Abstract
Bakgrunn
Tidligere arbeid har vist redusert uttrykk nivåer av la-7 i lungesvulster. Men lite er kjent om uttrykk eller mekanismer av la-7a på prostatakreft. I denne studien brukte vi in vitro og in vivo tilnærminger for å undersøke om E2F2 og CCND2 er direkte mål for la-7a, og hvis la-7a fungerer som en tumor suppressor i prostata kreft ved å nedregulere E2F2 og CCND2.
metodikk /Principal
Funn real-time RT-PCR vist at redusert nivå av la-7a er til stede i resected prostatakreft prøver og prostata kreft cellelinjer. Celleproliferasjon ble hemmet i PC3 celler og LNCaP celler etter transfeksjon med let-7a. Cellesyklus analyse viste at la-7a indusert cellesyklus arrest i G1 /S-fasen. En dobbel-luciferase reporter analysen viste at 3’UTR av E2F2 og CCND2 var direkte bundet til la-7a og western blotting analyse videre viste at la-7a nedregulert uttrykk for E2F2 og CCND2. Våre xenograft modeller av prostatakreft bekreftet evnen til la-7a å hemme prostata svulst utvikling in vivo.
Konklusjon /Betydning
Disse funnene bidra til å løse de anti-proliferative mekanismer la-7a i prostatakreft. La-7a kan også være roman terapeutisk kandidat for prostatakreft gitt sin evne til å indusere cellesyklus arrest og hemme cellevekst, spesielt i hormon-ildfast prostatakreft
Citation. Dong Q, Meng P, Wang T , Qin W, Qin W, Wang F, et al. (2010) mikroRNA La-7a hemmer spredning av menneskelige prostata kreft celler
In Vitro Hotell og
In Vivo
av målretting E2F2 og CCND2. PLoS ONE 5 (4): e10147. doi: 10,1371 /journal.pone.0010147
Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada
mottatt: 9 mars 2010; Godkjent: 23 mars 2010; Publisert: 14 april 2010
Copyright: © 2010 Dong et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra National Basic Research Program of China, 2009CB521705; og Science Foundation of China Nature, 30672097. De bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs (mirnas) er endogene, noncoding små RNA 20-25 nukleotider i lengde [1], som spiller en viktig regulerende rolle gjennom gratis binding av 3 «uoversatt regioner (UTR) av target gener. Bindingen resulterer i nedbrytning av mål-mRNA og inhibering av translasjon [2]. Mange mirnas er forbundet med kreft, og er involvert i celle utvikling, differensiering, proliferasjon, og celledød [3]. Mange rapporter har angitt at mirnas kan være nyttig for kreftdiagnose og terapi [4]. la-7 ble først identifisert i
Caenorhabditis elegans product: [5]. Det er nesten umulig å oppdage i den embryonale utviklingsstadiet, men blir mer rikelig i senere stadier av utvikling [6]. Tidligere arbeid har vist redusert ekspresjonsnivåer av la-7 i lungesvulster sammenlignet med normalt lungevev. la-7 bremser cellulær proliferasjon ved å nedregulere de onkogener RAS /c-myc og hmga-2 på det translasjonelle nivå [7], [8]. De samme kreft undertrykkende funksjoner har også blitt rapportert for la-7 i tykktarmskreft [9].
