorer utenfor mål-feltet. Således tilveiebringer strålebehandling en teknikk for å påvirke av primærtumor på perifere myeloide celler uten kompliserende effektene av kjemoterapi og kirurgi. Vi viser at strålebehandling av 4T1 tumorer fører til en nedgang i myeloid celletall i blodet og en reduksjon i miltstørrelse. Systemisk sykdom, målt ved lungemetastaser, er ikke påvirket av strålebehandling av den primære tumor. Vi viser at myeloid utvidelse følger tett primærtumorvekst, men etter behandling, trenger myeloide tallene ikke avta til nivået sett i tumorfrie mus, noe som tyder på at etter lokal behandling, rest lokale og metastatisk sykdom kombineres for å opprettholde myeloide tall. Når primærsvulster dukket opp som et resultat av gjenværende lokal sykdom, myeloid returneres ekspansjon. Vi viser at mens myeloide tall er regulert av tumorvekst og påvirket av strålingsterapi, har T-celle-tallene ikke endres. Imidlertid strålebehandling av primærtumor forbedret myeloid: CD8-forhold og resulterer i økt proliferasjon av endogene T-celler i milten. For å teste om myeloid ekspansjon og sammentrekning påvirket in vivo T-celle responser, vi målte antigen spesifikke svar på vaksineassosiert og tumorassosierte antigener. Vi viste at det var ingen endring i
in vivo
respons til
Listeria monocytogenes
vaksinasjon i tumorbærende og behandlede mus, men at kombinasjonen av strålebehandling med vaksinasjons resulterer i økt respons på vaksine antigen deles med tumoren. Disse dataene støtter hypotesen om at myelogen utvidelsen er direkte knyttet til tumorbyrde, at disse cellene kontrakten etter strålebehandling, og at strålebehandling kan åpne et terapeutisk vindu for immunterapi av restsykdom.
Materialer og metoder
Etikk
Alle dyr protokoller ble godkjent av Earle A. Chiles Research Institute IACUC (Animal Welfare Assurance No. A3913-01).
Dyr og cellelinjer
den 4T1 mammary carcinoma-cellelinjen [14] (BALB /c) ble oppnådd fra ATCC (Manassas, VA). Den Panc02 murine bukspyttkjertelen adenokarsinom cellelinje [15] (C57BL /6) ble vennlig levert av Dr Woo (Mount Sinai School of Medicine, New York). 6-8 uker gamle C57BL /6 mus og BALB /c ble oppnådd fra Charles River Laboratories (Wilmington, MA) for bruk i disse forsøkene.
Antistoffer og reagenser
fluorescently-konjugerte antistoffer CD11b -AF700, GR1-PE-Cy7, IA (MHC klasse II) -e780, Ly6C-PerCP-Cy5.5, CD4-E450, foxp3-E450, CD25-APC, CD4-PerCP Cy5.5, CD8-FITC, IFNy -APC, og CD40L-PE ble kjøpt fra eBioscience (San Diego, California). Ki67-FITC, CD4-V500, TNFa-PE-Cy7 og Ly6G-FITC ble kjøpt fra BD Biosciences (San Jose, California). CD8-PE-TxRD ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, California).
Stråleterapi av svulster
Svulster ble inokulert s.c. i høyre ben under kneet ved en dose på 5 x 10
4 4T1 celler eller 2 x 10
5 Panc02 og tillates å etablere i 14 dager før behandlingsstart. Dosering var basert på nyere kliniske studier [16], med tre daglige 20 Gy behandlings fraksjoner gitt ved hjelp av en Elekta Synergy lineær akselerator (Atlanta, Georgia) med 6 MV fotoner som omfatter en halv bjelke blokk for å redusere dosen til overkroppen og en cm bolus.
