Abstract
Formål
Analysen av exosome /mikrovesikkelen (ekstracellulære vesikler (EVS)) og RNA pakket inne i dem (exoRNA) har potensiale for å tilveiebringe en ikke-invasiv plattform for å detektere og overvåke sykdomsrelatert genekspresjon potensielt
i stedet
av mer invasive prosedyrer som for eksempel biopsi. Imidlertid har få studier testet den diagnostiske potensialet i EV analyse hos mennesker
Experimental Design
Evnen til EV-analyse for å gjenspeile prostatavevet mRNA uttrykk ble undersøkt ved å sammenligne urin EV TMPRSS2. ERG exoRNA fra pre-radikal prostatektomi (RP) pasienter versus tilsvar RP vev hos 21 pasienter. For å undersøke differensial uttrykk for TMPRSS2: ERG over pasientgrupper en tilfeldig urinprøve ble tatt uten prostata massasje fra en kohort av 207 menn, inkludert prostata biopsi negativ (Bx Neg, n = 39), prostatabiopsi positive (Bx Pos, n = 47 ), post-radikal prostatektomi (post-RP, n = 37), un-biopsied friske jevnaldrende menn (No Bx, n = 44), og unge mannlige kontroller (Cont, n = 40). Bruk av elbiler ble også undersøkt som en potensiell plattform til en ikke-invasiv skille Bx Pos versus Bx Neg pasienter via påvisning av kjente prostata kreftgener TMPRSS2. ERG, BIRC5, ERG, PCA3 og TMPRSS2
Resultater
i denne tekniske pilotstudie urin elbiler hadde en sensitivitet: 81% (13/16), spesifisitet: 80% (4/5) og en samlet nøyaktighet: 81% (17/21) for non-invasiv påvisning av TMPRSS2: ERG versus RP vev. Frekvensen av TMPRSS2: ERG exoRNA påvisning ble funnet å øke med alderen og ekspresjonsnivået korrelert med Bx Pos status. Mottaker operatør karakteristiske analyser vist at ulike kreftrelaterte gener kunne skille Bx Pos fra Bx Neg pasienter som bruker exoRNA isolert fra urin EVs: BIRC5 (AUC 0,674 (KI: 0,560 til 0,788), ERG (AUC 0,785 (KI: 0,680 til 0,890), PCA3 (AUC 0,681 (KI: 0,567 til 0,795), TMPRSS2: ERG (AUC 0,744 (KI: 0,600 til 0,888), og TMPRSS2 (AUC 0,637 (KI: 0,519 til 0,754)
Konklusjon
Denne pilotstudien tyder på at urin elbiler har potensial til å bli brukt som en plattform til ikke-invasiv skille pasienter med prostatakreft med svært god nøyaktighet. Større studier er nødvendig for å bekrefte potensialet for klinisk nytte.
Citation:.. Motamedinia P, Scott AN, Bate KL, Sadeghi N, Salazar G, Shapiro E et al (2016) Urin Exosomes for ikke-invasiv Vurdering av genekspresjon og Mutasjoner av prostatakreft PLoS ONE 11 (5): e0154507 . doi: 10,1371 /journal.pone.0154507
redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 6 august 2015; Godkjent: 14 april 2016; Publisert: 04.05.2016
Copyright: © 2016 Motamedinia et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. J Lin fikk Doris Duke Charitable Foundation Award. Denne studien ble støttet av Exosome Diagnostics, Inc. Funder gitt støtte i form av lønn for forfattere ANS, KLB, GS, MJD, WDC, LMR, og hadde en ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, og forberedelse av manuskriptet. . De spesifikke roller disse forfatterne er formulert i § «forfatter bidrag «
Konkurrerende interesser: ANS, KLB, GS, WDC, LMR og MJD var ansatte eller konsulenter til Exosome Diagnostics, Inc på tidspunktet for studien. WDC er aksjonær i Exosome Diagnostics, Inc. har LMR aksjeopsjoner i Exosome Diagnostics, Inc. Disse konkurrerende interesser ikke påvirker forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Exosomes og mikrovesikler er lipid-dobbeltlag-vesikler (vanligvis 30-200 nm i diameter). Under formasjons, exosomes og mikrovesikler (kollektivt referert til heri som ekstracellulære vesikler (EV)) innkapsle en del av de overordnede cellecytoplasmaet inkludert membranproteiner, cytosoliske proteiner [1] og nukleinsyrer (hovedsakelig RNA referert til heri som exoRNA) [2, 3]. De elbiler blir så frigjort fra celler og kan høstes fra biofluids inkludert blod og urin. Hittil har det vært få betydelige studier for å forstå potensialet diagnostisk bruk av elbiler.