I silico analyser
potensielle la-7a mål (www.targetscan.org andwww.microrna .org) avslører at både E2F2 og CCND2 er mulige mål for la-7a. E2F2 og CCND2 er celle-syklus regulatorer og avvikende uttrykk for dem kan føre til unormal celledeling. Våre foreløpige forsøkene tyder på at protein nivåer av både E2F2 og CCND2 er oppregulert i PC3 prostatakreft cellelinje. Lite er kjent om uttrykk eller mekanismer av la-7a på prostatakreft. I denne studien brukte vi
in vitro Hotell og
in vivo
tilnærminger til å undersøke om E2F2 og CCND2 er direkte mål for la-7a, og hvis la-7a fungerer som en tumor suppressor i prostata kreft ved å nedregulere E2F2 og CCND2.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle prøver ble innhentet fra pasienter som registrerte informert samtykke godkjenne bruk av sine vev for forskning formål etter operasjonen. Klinikken patologiske faktorer av 26 pasienter ble vist i tabell S1. Bruken av menneskelig vev i denne studien ble godkjent av Institutional Review Board av den fjerde Military Medical University og var i samsvar med deres retningslinjer (Ingen 2008039085). Alle forsøk med dyr ble utført i henhold til dyrevernloven og godkjent av Animal Care og bruk Committee for fjerde Military Medical University. (Godkjenningsnummer 200804052353).
Cell kultur og vev samling
Menneskelig prostata kreft cellelinjer LNCaP, DU145, PC3, og prec (prostata epitelceller) og menneskelige embryonale nyreceller HEK293A ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Celler ble dyrket i RPMI-1640 (Gibco) supplementert med 10% føtalt kalveserum og penicillin (100 U /ml). Kulturer ble opprettholdt under en atmosfære inneholdende 5% CO
2 (Forma Scientific). Tjueseks fersk resected prostatakreft prøver og deres tilstøtende ikke-tumorprøver ble samlet inn fra Department of Urology i Xi’jing Hospital. Prøvene ble umiddelbart frosset i flytende nitrogen og holdes der inntil bruk.
Plasmid konstruksjon og celle transfeksjon
La-7a ble amplifisert og renset ved miRNA isolasjonskit (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge til produsentens protokoll. PCR primere for la-7a var:
5′-GAATTCTCACACAGGAAACCAGGA-3 «product: (fremover) og
5′-CTGCAGTCAGGCATTTAAGTGACCG-3′ product: (bakover). La-7a PCR-produkter ble klonet inn i
Eco
RI /
Pst
jeg kloning stedet av en pcDNA3 plasmid som inneholder grønt fluorescerende protein (GFP) for å danne plasmid pcDNA3-la-7a-GFP . Celle transfeksjon ble utført med lipofektamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge produsentens protokoll. Kort fortalt ble PC3 cellene sådd ut i seks brønners plater og dyrkes uten antibiotika til 70-90% samløpet. Hver brønn mottok 6 ul lipofektamin-reagens inneholdende 3 ug plasmid-DNA. Tre brønner mottok pcDNA3-la-7a-GFP plasmid, mens de øvrige brønnene fikk den tomme vektoren pcDNA3-GFP. G418 (400 ug /ml) ble tilsatt til cellene 24 timer etter transfeksjon. Blandede kloner ble screenet og dyrket i ytterligere 4 uker. PC3-celler transfektert med la-7a ble betegnet som PC3-la-7a-GFP, den negative kontroll (celler transfektert med den tomme vektoren) ble betegnet som PC3-GFP. PC3 cellene ble også transfektert med 30 nM av syntetisk la-7a (etterligner), og syntetiske negative kontroll mirnas (NC). Til slutt, en syntetisk la-7a-inhibitor-sekvensen og syntetiske la-7a-inhibitor negativ kontroll (NC inhibitor). Sekvenser av syntetisk HSA-la-7a, negativ kontroll, HSA-la-7a inhibitor og inhibitor negativ kontroll ble vist i tekst S1.
Total RNA ekstraksjon og real-time RT-PCR
for la-7a, ble Total RNA hentet fra prøver ved hjelp av en miRNeasy Mini Kit (Qiagen). cDNA ble syntetisert ved bruk av TaqMan mikroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Real-time RT-PCR ble utført med TaqMan mikroRNA Assay kit (Applied Biosystems). Primeren for la-7a var
5′-GAGGTAGTAGGTTGTATA-3 «.