klonogene analyse av metastatisk kreft celler
for klonogene analyser av metastatiske kreftceller, ble lungene dissekert i tilnærmet 2 mm fragmenter, etterfulgt av omrøring i 1 mg /ml kollagenase (Invitrogen), 100 ug /ml hyaluronidase (Sigma, St. Louis, MO), og 20 mg /ml DNase (Sigma) i PBS i 1 time ved romtemperatur. Digestionen ble filtrert gjennom 100 um nylonnett for å fjerne rusk makroskopisk. Serielle fortynninger av tumorceller ble utsådd i 6-brønners vevskulturplater i media inneholdende 60 pM 6-tioguanin for å selektere for kreftceller i løpet av stromale celler og kolonier ble talt etter 7 dager. Serie fortynning og kimtall ble brukt til å beregne antall klonogene kreftceller i den opprinnelige orgelet.
flowcytometrisystemer av myeloide celler i blodet og Spleen
Utvidelsen av myeloide celler i perifert blod ble målt ved anvendelse av en fullblod vulst assay. Fullblod ble høstet inn EDTA-rør fra live-mus via saphenavene og 25 ul av friskt blod var farget direkte med fluorescerende antistoff cocktails. En kjent antall accucheck fluorescerende kuler (Invitrogen) ble tilsatt til hver prøve, og røde blodceller ble lysert med Cal-Lyse helblod lyserende oppløsning (Invitrogen), og prøvene analysert på en BD LSRII strømningscytometer. Vi har bestemt det absolutte antall celler i prøven basert på en sammenligning cellulære hendelser til å perle hendelser (celler /ul). For flowcytometri analyse av splenocytter ble homogenis milten vasket og farget med antistoffer spesifikke for overflateantigener, deretter ble cellene vasket og fikset ved hjelp av en T regulatorisk cellefarging kit (EBiosciences) og intracellulært farget for foxp3 og Ki67. Andelen av hver infiltrerende celletype ble analysert på en BD LSRII. Flow sortering av blodceller ble utført ved hjelp av en BD FACSAria Cell Sortering til mer enn 98% renhet. Morfologien av de sorterte cellepopulasjoner ble bestemt ved Cytospin etterfulgt av DiffQuick farging. Blodflekker ble farget med Wright’s-Giemsa beis (Ricca Chemical Company, Arlington, Texas). Bilder ble ervervet ved hjelp av en Nikon Eclipse TE2000-S fluorescens mikroskop med NIS-Elements innsamling og analyse programvare, eller på en Leica SCN400 lysbilde skanner.
cytokin Perlene analysen
Svulster ble høstet på is og homogenisert i 4,5 mL PBS som inneholder HALT proteasehemmer per mg vev. Celleavfallet ble fjernet ved sentrifugering ved 14 000 g i 15 minutter ved 4 ° C, og supernatantene ble lagret i alikvoter ved -80 ° C inntil anvendelse. Cytokin-nivåer i supernatantene ble påvist ved anvendelse av et murint multipleks vulst assay (Life Technologies, Grand Island, NY) og avlest på en Luminex 100 matrise-leser. Cytokinkonsentrasjoner for gjentak av hver tumorprøve ble beregnet i henhold til en standardkurve.
bakteriestamme og vaksinasjons
ACTA-slettet (Δ
ACTA
)
L. monocytogenes
uttrykker AH1-A5 peptid Lm-AH1-A5) er tidligere blitt beskrevet [17]. Bakterier ble dyrket til Midlog i hjerne-hjerte-infusjonsekstrakt, vasket og resuspendert i dPBS for injeksjon. En dose på 5 x 10
6 CFU ble levert intravenøst og bekreftet ved plettering av gjenværende inokulum. Kontroll mus eller mus med 4T1 svulster venstre ubehandlet eller behandlet som ovenfor med tre daglige 20 Gy behandlings fraksjonene ble vaksinert en dag etter den siste stråledose med 5 × 10
6 CFU Lm-ZH1-A5. Miltene ble høstet 7 dager etter vaksinasjon, og cellesuspensjoner ble stimulert med 2 uM av LLO
91-99 (GYKDGNEYI), AH1 (SPSYVYHQF), eller DMSO kjøretøy i nærvær av Brefeldin A i 5 timer ved 37 ° C. Stimulerte celler ble vasket og farget med CD4-PerCP Cy5.5 og CD8-FITC, deretter fiksert og permeabilisert ved hjelp av et BD Cytofix /Cytoperm pluss kit (BD Biosciences) og frosset ved -80 ° C. For analyse celler ble tint og intracellulært farget med IFNy-APC, TNFa-PE-Cy7 og CD40L-PE. Cellene ble vasket og analysert på en BD LSRII Flowcytometer og dataene ble avhørt ved hjelp av BD FACSDiva (BD Biosciences) og flojo (Tre Star, Ashland, Oregon).