Prostatakreft representerer den vanligste kreftformen hos menn og den nest vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall i USA [4] . Serum prostata spesifikt antigen (PSA) brukes som en biomarkør for prostatakreft, selv om denne strategien er blitt kritisert på grunn av sin lave sensitivitet og spesifisitet [5]. Schröder
m.fl. product: [6] fant at 1055 menn trenger å bli skjermet og 37 menn trenger å bli behandlet for å redde ett liv. Denne over-diagnose og overbehandling resulterer i redusert livskvalitet og økte helsekostnader, fremhever det presserende behovet for mer sensitive og spesifikke diagnostiske strategier [7,8]. I 2009 ble det rapportert at prostata-relaterte gener kan være vellykket påvises i urin elbiler [9]. Vi har nylig avanserte metoder til i) raskt isolere intakte elbiler fjerne avhengigheten av ultrasentrifugering og muliggjør tilpasning til det kliniske laboratoriet innstillingen og ii) oppnå høy integritet exoRNA viktig for pålitelig transkripsjonen analyse [10,11].
I 2005 , Tomlins
et al
. [12] rapporterte identifikasjon av prostataspesifikt TMPRSS2: ERG fusjon mutasjon mellom androgen drevne genet transmembrane protease serin 2 (TMPRSS2) og oncogenet Ets beslektede gener (ERG). Den vanligste fusjon hendelse (TMPRSS2 ekson en med ERG exon 4) har blitt rapportert å ha en insidens mellom 20% -80% i prostatakreft [13,14]. Fusion status har blitt undersøkt via ulike teknikker, inkludert fluorescens
in situ
hybridisering (FISH) og RT-PCR [15]. Et annet gen som vanligvis undersøkes i prostata kreft er PCA3, opprinnelig kalt Differential Display kode 3 (DD3), er PCA3 en ikke-kodende gen sterkt uttrykt i prostata kreft [16]. Andre gener som er involvert i prostatakreft omfatter baculoviral IAP gjenta inneholdende 5 (BIRC5), også kjent som Survivin [17] og ERG [18]. Kallikrein 3 (KLK3), også kjent å kode PSA [19], er en prostata relaterte gen hvis mRNA-nivåer er tidligere blitt anvendt for å standardisere genekspresjon i urinsedimenter [20].
Tidligere studier undersøke prostata markørgen uttrykk i urinen ha krevd prostata massasje for å skaffe nok celler for RNA-analyse. Detaljene i massasje varierer mye mellom studiene, fra bruk av mild digital trykk til side lapper til fast trykk over hele kjertelen [20-26]. Slike manipulasjoner kan føre til ubehag for pasienten og inter-leverandør variabilitet. I tillegg den nødvendige prostata massasje før urinsamlingen mandater en direkte interaksjon med en lege via et kontor besøk før hver prøvetaking, noe som resulterer i økte kostnader. Den nåværende pilotstudie undersøker potensialet for diagnostikk av elbiler i en tilfeldig urinprøve tatt uten forutgående prostata massasje. Vi bruker påvisning av prostata spesifikt gen-fusjons hendelse (TMPRSS2: ERG) i urin EV før radikal prostatektomi (RP) sammenlignet med matchet vev fra det kirurgiske prøven for å undersøke muligheten av urin el-biler for å reflektere vev uttrykk. Vi undersøker bruk av elbiler som en plattform til en ikke-invasiv skille menn med biopsi påvist prostatakreft (Bx Pos) fra de med negative prostatabiopsier (Bx Neg) ved hjelp av tidligere beskrevet gener involvert i prostatakreft.