For E2F2 og CCND2, total RNA ekstraksjon og real-time RT-PCR ble utført ved hjelp av SYBR® grønnere ™ To-trinns kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). PCR primere for E2F2 var:
5′-GAGCTCACTCAGACCCCAAG-3 «product: (fremover) og
5′-AACAGGCTGAAGCCAAAAGA-3′ product: (bakover). PCR primere for CCND2 var:
5′-AAGAATTCCTCCTCAATAGCCTGCAGCAGTA-3 «product: (fremover) og
5′-GCGGGATATCGACCTGTGAGAATTCGAT-3′ product: (bakover). Alle protokoller ble utført i henhold til produsentens protokoller. Ekspresjonsnivået av let7a ble normalisert til RNU6B. Ekspresjonsnivået av E2F2 og CCND2 ble normalisert til GAPDH. Sanntids RT-PCR ble utført ved å bruke 7500 sanntids RT-PCR System (Applied Biosystems). PCR ble utført under de følgende betingelser: 50 ° C i 2 minutter, 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 50 sykluser ved 95 ° C i 15 s, og 60 ° C i 1 min. Hver prøve ble kjørt i tre eksemplarer.
MTT analysen
PC3 celler og LNCaP celler transfektert med enten NC eller la-7a (etterligner) eller NC hemmer og la 7a inhibitor ble sådd ut på 96 -vel platene på 1 x 10
4 celler /brønn. Levedyktige celler ble målt 1, 2, 3, 4 og 5 dager etter plettering. Etter inkubasjon med 3- (4, 5-dimethylthiazolyl-2) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) ble cellene lysert i 150 ul 100% dimetylsulfoksyd (DMSO) og UV-synlige absorbansen ble avlest ved 490 nm under anvendelse av 96-brønners plateleser. Hver prøve ble kjørt i triplikat.
myk-agar assay
I korthet ble 2 ml 0,5% agar ble tilsatt til hver brønn av en 12-brønns plate. Frittliggende PC3-la-7a-GFP og PC3-GFP-celler ble blandet med suspensjonen topagarose (sluttkonsentrasjon 0,3%), og deretter ble cellene lagvis på 0,5% agarose underlag. Antallet foki 100 um ble tellet etter 18 dager. Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer.
Cell syklus analyse
PC3 celler og LNCaP celler transfektert med enten NC eller la-7a (etterligner) eller NC-hemmer eller la-7a inhibitor ble høstet 72 timer etter transfeksjon, ble vasket med kald fosfatbufret saltløsning (PBS), og fiksert i 1 ml 70% etanol. Etter inkubering over natten ved 4 ° C i etanol, ble cellene vasket i PBS og suspendert i 500 ul propidine jodid (PI) 30 min før flowcytometri. Populasjoner i G0-G1, S og G2-M fasen ble målt ved flowcytometri (EPICS XL, Coulter, Miami FL) og dataene ble analysert ved hjelp av Multicycle-DNA Cell Cycle Analyserte Software. Målingen ble utført i tre eksemplarer.