statistikker
Data ble analysert og tegnes ved hjelp Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA). Blood myeloide tallene over tid ble montert på andre ordens polynom kurver ved hjelp av Prism. Individuelle datasettene ble sammenliknet med t-test og analyse på tvers av flere grupper ble utført ved hjelp av ANOVA med enkelte grupper vurdert ved hjelp av Tukey sin sammenligning.
Resultater
Utvidelsen av myeloide populasjoner er assosiert med kreft progresjon i dyremodeller og hos kreftpasienter. Hos mus varierer myeloid utvidelse mellom tumormodeller, for eksempel med spesielt uttalt myeloid ekspansjoner som er beskrevet i 4T1 mammary carcinoma modell [18]. I disse modellene mus med tumorer avanserte utviser ekstremt store milter, inneholdende et spesielt merkbar ekspansjon i CD11b
+ GR1
+ -populasjonen. For å spore myeloid ekspansjon i mus gjennom tumorvekst uten behov for å avlive dyret vi overvåket myeloid populasjoner i perifert blod. Standard blanding av perifere mononukleære blodceller (PBMC) ved tetthetsgradient sentrifugering kan føre til tap av granulocytt populasjoner, som utgjør størstedelen av myeloide celler i perifert blod. Derfor har vi utviklet en fullblods flowcytometri analyse innlemme count-perler for å måle absolutte antall sirkulerende myeloide celler. Gjentatte målinger av flere mus viste at denne myeloid befolkningen utvides med 2-3 logger gjennom tumorvekst, dramatisk øker den totale cellularitet av perifert blod. I naive mus CD11b
+ myeloide celler bredt besto av GR1
+ og GR1
– celler (Figur 1a), hvor CD11b
+ GR1
+ celler var jevnt MHC klasse II ( IA) negative og CD11b
+ GR1
– celler innlemmet både MHC klasse II negative og positive celler (figur 1aii). I 4T1 tumor-bærende mus som vi observerte lignende fenotyper, men en stor økning i antall av disse celler, særlig en utvidelse i CD11b
+ GR1
+ -celler, i samsvar med observasjoner av andre forskere ble observert [4] , [19]. Strålebehandling av mus med etablerte 4T1 svulster styrer tumorvekst; Men til tross for høye stråledoser, svulstene oppstår på nytt lokalt (Figur 1b). Strålebehandling av primærtumor resulterte i en signifikant forskjell i perifere myeloide celler, sammenlignet med ubehandlede mus, innen en uke etter strålebehandling (p 0,01 dag 21 etter tumor utfordring) (Figur 1b). På dette punktet, antallet sirkulerende myeloide celler i behandlede mus var betydelig lavere enn før behandling for litt over en uke før ekspansjon returnert (RT d14 vs RT D21 (p 0,05), RT d14 vs RT D23 ( p 0,05), RT d14 vs RT D27 (p = 0,26)). Antallet av sirkulerende myeloide celler i behandlede mus forble signifikant lavere enn i ubehandlede mus inntil omtrent to uker etter behandling (p 0,05 dag 27 etter tumor-utfordring). På dette punktet, gjentakelse av den primære svulsten var tydelig (figur 1bi) som tyder på en mulig kobling mellom primær tumorbelastning og myeloide tall. Disse data viser at strålebehandling av primærtumor transient reverserer tumorassosiert myeloid utvidelse.