videre materialer og metoder
Prøve innkjøp
The Columbia University Institutional Review Board godkjent denne studien. Skriftlig samtykke ble innhentet for de prøver samlet. Tilfeldige urinprøver samlet inn uten prostata massasje, ble innhentet fra 207 menn gruppert i: biopsi negativ (Bx Neg, n = 39), biopsi positive (BX Pos, n = 47), post-radikal prostatektomi med ingen bevis for gjenværende sykdom (post -RP, n = 37), alder matchet menn (ingen historie av prostatakreft) (Ingen Bx, n = 44) og friske kontroller (menn 35 år) (Cont, n = 40). Urinprøver ble lagret ved 4 ° C inntil bruk. Av notatet, BX Neg gruppen inkluderte pasienter med høy grad av prostata intraepitelial neoplasi (HGPIN) og /eller atypisk liten acinar spredning (ASAP) på biopsi. Alle urinprøver ble gitt for analyse fortløpende og i blindt. Radikal prostatektomi vev ble oppnådd fra 21 pasienter for hvem matchende urinprøver samlet inn før RP var tilgjengelige (n = 21). Den formalinfiksert parafin innebygd RP vev ble kuttet på 5 mikrometer og montert på glassplater, som per Patologi Department protokollen. Vevet ble deretter frosset ved -80 ° C inntil bruk.
Urinprøve behandling
Urinprøver ble behandlet som tidligere rapportert [10] med 20 ml urinprøver. Et 0,8 um filter (Nalgene, NY) ble anvendt for å fjerne hele celler og cellerester. Mikrovesikler /exosomes ble isolert ved anvendelse av en 100k MWCO filtrering konsentrator (Millipore, MA) som tidligere beskrevet (10). Etter tilsetningen av urinprøven, ble filtrerings konsentratoren sentrifugert ved 4500 x
g
i 5 minutter og filtratet kasseres og supernatanten bevart. Retentatet gjennomgikk så en 10 ml PBS-vask og to 15ml PBS-vaskinger, etterfulgt av sentrifugering ved 4500 x
g
i 5 minutter etter tilsetningen av hver enkelt PBS vask. 4 pl RNasin (Promega, WI) ble tilsatt til den isolerte elektriske biler før RNA-ekstrahering for å fjerne eventuelle RNase-aktivitet ytterligere. exoRNA ble isolert fra den vaskede EV brøkdel bruker RNeasy PLUS kit (Qiagen, MD) i henhold til produsentens instruksjoner, som benytter en DNA spin kolonne for fjerning av genomisk DNA (gDNA) fra prøven.
Tissue behandling
Pasienter med radikal prostatektomi urinen ble valgt tilfeldig for å undersøke samsvar mellom TMPRSS2: ERG deteksjon i urin og påvisning i vev. RP vev ble valgt slik at en grundig analyse av multiple brennpunkter tumor og normalt vev regioner kunne analyseres. Formalinfiksert parafin innebygd (FFPE) vev fra svulsten foci og normal prostata områder ble delt på fem mikrometer og plassert på glassplater. Totalt 4-6 lysbilder fra hver tumor fokus eller normal område ble samlet og nukleinsyrer ble isolert ved anvendelse av vev settet QIAamp DNA FFPE (Qiagen, CA) ifølge produsentens instruksjoner. I korte trekk, ble vevssnitt skrapet inn i et Eppendorf-rør i et RNase fritt miljø. For å dewax vevssnitt, ble 1,5 ml Histologi Grade Xylen (VWR International, PA) i tillegg til seksjonene, rør var kort vortex-blandet og sentrifugert ved 20.000 x g i to minutter ved romtemperatur. Supernatanten ble fjernet med pipette. Prøvene ble virvlet og tilsvarende spunnet etter tilsetning av 1,5 ml, deretter 1 ml av 100% etanol (elektronmikroskopi Sciences, PA). Pelletene ble fullstendig tørket ved inkubering uavdekkede rør ved 37 ° C i 20 minutter. 180 ul Buffer ALT ble tilsatt direkte til pelletene, som ble fullstendig homogenisert ved anvendelse av en vev-brudd-enhet. 20 ul proteinase K ble tilsatt og blandet med prøvene, som deretter ble inkubert i 1 time ved 56 ° C, deretter 1 time ved 90 ° C. Rørene ble kort spunnet og prøvene ble overført til QIAamp MinElute kolonner i 2 ml samling rør. Etter 1 minutt til 6000 x g sentrifugering, strømningen gjennom ble kassert og kolonnene ble overført til friske rør. Kolonnene ble sentrifugert to ganger ved 6000 x g i 1 minutt etter tilsetning av 500 ul AW1-buffer og 500 pl buffer AW2. For å fjerne all etanol, ble kolonner spunnet på 20 000 × g i 3 minutter. Nukleinsyrer ble eluert fra kolonnene i 35 ul buffer JAE, ble konsentrasjonen av disse målt ved hjelp av Nanodrop spektrofotometer i henhold til produsentens instruksjoner hvor buffer ATE (Qiagen, CA) ble anvendt som en blank.