Dual-luciferase reporter analysen
For å undersøke om E2F2 og CCND2 uttrykk ble regulert av la-7a, ble en dual-luciferase reporter analysen utført. 3′-UTR av CCND2 og E2F2 ble amplifisert ved PCR respektivt. Forsterkning av CCND2 brukt følgende primere:
5′-GAATTCATGAGTTCTTCGTACTGG-3 «product: (fremover) og
5′-GATATCCCATCATGAT GAGGATAC-3′ product: (bakover). PCR produktene var 398 bp og inneholdt to bindingssteder for la-7a. Den muterte 3′-UTR av CCND2 ble syntetisert etter punkt mutasjoner ble foretatt i flere baser i løpet av bindingssetene i disse PCR-produktene. Forsterkning av 3′-UTR av E2F2 brukt følgende primer sekvenser:
5′-GAATTCCTCTTCGACTCCTACGAC-3 «product: (fremover) og 5
« – GATATCTGTGCTTCTT GGTACGTCG-3 «product: (bakover). PCR produktene var 415 bp og inneholdt to bindingssteder for la-7a. Mutert 3»-UTR av E2F2 ble syntetisert etter flere punktmutasjoner ble gjort i bindingsstedene PCR produktene. Etter restriksjonsspaltning ble det amplifiserte gener klonet inn i de tilsvarende områder av et rekonstruert pGL3 ekspresjonsvektor. PRL-TK kontroll vektor som uttrykker Renilla luciferase (Promega) ble anvendt for normalisering av celletallet og transfeksjonseffektiviteten. Cotransfections av syntetisk la-7a sekvens (etterligner) og NC, eller la-7a hemmer og NC-hemmer ble også utført i humane embryonale nyreceller HEK293A ved hjelp lipofektamin 2000 (Invitrogen). Firefly og Renilla luciferase aktivitet ble bestemt ved Pikkagene Dual Luciferase Assay System (Toyo-B-Net)
Western blotting-analyse
Følgende antistoffer ble brukt til western blotting. Mus anti-E2F2 ( 1:200 fortynning, Santa Cruz Biotech); mus anti-cdk4 og mus anti-cyclin D2 (1:300 fortynning, BD Biosciences, San Jose, CA); mus anti-k-RAS (1:300 fortynning, Cell Signaling Technology, Beverly, MA); kanin anti-β-aktin (1:4000 fortynning, Sigma). Tjuefem mikrogram prostatakreft prøver og deres tilstøtende ikke-tumorous prøver «protein samt PC3-la-7a-GFP og PC3-GFP protein ble elektroforese i 10% SDS-PAGE Minigeler og overført til Hybond C nitrocellulosemembraner (Amersham life Science, Buckinghamshire, UK). Etter inkubering med primære antistoffer ved 4 ° C over natten, ble nitrocellulosemembranene vasket tre ganger med Tris-buffret saltvann Tween-20 (TBST) og deretter inkubert med fluorecein (FITC) -konjugert, geite-anti-mus eller geite-anti-kanin IgG (1:500 fortynning, Sigma) i 1 time ved romtemperatur. Etter vask med TBST, ble blotter visualisert ved hjelp av Odyssey Infrared Imaging system (LI-COR Bioscience, Lincoln, Nebraska USA). Hver analysen ble gjentatt tre ganger.
tumorigenitet
Fem nakne mus ble subkutant injisert med ~ 1 × 10
6 PC3-la-7a-GFP eller PC3-GFP celler på en enkelt området av ryggen. Vekten av tumoren og vekten av mus ble målt ved tidspunktet for avlivelse (4 uker etter injeksjon). Western blotting ble utført for å undersøke om E2F2 og CCND2 ble nedregulert i nude-mus xenograft modell. Tumor suspensjoner ble behandlet med lysebuffer og western blotting ble gjort i henhold til prosedyrene som er beskrevet ovenfor.
Statistisk analyse
Forskjeller mellom hver gruppe ble bestemt av T test eller Mann-Whitney
U
test med Statistiske SPSS programvarepakke (SPSS Inc, Chicago) (
p
0,05 ble betraktet som signifikant).
Resultater
La-7a er nedregulert i resected prostatakreft prøver og i prostata kreft celler
real-time RT-PCR viste at uttrykket nivåer av la-7a ble redusert med ~43% i resected menneskelige prostatakreft sammenliknet med de tilstøtende ikke -cancerous prøver. Prostata kreft cellelinjer LNCaP uttrykkes bare ~70% som la-7a enn normale prostata epitelceller prec. I tillegg er mengden av la-7a-ekspresjon i PC3-celler og DU-145 var omtrent 50% av det som ble observert i Prec. Disse resultatene indikerer at la-7a er redusert i prostata cancer, inkludert androgen-uavhengig kreft PC3 (Fig. 1, *
p
0,05, **
p
0,01) .
real-time RT-PCR viser at den relative uttrykk for la-7a i tjue-seks prostatakreft prøvene, og i prostata kreft cellelinjer LNCaP, PC3, er DU-145 høyere enn i deres tilstøtende ikke-kreftprøver og normal prostata epitelceller prec. Data er vist som prosent av midlere signaler i vev og celler fra tre uavhengige målinger. RNU6B ble målt i parallell, og som brukes til å normalisere ekspresjonsnivået av la-7a i hvert forsøk. Verdier representerer betyr og feilfelt representerer SEM. (*
p
0,01, **
p
0,01; Mann-Whitney-U test).