a) i) Strømningscytometri av ferskt full perifert blod fra naive og 4T1 tumorbærende BALB /c-mus, som viser CD11b
+ SSC
hi myeloide populasjoner. ii) GR1 og IA (MHC klasse II) flekker på gated CD11b
+ SSC
hi myeloide populasjoner fra naive og 4T1 tumorbærende mus. b) i) Midlere og standard feil av benet diameteren av BALB /c mus med tumorer 4T1 forblir ubehandlet (NT) eller behandlet som begynner på dag 14 med 3 daglige doser på 20 Gy fokal stråling (RT). Myeloide celler /mikroliter perifert blod ii) mus venstre ubehandlet og iii) mus behandlet som begynner på dag 14 med 3 daglige doser på 20 Gy samlings stråling. iv) montert kurver fra grafer ii) og iii) er plottet uten målinger. c) i) klonogene analyser av lungemetastaser til stede ved aktiv dødshjelp i BALB /c mus med 4T1 svulster venstre ubehandlet (tomme sirkler – NT) eller behandlet som begynner på dag 14 med 3 daglige doser på 20 Gy samlings stråling (fylte sirkler – RT). ii) myeloide celler /mL perifert blod fra naive mus (naive) og mus dag 17 etter injeksjon av 4T1 intravenøs (I.v.) eller s.c. (Subkutant) iii) Total milt cellularity i naive mus (NT) og mus dag 24 etter injeksjon av 4T1 intravenøs (I.v.) eller s.c. (S.c.) d) i) myeloide celler /mL perifert blod fra C57BL /6 mus med tumor Panc02 høstet ved forskjellige tidspunkter. ii) dag 24 leg diameter og iii) myeloide celler /mikroliter perifert blod C57BL /6 mus med Panc02 svulst ubehandlet (NT) eller behandlet som begynner på dag 14 med 3 daglige doser på 20 Gy fokus stråling (RT). I hver graf, representerer hvert symbol en mus. NS = ikke signifikant; * = P 0,05; ** = P 0,01; *** = P 0,005; **** = P 0,001. Dataene representerer flere replikere eksperimenter.
4T1 modellen er spontant metastatisk, hovedsakelig til lungene. Metastaser blir sådd i løpet av 10 dager etter primærtumor implantasjon – etter denne tiden kirurgisk fjerning av den primære tumoren ikke kurerer mus, men i stedet til slutt resulterer i dødelighet på grunn av progressiv vekst av metastatisk sykdom [20]. For å overvåke metastatisk progresjon i vårt strålebehandling modell, høstet vi lunger fra mus som kreves for eutanasi på grunn av deres primære tumor overstiger 12 mm, eller på grunn av dårlig forfatning. I mus behandlet med strålebehandling 14 dager etter tumor-utfordring, kontroll av primærtumor gitt forsinket lunge avling sammenlignet med ubehandlede mus. Men på lunge høst, klonogene analyse viste at metastaser fortsatte å utvikle seg (figur 1ci). Selv i mus hvor stråling-behandlede tumor var stabil, eller som utvikler seg langsomt, innen 35-50 dager utfordring alle musene ble tilstrekkelig uvel å kreve aktiv dødshjelp, og dette sykelighet ble universelt assosiert med en omfattende byrden av lungesykdom. Disse data bekrefter omfattende historiske data som fokal strålebehandling av den primære tumor er en meget lokal behandling som resulterer i kontroll av kreft utelukkende i strålefeltet: i hundretusener av pasienter behandlet per år med strålebehandling, abscopal virkninger – behandling induserte kontroll av svulster utenfor strålefeltet – er ekstremt sjeldne der strålingen er den eneste behandlingsform [21]. Siden myeloid utvidelse hos pasienter som har vært forbundet med invasive og metastatisk sykdom [5], er det mulig at de resterende metastatisk sykdom forhindrer fullstendig normalisering av myeloide nummer følgende lokal terapi. For å undersøke bidraget av metastatisk sykdom som myeloid utvidelse, ble mus injisert med 4T1 tumorer intravenøst til direkte å danne metastaser i fravær av en primær tumor. Mus som bærer bare metastatisk sykdom oppviste perifere myeloid utvidelse (fig 1cii), men det var hovedsakelig færre myeloide celler tilstede enn i mus med synkrone sub-kutan primære svulster. Dette forholdet ble oppholdt i milten, der mus med bare metastaser viste signifikant flere celler enn ikke-tumorbærende mus, men dette var betydelig færre enn mus med sub-kutane primære tumorer (figur 1ciii). Siden vi vet at focal strålebehandling styrer den primære svulsten lokalt, men hverken metastaser, mus som får strålebehandling beholde både sin gjenværende lokale sykdom
og Selge deres lungetumorbyrde. Derfor er disse data er i overensstemmelse med kombinasjonen av rest lokal og metastatisk sykdom hindre myeloide tall tilbake til grunnlinjen etter strålebehandling, og er i overensstemmelse med observasjonene etter kjemoterapi, [9] og kirurgisk fjerning [9], [12].