PCR-analyse
RNA fra både vev og urinprøver gikk revers transkriptase reaksjon (RT) ved hjelp av VILO RT kit (Invitrogen, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Eksempel pre-forsterkning ble utført ved bruk av TaqMan
® PreAmp Master Mix Kit (Life Technologies, NY) i henhold til produsentens instruksjoner. Pre-forsterkede cDNA ble fortynnet 1:20 i TE buffer. PCR ble utført med 5 mL fortynnet, pre-forsterket cDNA for påvisning av TMPRSS2: ERG (Life Technologies, New York) (Hs03063375_ft, 106bp), KLK3 (PSA) (Hs03063374_m1, 64bp), ERG (Hs01554635_m1, 104bp), BIRC5 (Hs00153353_m1, 93bp) og PCA3 (Hs01371938_m1, 80bp), TMPRSS2 (Hs00237175_m1) på en StepOne Plus maskin (Applied Biosystems, CA). For exoRNA genekspresjon, ble gener av interesse normalisert til exoRNA KLK3 (C
t gen av interesse – C
t KLK3). For vev genuttrykk gener av interesse ble normalisert til GAPDH (C
t gen av interesse – C
t GAPDH).
Data Analysis
DataAssist program versjon 2.0 (Applied Biosystems, CA) ble anvendt for dataanalyse for å bestemme relativ kvantifisering (RQ) av genekspresjon og betydningen av uttrykket (
P
-verdi). Sammenligning av kliniske og pasientkarakteristika inkludert boksplott og ROC analyse ble utført ved hjelp av Stata IC 12,1 (StataCorp, College Station, TX).
Statistisk analyse
En t-test, enveis ANOVA og ROC-analyser ble anvendt for å teste for statistisk signifikans.
P
0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
For å bestemme nøyaktigheten som exoRNA isolert fra urin elbiler reflekterer prostata vev mRNA, analyserte vi TMPRSS2. ERG uttrykk i RP vev av 21 pasienter og sammenlignet det med matchende urinprøver tatt før RP. Radikal prostatektomi vev ble anvendt (i motsetning til vevsprøver), slik at en mer nøyaktig analyse kan være laget av TMPRSS2: ERG uttrykk gjennom prostata. En representativ illustrasjon av prostata områdene ekstrahert for analyse (en «tissue kart «) av prostatektomi vev, den patologiske status for hvert område (svulst eller godartet) og TMPRSS2: ERG status for hvert område ble ekstrahert vist i figur 1 demonstrerer stor mengde vev analysert (se figur S1 for den «tissue kart» over alle 21 pasienter). Isolering av mRNA fra FFPE vev ble bekreftet via analyse av qPCR amplikonene med og uten tidligere RT reaksjon (se S2 figur). I noen tilfeller TMPRSS2: Det ble ERG ekspresjon detektert i «godartede» tissue regioner. Dette kan være på grunn av tilstedeværelsen av mikro foci av tumoren i de etterfølgende seksjoner av vev ekstrahert for RNA-analyse under som opprinnelig analysert ved hjelp av patologen (se S3 figur), og kan forklare hvorfor noen «godartede» regioner uventet viste positiv TMPRSS2: ERG uttrykk . En pasient ble ansett TMPRSS2: ERG positivt hvis TMPRSS2: ERG ble påvist i noen av de delene av prostatektomi vev ved hjelp av RT-qPCR. Denne analysen ble sammenlignet med TMPRSS2: ERG-ekspresjon i urin el-biler som bruker den samme RT-qPCR reaksjon og rapportert i tabell 1. Analyse av deteksjon av TMPRSS2: ERG i vev sammenlignet med deteksjon i urin EV viste en meget god korrelasjon med en følsomhet av 81% (13/16), spesifisitet