La-7a hemmer cellevekst
in vitro Hotell og induserer cellesyklus arrest i G0-G1 fase
Etter transfeksjon, uttrykket nivået av la-7a i PC3-la-7a-GFP var ~300% høyere enn i PC3-GFP ved real-time RT-PCR; En tidobling i uttrykket av la-7a ble observert i PC3 celler transfektert med let-7a (etterligner) versus de tilført med NC (figur 2A,
p
. 0,01). Dette indikerte at transfeksjonen ble riktig utført. Kolonidannelse analyse indikerte at koloniene dannelsen evnen til PC3-la-7a-GFP-celler er ~40% mindre enn for kontrollceller (figur 2B,
p .
0,01). MTT vekstkurver indikerte at fra den andre dagen, overlevelsen av la-7a transfekterte PC3-celler og LNCaP-celler er betydelig mindre enn den for negativ kontroll, og overlevelsen av la-7a inhibitor transfekterte PC3-celler og LNCaP-celler er betydelig mer enn det av NC inhibitor transfekterte celler (figur 2C,
p.
0,05). Strømningscytometri viste at prosentandelen av la-7a transfekterte PC3-celler og LNCaP-celler i G0-G1 fase var ~ 30% (PC3) og 16% (LNCaP) høyere enn den til negativ kontroll, som parallelt med et -50% ( PC3) og 20% (LNCaP) reduksjon i S-fasen. prosentandelen av la-7a inhibitor transfekterte PC3-celler og LNCaP-celler i G0-G1 fase ble ~23% (PC3) og 19% (LNCaP) mindre enn den til NC-inhibitor transfekterte celler, som har sin parallell med en ~33% (PC3 ) og 25% (LNCaP) økning i S-fasen (figur 2D, *
p
. 0,05; **
p
0,01). Disse data indikerer at la-7a inhiberer PC3 proliferasjon ved å indusere cellesyklus-stans ved G1 /S-fasen.
(A) Relativ ekspresjon av la-7a i PC3-celler transfektert med pcDNA3-GFP, pcDNA3-brev 7a-GFP, NC, og la 7a (etterligner). RNU6B ble målt i parallell, og som brukes til å normalisere ekspresjonsnivået av la-7a i hvert forsøk. Verdier representerer midler fra tre separate forsøk og feilfelt representerer SEM. (**
p
0,01; Mann-Whitney-
U
test). (B) PC3-la-7a-GFP og PC3-GFP-celler ble dyrket i medium inneholdende myk agar og inkubert i 18 d. Antallet foki 100 um ble tellet. Verdier representerer midler fra tre separate forsøk og feilfelt representerer SEM. (*
p
0,01; Mann-Whitney-
U
test). (C) Livskraftig av PC3 celler og LNCaP celler som transfektert med la-7a, NC eller la-7a inhibitor, ble NC inhibitor målt ved MTT analyser hhv. UV-synlige absorbansen ble målt ved 490 nm. Verdier representerer midler fra tre separate forsøk og feilfelt representerer SEM. (*
p
0,05; parvise sample T-test). (D) Analyse av cellesyklus i PC3-celler etter transfektert med NC og la-7a (ligner) eller NC-inhibitor og la-7a-inhibitor, samt analyse av cellesyklusen i LNCaP-celler etter transfektert med NC og la-7a (ligner ) eller NC hemmer og la 7a hemmer. Verdier representerer midler fra tre separate forsøk og feilfelt representerer SEM. (*
p
0,05, **
p
0,01; Mann-Whitney-
U
test).