Denne effekten av stråleterapi ble ikke begrenset til 4T1-modellen. Den Panc02 bukspyttkjertelen adenokarsinom tumormodell driver myeloid utvidelse med tumorprogresjon, men i mindre grad enn 4T1 (figur 1di). Strålebehandling av Panc02 tumorer forårsaket en forbigående kontroll av tumorvekst (figur 1dii), etterfulgt av en aggressiv utvekst [22]. Som behandling av 4T1, strålebehandling til Panc02 tumorer resulterte i en signifikant reduksjon i perifere myeloide celler (Fig. 1diii). Sammen utgjør disse data viser at cytotoksisk terapi rettet mot den primære svulsten forårsaker en systemisk, selv om forbigående reversering av myeloid ekspansjons drevet av tumorvekst.
I nadir av blod myeloide celler etter strålebehandling, miltene var synlig mindre (figur 2a). Vi telles celler i milten som et mål på myeloid sammentrekning etter strålebehandling, og mens total milt cellularitet falt syv dager etter strålebehandling, det holdt seg på et mellomliggende størrelse – signifikant færre celler enn mus med ingen behandling (p 0,01) og betydelig flere celler enn musene uten tumorer (p 0,01) (figur 2BI). For å avgjøre om reduksjon av systemiske myeloide tall ble forårsaket av strålebehandling uavhengig av effekter på svulsten, ble mus med 4T1 svulster behandlet med stråling til kontralaterale ikke tumorbærende ben. Mus som får strålebehandling mot tumor viste signifikant færre totale celler i milten enn ubehandlede mus eller de som ble behandlet på den kontralaterale lem (figur 2BI). CD11b
+ celler var den desidert største befolkningen i den utvidede milten av tumorbærende mus, og CD11b
+ befolkningen i milten viste en tilsvarende mellomresultat etter strålebehandling av primærtumor, med mus behandlet med svulst strålebehandling som oppviser betydelig færre CD11b
+ celler enn ubehandlede mus eller mus bestrålt med den ikke-tumorbærende ben (figur 2bii). Igjen, til tross for reduksjonen forårsaket av tumor stråling, behandlede mus beholdt en vesentlig høyde i myeloide celler i løpet av ikke-tumorbærende mus, og det var ingen signifikant forskjell mellom ubehandlede mus og mus bestrålt med den ikke-behandling ben (fig 2bii). Tilsvar myeloid reaksjon på bestråling av tumoren sett i perifert blod og i milt resulterer i en nær sammenheng mellom disse tiltakene uavhengig av tumor eller behandlingsstatus (figur 2c). Siden strålebehandling til svulsten og til den motsatte lem vil bestråle blod bassenget gjennom behandling, er ikke redusere myeloid tall i milten som strålebehandling leveres til den motstående lem indikerer at effekten på myeloide populasjoner er ikke på grunn av direkte effekter av stråling på myeloide celler eller eventuelle spredningsdoser.
a) friskt uttatt milter fra D24 4T1 tumorbærende BALB /c-mus forblir ubehandlet (NT) eller behandlet begynner på dag 14 med 3 daglige doser på 20 Gy fokus stråling (RT). Bokser som vises er 3 cm bred. b) i) Total milt cellularity i naive mus (Ingen tumor) og mus dag 24 etter injeksjon av 4T1 ubehandlet (Tumor NT) eller behandlet som begynner på dag 14 med 3 daglige doser på 20 Gy samlings stråling til svulsten (Tumor RT) eller til uninvolved motsatt lem (Tumor Leg RT). ii) Antallet CD11b
+ celler per milt i mus fra forsøket er vist i i). c) Antallet CD11b
+ celler i milten plottet mot antall CD11b
+ celler /mikroliter perifert blod ved innhøsting for hver svulst og behandlingsgruppe.