på 80% (4/5), PPV 93%, NPV 57% og en total nøyaktighet på 81% (17/21) (se tabell 2). For å finne ut hvorfor uttrykk i urin elbiler ikke alltid gjenspeiler vev uttrykk, vi sammenlignet de vev uttrykk nivåer (relativ kvantifisering (RQ)) av TMPRSS2: ERG for de pasienter med målbart urin EV TMPRSS2: ERG uttrykk versus pasienter med ikke-målbar urin EV TMPRSS2 : ERG uttrykk. Selv om begrenset i utvalgsstørrelsen med bare tre TMPRSS2: ERG positiv vevsprøver være TMPRSS2: ERG negativ i urin exoRNA, mot 13 som hadde eksakt sammenheng med positive uttrykk i både vev og urin elbiler, data viste at TMPRSS2: ERG uttrykk i tumorvev var ~ 98 ganger høyere (
P
= 0,009) hos pasienter med målbart urin exoRNA TMPRSS2: ERG uttrykk. I et annet tilfelle, TMPRSS2:. ERG ble påvist i urin exoRNA men var ikke påvises i den begrensede vev tilgjengelig for analyse (se tabell 1, pasient 10)
Representative tegneserie som viser utvalget av godartet (blå) og kreft (rosa) regioner fra en radikal prostatektomi. Svulsten og godartede regioner ble undersøkt for TMPRSS2: ERG mRNA uttrykk (Red «+» indikerer positiv TMPRSS2: ERG uttrykk, Blue «-« indikerer ingen TMPRSS2: ERG uttrykk). T: E-TMPRSS2. ERG, A-anterior, P-posterior, L-venstre, R-høyre
For ytterligere å undersøke bruken av elbiler til å oppdage TMPRSS2: ERG uttrykk, tilfeldige urinprøver ble samlet inn fra 207 menn delt i 5 grupper: Transrektal ultralyd (TRUS) prostatabiopsi negative (Bx Neg, n = 39), TRUS biopsi positive (Bx Pos, n = 47), post-radikal prostatektomi ( post-RP, n = 37), alder matchet menn som ikke gjennomgår biopsi (No Bx, n = 44) og kontroller (menn under 35 år, Cont, n = 40). Pasientegenskaper er angitt i tabell 3. Det var ingen forskjell i gjennomsnittlig alder med unntak av kontroll hanner (
P
0,05). Serum PSA ble bare betydelig redusert i etter RP gruppe (
P
0,001) i samsvar med prostata fjerning
Forekomsten av TMPRSS2: ERG uttrykk (Fig 2a) var. høyeste i Bx Pos gruppen med 66% uttrykker TMPRSS2: ERG samsvar med tidligere funn [12-14]. Interessant, ble 44% av Bx Neg pasienter funnet å uttrykke TMPRSS2: ERG. Post-RP pasientene hadde ingen TMPRSS2: ERG uttrykk i samsvar med prostata-spesifikke ekspresjon av genet, som går tapt ved fjerning prostata [12]. Kun 5% av kontroll menn ( 35 år gamle) uttrykte TMPRSS2: ERG i motsetning til 41% i «alderstilpassede «Ingen Bx kontroller (menn i samme aldersgruppe til Bx Pos og Bx Neg grupper, men som ikke har en indikasjon for prostata biopsi). Vi videre undersøkt nivået av TMPRSS2: ERG uttrykk ved RQ av TMPRSS2: ERG tvers av grupper (Fig 2b). TMPRSS2: ERG uttrykk var høyest i Bx Pos gruppe (
P
= 0,013) i samsvar med bekreftet tilstedeværelse av kreft (se S4 figur for boksplott distribusjon av deltaet C
t). Vi har også fulgt urin TMPRSS2: ERG påvisning hos pasienter før og etter-RP, når det er tilgjengelig. Selv om begrenset i utvalgsstørrelsen, alle 3 pasienter som var exoRNA TMPRSS2: ERG positiv før RP ble funnet å ha noen exoRNA TMPRSS2: ERG uttrykk post-RP, noe som tyder på at TMPRSS2: ERG oppdaget i disse urin elbiler var faktisk prostata-spesifikt.