Let -7a mål 3’UTR av E2F2 og CCND2
Figur 3A viser sekvenser av de 3 «UTR av E2F2 og CCND2 som representerer bindingssteder for la-7a. De tilsvarende sekvenser av de muterte 3 «UTR av E2F2 og CCND2 er vist i tillegg. Ingen reduksjon av luciferase-aktivitet ble observert i HEK293A celler transfektert med la-7a (ligner) og mutert CCND2 eller E2F2. Men større enn 30% reduksjon av luciferase-aktivitet ble observert med villtype-CCND2 og -50% reduksjon av luciferase-aktivitet ble observert med villtype E2F2 (figur 3B, **
p
. 0,01). Sammenlignet med NC-inhibitor, er det ingen signifikant forskjell i luciferaseaktivitet når HEK293A-celler ble transfektert med den la-7a-inhibitor og villtype CCND2 eller E2F2 (Fig. 3C). Disse data støtter at E2F2 og CCND2 er direkte mål for la-7a og endogen la-7a i HEK293A har ingen forstyrrelser på vår erfaring.
(A) bindingsseter på E2F2 og CCND2 for la-7a med den tilsvarende muterte E2F2 og CCND2 sekvenser. (B) Relativ luciferase aktiviteten av humane embryonale nyreceller HEK293A etter transfeksjon med NC eller la-7a (etterligner) og deretter også co-transfektert med PRL-TK kontroll vektor, eller pGL3 uttrykk vektor som inneholder enten WT-CCND2-3’UTR eller MUT-CCND2-3’UTR eller WT-E2F2-3’UTR eller MUT-E2F2-3’UTR. (C) Relativ luciferaseaktivitet av humane embryonale nyreceller HEK293A etter transfeksjon med NC-inhibitor eller la-7a-inhibitor og også ko-transfektert med PRL-TK kontroll vektoren, eller den pGL3 ekspresjonsvektor inneholdende enten WT-CCND2-3’UTR eller WT-E2F2-3’UTR. Verdier representerer midler fra tre separate forsøk og feilfelt representerer SEM. (**
p
0,01; Mann-Whitney-
U
test).
La-7a hemmer uttrykk for E2F2, CCND2
real-time RT-PCR viser at mRNA relative uttrykk for E2F2 og CCND2 i prostata kreft vev og i LNCaP, PC3, og DU-145 celler er oppregulert sammenlignet med sine tilstøtende ikke-kreft prøver og PREC celler (fig. 4A, B, *
p
0,05; **
p
0,01). Men sammenlignet med Prec, mRNA uttrykk for E2F2 og CCND2 er nedregulert etter transfektert med la-7a i PC3 og LNCaP celler (fig 4C, D, *
p
. 0,05; **
p
0,01). Western blotting Resultatene viste ingen endring av CDK4 protein uttrykk mellom prostatakreft vev og deres tilstøtende ikke-tumorvevet eller mellom PC3-la-7a-GFP celler og PC3-GFP celler, økte uttrykket nivåer av E2F2 CCND2 i prostata kreft vev sammen sammen med sine tilstøtende ikke-tumorøse vev, men uttrykket nivåene av E2F2, CCND2 og K-ras minsket dramatisk i PC3-la-7a-GFP-celler sammenlignet med den i PC3-GFP-celler (fig. 4E). K-ras, en tidligere definert molekylære mål av la-7a [7] ble anvendt som en positiv kontroll for disse eksperimentene. Disse data støtter at la-7a nedregulering av mRNA uttrykk for E2F2 og CCND2 og undertrykke protein oversettelse av dem.