For å avgjøre om noen spesifikk myeloid befolkningen ble spesielt påvirket av strålebehandling, utførte vi flere sub-fenotyping av perifert blod myeloide celler. GR1 antistoffet gjenkjenner både Ly6G og Ly6C, og antistoffer mot disse markørene ble brukt for å skille subpopulasjoner innenfor CD11b
+ celler [6]. I samsvar med litteraturen, innenfor CD11b
+ GR1
+ celler var to store populasjoner preget av Ly6C og Ly6G: et klart distinkt populasjon av Ly6G
-Ly6C
+ celler og en stor bestand av Ly6G
+ celler som viste varierende uttrykk for Ly6C (figur 3AI-iii). Etter strålebehandling, var det en tilsynelatende tap av CD11b
+ GR1
+ Ly6G
+ celler uttrykker lavere nivåer av Ly6C (figur 3aiii). Ved hjelp av kontroller for å identifisere Ly6G
+ Ly6C
– celler (figur 3aiv) vi vist at strålebehandling mot tumor resulterte i en betydelig reduksjon i CD11b
+ GR1
+ Ly6G
+ celler som var Ly6C
-. Dette skjedde ikke når det motsatte lem ble bestrålt (figur 3av). For å karakterisere disse populasjonene, vi sortert disse sub-fenotyper fra perifert blod fra mus med 4T1 tumorer (figur 3b). I samsvar med tidligere karakteristikk [6], Ly6G
-Ly6C
+ celler hadde monocytter morfologi, Ly6G
+ Ly6C
+ hadde morfologi av nøytrofile og Ly6G
+ Ly6C
– celler hadde morfologi av modne nøytrofile. Tilsvarende blodutstryk fra tumor-bærende mus viste en markert økning i neutrofiler, som ble sterkt redusert etter strålebehandling mot tumor (figur 3c). Disse data viser at strålebehandling av tumor resulterer i en bestemt reversering av tumor-drevet nøytrofil utvidelse.
a) Strømningscytometri av ferskt full perifert blod fra i) naive mus eller mus som bærer 4T1 tumorer ii) ubehandlet eller iii) bestrålt, viser Ly6C og Ly6G innenfor gated CD11b
+ GR1
hi myeloide populasjoner. iv) Histograms av Ly6C uttrykk i gated CD11b
+ GR1
hiLy6G
+ celler, inkludert negativ kontroll farging (FMO) og viser prosentandelen Ly6C
– i mus bestrålt i tumor (svulst RT) eller motsatt lem (Tumor Leg RT). v) Andelen CD11b
+ GR1
hiLy6G
+ celler som er Ly6C
– fra naive mus (Ingen tumor) og mus dag 24 etter injeksjon av 4T1 ubehandlet (Tumor NT) eller behandlet begynner på dag 14 med 3 daglige doser på 20Gy fokal stråling til tumor (tumor RT) eller til ikke-affisert motsatte lem (tumor Leg RT). Hvert symbol representerer en mus. b) Cytospins av sortert CD11b
+ GR1
hi celler fra ubehandlede mus som er i) Ly6C
+ Ly6G
-, ii) Ly6C
+ Ly6G
+, eller iii) Ly6C
-Ly6G
+. Hver cytospin vises ved siden av den typen renhet tomt med økt forstørrelse på det innfelte boksen. c) Wright-Giemsa beis av d24 blodutstryk fra i) naive mus (Ingen tumor) og mus dag 24 etter injeksjon av 4T1 ii) ubehandlet (Tumor NT) eller iii) behandlet som begynner på dag 14 med 3 daglige doser på 20 Gy fokal stråling til tumor (tumor RT). Det innfelte boksen roteres og vist økt forstørrelse. NS = ikke signifikant; * = P 0,05; ** = P 0,01; *** = P 0,005; **** = P 0,001. Dataene representerer flere replikeres eksperimenter; hver subfigure inneholder data fra en annen replikere eksperimentet.