a) Valuta TMPRSS2: ERG påvisning i urin elbiler. Fôret barer-TMPRSS2: ERG positive, solid barer-no TMPRSS2: ERG uttrykk. Prosent viser til TMPRSS2: ERG-positive pasienter. b) Relativ kvantifisering (RQ) av TMPRSS2: ERG uttrykk versus Bx Neg pasienter. TMPRSS2: ERG uttrykk ble standardisert til KLK3 samsvar med andre prostata biomarkør studier [20]. Bx Neg-biopsi negative (n = 39), Bx Pos-biopsi positive (n = 47), Cont-kontroll hanner 35 år (n = 40), No Bx-no biopsi (alder matchet kontrollgruppe) (n = 44), RP-radikal prostatektomi (n = 37). Data presentert som RQ ± SEM.
For å finne ut om urin elbiler kan brukes til å undersøke andre gener assosiert med prostatakreft vi undersøkte differensial uttrykk for androgen reseptor (AR), BIRC5, ERG, PCA3, TMPRSS2: ERG og TMPRSS2 i Bx Pos versus Bx Neg pasienter (fig 3a). Analyse av RQ viste at alle genene unntatt AR ble betydelig økt i Bx Pos pasienter versus Bx Neg pasienter (se S5 figur for boksplott distribusjon av deltaet C
t). Analyse av sammenhengen mellom ERG og TMPRSS2: ERG uttrykket (fig 3b) viste at det var en sterk trend mellom de to genene (R «sup> 2 = 0,826) var i overensstemmelse med urin celle og data vev tyder på at den vanligste fusjon (TMPRSS2 (ekson 1) med ERG (ekson 4)), kan gi opphav til øket ekspresjon ERG [12,18]. Denne trenden var ikke tydelig når TMPRSS2: ERG uttrykk ble korrelert med PCA3 uttrykk (R
2 = 0,110) (fig 3c). ROC-analyser ble også utført for å bestemme evnen til disse gener for å diskriminere biopsi status (figur 4). Resultatene bekreftet at BIRC5, ERG, PCA3, TMPRSS2: ERG og TMPRSS2 var i stand til å skille Bx Pos fra Bx Neg pasienter (Tabell 4)
a) Relativ kvantifisering (RQ) av genuttrykk for å finne ut om noen gener. er betydelig høyere uttrykt i Bx Pos pasienter. AR (Bx Neg n = 38, Bx Pos n = 47), BIRC5 (Bx Neg n = 39, Bx Pos n = 45), ERG (Bx Neg n = 33, Bx Pos n = 41), PCA3 (Bx Neg n = 38, Bx Pos n = 46), TMPRSS2: ERG (Bx Neg n = 17, Bx Pos n = 31) og TMPRSS2 (Bx Neg n = 39, Bx Pos n = 45). Alle gener unntatt AR ble funnet å ha betydelig høyere ekspresjon sammenlignet med Bx Neg pasienter. Solid barer-Bx Neg, foret barer-Bx Pos. Data presentert som RQ ± SEM. b) Sammenhengen mellom uttrykket av TMPRSS2: ERG og ERG ble fastsatt ved hjelp delta Ct mot KLK3 i Bx Pos (svart) og Bx Neg (grå) pasienter. c) Sammenheng mellom uttrykket av TMPRSS2: ERG og PCA3 ble fastsatt ved hjelp delta C
t mot KLK3 i Bx Pos (svart) og Bx Neg (grå) pasienter. deltaet C
t = C
t gen av interesse – C
t KLK3
Individuell ROC kurver for AR, BIRC5, ERG, PCA3, TMPRSS2. ERG og TMPRSS2. T: E-TMPRSS2: ERG. AR (Bx Neg n = 38, Bx Pos n = 47), BIRC5 (Bx Neg n = 39, Bx Pos n = 45), ERG (Bx Neg n = 33, Bx Pos n = 41), PCA3 (Bx Neg n = 38, Bx Pos n = 46), TMPRSS2: ERG (Bx Neg n = 17, Bx Pos n = 31) og TMPRSS2 (Bx Neg n = 39, Bx Pos n = 45)
Diskusjoner
Analyse av RNA i urinen har viktige implikasjoner for utviklingen av ikke-invasive tester som undersøker differensial genuttrykk og mutasjonsdeteksjon. Til tross for den enorme muligheter som ikke-invasiv analyse av en underliggende sykdom kan ha i førings en lege, en viktig begrensning for bruken av biofluids er hvorvidt de gjenspeile gene expression forandringer i den overordnede vev. Vår analyse har benyttet urin EV exoRNA å avgjøre om det er: 1) reflekterende av vev genuttrykk, og 2) i stand til å skille BxPos fra BxNeg pasienter ikke-invasiv. På grunn av den ~ 