(A) Real-time RT-PCR viser at relative uttrykk nivået E2F2 i prostata kreft vev og i LNCaP, PC3, og DU-145-celler er mye høyere enn i de tilstøtende ikke-kreft legemer og Prec celler (*
p
0,05, **
p
0,01 ; Mann-Whitney-
U
test). (B) Sanntid RT-PCR viser det relative ekspresjonsnivå av CCND2 i prostata kreftvev og LNCaP, PC3 og DU-145-celler er mye høyere enn i de tilstøtende ikke-kreft legemer og Prec celler (*
p
0,05, Mann-Whitney-
U
test). (C) Real-time RT-PCR viser at relative uttrykk nivået E2F2 i LNCaP og PC3 cellene er mindre enn i PREC celler etter transfektert med la-7a (*
p
0,05, **
p
0,01; Mann-Whitney-
U
test). (D) Real-time RT-PCR viser at relative uttrykk nivået CCND2 i LNCaP og PC3 cellene er mindre enn i PREC celler etter transfektert med la-7a (*
p
0,05, Mann-Whitney-
U
test). Alle verdiene representerer midler fra tre separate forsøk og feilfelt representerer SEM. GAPDH ble målt i parallell, og som brukes til å normalisere uttrykket nivåer av E2F2 og CCND2 i hvert forsøk. (E) Western blotting viser at ingen endring av CDK4 uttrykk mellom prostata kreftvev og deres tilstøtende ikke-kreft prøver, eller mellom PC3-la-7a-GFP-celler og PC3-GFP-celler. Uttrykket nivåer av E2F2 og CCND2 er høyere i prostata kreft vev enn i sine tilstøtende ikke-kreft prøver. Etter transfektert med la-7a, uttrykket nivåer av E2F2, CCND2, og k-ras sunket dramatisk i PC3-la-7a-GFP celler sammenlignet med i PC3-GFP celler. β-actin ble brukt lasting kontroll.
La-7a hemmer tumorvekst i hårløse mus xenograft modell
Nude mus med PC3-la-7a-GFP eller PC3-GFP xenografter ble avlivet 4 uker etter inokulering. Svulster ble skåret ut og målt (fig. 5A). Western blotting viste at uttrykket nivåer av E2F2 og CCND2 sunket dramatisk i PC3-la-7a-GFP svulster sammenlignet med PC3-GFP svulster (Fig. 5B). Vekten av PC3-la-7a-GFP svulster var ~80% lettere enn PC3-GFP tumorer (figur 5C,
p
. 0,01). Videre er forholdet mellom tumorvekt /kroppsvekt i mus som bærer PC3-la-7a-GFP tumorer var bare ~6% av forholdet fra mus som bærer PC3-GFP tumorer (figur 5D,
p
0,01), som gir sterke bevis for at la-7a kan hemme tumorvekst
in vivo
.
(A) Fotografi av skåret svulster 4 uker etter implantasjon. Den øverste raden viser tumorer skåret ut fra mus injisert med PC3-GFP celler. Den nedre er tumorer skåret ut fra mus injisert med PC3-la-7a-GFP-celler. Av mus injisert med PC3-la-7a-GFP-celler, ble det ikke påvist tumor i en mus og en mus døde 2 dager etter injeksjon. (B) Western blotting viste at ekspresjon av E2F2 og CCND2 minsket dramatisk i tumorer skåret ut fra PC3-la-7a-GFP-tumor-mus-lageret sammenlignet med de med PC3-GFP tumorer. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. (C) Tumorvekt og (d) forholdet mellom tumorvekt /kroppsvekt ble bestemt når mus ble avlivet. Verdier representerer betyr og feilfelt representerer SEM. (**
p
0,01; Mann-Whitney-
U
test).