Tumor-drevet myeloide utvidelser er knyttet til det lokale betennelses miljø og konstruert uttrykk for GM-CSF [23] eller IL-1β [24] av kreft cellene er vist å drive myeloid ekspansjon. For å avgjøre om strålebehandling påvirkes myeloide tall ved å modulere disse cytokiner, vi analysert deres nivå i svulsten. Nivåene av GM-CSF, IL-1α, og IL-1β ble ikke endret i svulsten etter strålebehandling (figur 4a). Disse data indikerer at balansen mellom disse inflammatoriske cytokiner og vekstfaktorer i tumoren ikke er å styre endringen i myeloide tall. Selv om vi ikke kan utelukke regulering av andre vekstfaktorer, er det kanskje mer relevant at etter strålebehandling den primære svulster er betydelig mindre i diameter (figur 4bi) og vekt (figur 4bii). Hvis vi beregne antall celler i milten per mg av primærtumor, er det ingen forskjell mellom ubehandlede og bestrålte mus (figur 4biii). Således, selv uten vekstfaktor regulering på tumorstedet, vil en mindre tumorbyrde betyr færre tumoravledet vekstfaktorer for å påvirke myeloide tall. Derfor er disse data tyder på at myeloid sammentrekning etter cytotoksisk og cytoreduktiv terapi er hovedsakelig bestemt av svingninger i antall kreftceller.
a) Perler assay for i) GM-CSF, ii) IL-1α og iii) IL-1β i homogenater av 4T1 tumorer ved dag 24 etter injeksjon av 4T1 ubehandlet (NT) eller behandlet begynner på dag 14 med 3 daglige doser på 20 Gy fokal stråling til tumor (RT) eller til ikke-affisert motsatte lem (RT Opp ). b) D24 følgende svulst duell grafene viser i) leg diameter ii) svulst vekt og iii) splenocytes per milt /tumorvekt for mus ubehandlet (NT) eller behandlet som begynner på dag 14 med 3 daglige doser på 20 Gy fokus stråling (RT) . I hver graf, representerer hvert symbol en mus. NS = ikke signifikant; * = P 0,05; ** = P 0,01; *** = P 0,005; **** = P 0,001. Dataene er representative for tre replikere eksperimenter.
subpopulasjoner av myeloide celler fra tumor-bærende mus kan utøve undertrykkende effekter på T-celle funksjon
in vitro
. Av denne grunn vi undersøkt T-celler i milten etter strålebehandling. På grunn av myeloid ekspansjon i milten, T-celler utgjør en mindre andel av splenocytter; imidlertid total CD8 T-celle-tall var ikke forskjellig i tumorbærende mus eller etter strålebehandling av tumoren (figur 5a). Det CD8 T-celler holdes konstant mens myeloide celler økning resulterer i en dramatisk skjev myeloid: T-celle-forhold – i milten til forholdet øker fra en middelverdi på ca. 1,7 CD11b
+ per CD8
+ til 29 CD11b
+ per CD8
+ (p 0,001). Resultatet av den strålings-induserte reduksjon i myeloide celler er en forbedring i den myeloid: CD8-forholdet i milten – 20 CD11b
+ per CD8
+ (p 0,01) – noe som tyder på en noe forbedret mulighet for å initiere
de novo
immunresponser. I samsvar med dataene i CD8 T-celler, var det ingen endring i antallet av ikke-regulerende CD4 T-celler i tumorbærende mus og behandlede mus sammenlignet med kontroller (figur 5b). Imidlertid er tumorbelastning og strålebehandling ledsaget av en økning i antall T-regulerende celler (T
reg) i milten (figur 5B), målt ved CD4
+ celler som uttrykker CD25 og foxp3 (figur S1 ). Interessant, strålebehandling betydelig økt proliferasjon av CD8 T-celler og ikke-regulatoriske CD4 T-celler (figur 5c) som målt ved ekspresjon av Ki67 (figur S1), hvilket antyder at endogene immunresponser kan være mer aktiv i milten etter strålebehandling av primærtumor.