25% iboende falsk negativ rate på TRUS styrt prostatabiopsi i å oppdage kreft og den begrensede mengden vev kartlagt under biopsi, valgte vi å utnytte pasienter som skal gjennomgå RP for å sammenligne samsvar mellom TMPRSS2: ERG mRNA deteksjon i vev versus i urin elbiler. TMPRSS: ERG-påvisning ble valgt spesielt for å bestemme denne korrelasjonen på grunn av dens kjente spesifisitet til prostatavevet. Urin exoRNA analysen var i stand til å detektere en ikke-invasiv vev ekspresjon av TMPRSS2: ERG mRNA med meget god nøyaktighet, og en generell overensstemmelse på 80%. I noen tilfeller TMPRSS2: Det ble ERG ekspresjon detektert i «godartede» tissue regioner. Dette kan være på grunn av tilstedeværelsen av mikro foci av tumoren i de etterfølgende seksjoner av vev ekstrahert for RNA-analyse under som opprinnelig analysert ved hjelp av patologen (se fig S3). Dette er en iboende problem med denne typen RP vev analyse, men kan forklare hvorfor noen «snille» regioner uventet viste positiv TMPRSS2. ERG uttrykk
Tre av de 21 pasientene hadde påvisbare TMPRSS2: ERG uttrykk i vev, men undetectable TMPRSS2: ERG i urin elbiler. Ved videre analyse av disse data, kan det bli foreslått at lav-nivå ekspresjon i vev ikke kan påvises i el-biler og kan betraktes som en potensiell begrensning. Men dette bør vurderes med forsiktighet, da var det bare tre slike prøver tilgjengelig for analyse og en større studie må være gjennomført for å støtte denne konklusjonen
I ett tilfelle TMPRSS2. ERG ble påvist i urin EV men var fraværende i vevet er tilgjengelig for analyse. Siden hele montering prostata seksjoner var ikke tilgjengelig for total kjertel analyse, er det mulig at pasienten kan ha hatt en TMPRSS2: ERG positivt fokus i en vev region utilgjengelig for analyse. Dette understreker den potensielle fordelen av urin elbiler som de kan reflektere en større andel av prostata volum enn hva som er oppnåelig via andre prøvetaking metoder som biopsi.
Muligheten til å bruke tilfeldige urinprøver (samlet uten prostata massasje) tillatt oss å analysere et bredt spekter av emner, inkludert unge, friske menn ( 35 år) som indikerte, som forventet, at svært få hadde påvisbare TMPRSS2: ERG nivåer (5% (2/40)). Dette var i motsetning til eldre menn i Bx Pos (66%), Bx Neg (44%) og No Bx (41%) pasientgrupper. Dette tyder på at sannsynligheten for en TMPRSS2: ERG fusjon hendelse kan øke over tid at forekomsten av prostatakreft øker (dvs. med alder), i samsvar med tidligere rapporter også med alderen [27]. Vår oppklaringsprosenten av TMPRSS2: ERG via exoRNA i Bx Pos pasienter, var på toppen av området for at tidligere rapportert for TMPRSS2: ERG deteksjon via urin celle analyse i prostatakreft positive pasienter som varierte 37-69% (22/32 (69%) [28], 10/15 (67%) [26], 8/19 (42%) [21], 56/138 (41%) [22], 29/78 (37%) [25 ], 9/13 (69%) [29]) med deteksjon priser så lavt som 10/42 (24%) når ingen prostata massasje ble utført før urinsamlingen [29] og 46/196 (24%) når en TMPRSS2 : ERG deteksjon cut-off av 10 kopier ble påført [30]. Hos pasienter uten prostatakreft (bestemme via negativ biopsi), påvisning av TMPRSS2: ERG via urin celle analyse var lavere enn vår oppklaringsprosenten via EV analyse og varierte 7-21% (2/30 (7%) [25], 4/30 (13%) [26], 4/24 (17%) [28], 20/96 (21%) [22], og så lav som 6% uten forutgående prostata massasje, 15/247 (6%) [29] Selv om det var et stort antall Bx Neg og No Bx pasienter