Diskusjoner
Den manglende evne til en celle til regulere vekst og spredning er et karakteristisk trekk ved kreft. Som kritiske molekyler i cellesyklusregulering, E2F proteiner er nedstrøms av vekstfaktorsignale kaskader. De påvirker cellevekst og proliferasjon gjennom deres evne til å regulere gener som er involvert i celle-syklusprogresjon [10], [11]. E2F2 er et medlem av E2F-familien av transkripsjonsfaktorer, og har blitt godt karakterisert som en regulator av G1-til-S-fase overgang [12]. Tidligere rapporter viser at E2F2 har sterk onkogene kapasitet og kan fremme cellesyklusprogresjon. Cellelinjer transfektert med E2F2 sprer på det dobbelte av frekvensen av kontrollceller [13]. For å sikre riktig progresjon gjennom cellesyklus, er fosforylering aktivitet av cyklinavhengig kinase (Cdk) viktig. CCNDs er uttrykt i tidlig G1 fase og binde Cdk4 og CDK6 [14]. Aktiveringen av disse kinaser resulterer i fosforylering av andre kritiske celle-syklus regulatorer så som pRb. pRb aktiverer deretter E2Fs og lar S-fase oppføring. Følgelig vil avvikende ekspresjon av CCND2 og E2F2 føre til unormal cellulær proliferasjon. Overekspresjon av CCND2 ble rapportert i eggstokkene granulose celle svulster, magekreft og tykktarmskreft [15] – [17]. Tilsvarende oppregulering av E2F2 ble funnet i astrocytomas på ulike graderinger [18].
mirnas post-transcriptionally regulerer genuttrykk ved å binde seg til 3’UTR av målet mRNA. Binding fører til nedbrytning av målet mRNA og redusert oversettelse av target proteiner. miRNA aktivitet påvirker også uttrykket av gener som er nedstrøms direkte mål, og kan føre til endringer i globale protein expression profiler. Derfor mirnas potensielt spille en avgjørende rolle i utviklingen av kreft hos mennesker. En stor del av bevis støtter at avvikende uttrykk for miRNAs forekommer i ulike typer kreft hos mennesker, og på ulike stadier av kreft progresjon [19], [20]. la-7 har blitt rapportert å virke som en tumor suppressor i enkelte krefttyper, for eksempel lunge og tykktarmskreft [9], [21] – [23], og at reduserte uttrykk nivåer av la-7 er korrelert med dårlig klinisk prognose [ ,,,0],24].
Selv om denne sammenhengen mellom la-7 uttrykk og sykdom er sterkest i lungevev, hvor la-7 uttrykket er høy, mener vår studie som la-7 forårsaker cellesyklusdefekter i prostatakreft cellelinje som godt. Vi fant ut at la-7a uttrykk nivå er nedregulert dramatisk i prostata kreft vev og cellelinjer. Protein og mRNA uttrykk nivåer av E2F2 og CCND2 er nedregulert i PC3 og LNCaP celler etter transfeksjon med la-7a. Våre xenograft modeller av prostatakreft også bekrefte våre
in vitro
resultater og viser at la-7a har evnen til å hemme prostata svulst utvikling
in vivo
. Vår dual-luciferase reporter analysen bekreftet at E2F2 og CCND2 er direkte mål for la-7a. Dessuten har andre gener assosiert med cellesyklusregulering blitt rapportert å bli undertrykt direkte eller indirekte av la-7. Disse inkluderer CDC34, som fremmer nedbrytning av cyklinavhengig kinase (CDK) inhibitor 1B og CCNA2, som fremmer G1-S og G2-M faseoverganger [25]. Vår etableringen utvider familien av la-7 mål, og identifisere de molekylære stier berørt i kreft kan videre avsløre mekanismene som la-7a hemmer celledeling. Selv om mye er fortsatt å bli lært om rollen la-7a i prostatakreft tumorigenesis, la-7a gir oss en ny måte for prostatakreft behandling via sin evne til å indusere cellesyklus arrest og hemme cellevekst.
støtte Informasjon
Tabell S1.
Clinic patologiske faktorer av 26 pasienter i dag brukes
doi:. 10,1371 /journal.pone.0010147.s001 plakater (0,08 MB DOC)
Tekst S1.
Sekvenser av syntetisk Hsa-la-7a, negativ kontroll, Hsa-la-7a hemmer og hemmer negativ kontroll
doi:. 10,1371 /journal.pone.0010147.s002 plakater (0,02 MB DOC)
Takk
Vi ønsker å takke Lijie han for god redaksjonell bistand og innsiktsfulle forslag.