med en påviselig TMPRSS2. ERG fusjon hendelse i vår nåværende studie, TMPRSS2: ERG uttrykk nivå (analysert via RQ) var høyest i Bx Pos gruppen i samsvar med . bekreftet tilstedeværelsen av kreft Low-level uttrykk i Bx Neg og No Bx grupper kan representere falske RNA transkripsjoner snarere enn forurensning, så det var et fullstendig fravær av TMPRSS2: ERG exoRNA (0% (0/40)) i 40 post- radikal prostatektomi pasienter testet. bruken av et uttrykk cut-off, slik som den som anvendes ved Leyten et al, [30] kan gjøre det mulig for differensiering mellom lav-nivå falsk genekspresjon (slik som den som er sett i Bx Neg og alderstilpassede ingen Bx pasienter) og stabil genekspresjon observert i Bx Pos pasienter. Man kan bare spekulere i hvorfor EV analyse oppdager mer positiv TMPRSS2: ERG uttrykke pasienter enn analyse av urin celler spesielt i No Bx og Bx Neg grupper. Et forslag kan være fordi EV representerer en større undersøkelse av prostata som de er konstitutivt utgitt av potensielt alle celler. Dette er i motsetning til analysen av prostata avledet urin celler som er slått over til en mye lavere hastighet. Dermed kan gi analysen av elbiler i Bx Neg (og Nei Bx) grupper større mulighet til å oppdage falske TMPRSS2: ERG leser i forhold til urin prostata celle analyse
ERG genuttrykk nivåer ble også undersøkt for å finne ut om. en sammenheng mellom exoRNA uttrykk for TMPRSS2: ERG og ERG var tydelig. Urin EV resultatene sterkt støttet tidligere rapporter som økte ERG uttrykk kan være assosiert med TMPRSS2: ERG fusjon event [12,18,31]. Analyse av ERG uttrykk ble funnet å prestere bedre enn analysen av TMPRSS2: ERG uttrykk i differensiere Bx Pos fra Bx Neg pasienter. Dette kan være fordi TMPRSS2: ERG oppdaget av vår analyse kan utgjøre bare en brøkdel av ERG relatert fusjonsbegivenheter [18]. Dermed kan vår analyse av ERG uttrykk alene potensielt plukke opp flere ERG fusjonsbegivenheter utover oppdaget av vår TMPRSS2: ERG analysen gjør ERG alene en mer sensitiv markør i vår studie
For å undersøke bruken av elbiler som en plattform. til ikke-invasiv skille Bx Pos og Bx Neg pasienter uten prostata massasje, analyserte vi muligheten for andre gener tidligere innblandet i prostatakreft å skille Bx Pos og Bx Neg pasienter ved hjelp av urin EV-plattformen. Relativ kvantifisering analyse viste at exoRNA for BIRC5, ERG, PCA3 og TMPRSS2: ERG standardisert til KLK3, differensiert Bx Pos fra Bx Neg pasienter. AR ekspresjon var ute av stand til å skille disse gruppene. Denne trenden ble avspeilet i ROC analyse av disse genene. Det er vanskelig å postulere hvorfor dokumenterte endringer i AR uttrykk i kreft ikke ble gjenspeilet i vår exoRNA studie bortsett fra at kanskje AR uttrykk er ikke regulert på mRNA-nivå, men heller på proteinnivå.
Denne pilotstudien viser potensielle nytten av exoRNA å undersøke prostata-relaterte genekspresjon isolert fra et enkelt, tilfeldig urinprøve. Nærmere bestemt har EV analyse en ~ 80% nøyaktighet for påvisning av TMPRSS2: ERG mutasjon, forutsatt at ingen falske negativer i radikal prostatektomi prøver, og er påvirket av nivået av genekspresjon i vev. Evnen til å skille Bx Bx fra Pos Neg pasienter ved anvendelse av en ikke-invasiv urinprøve uten bruk av en prostata massasje ble også demonstrert, og støtter den fremtidige utviklingen av et potensielt EV basert urin diagnostisk test for prostatakreft. Større kohorter er nå nødvendig for å bekrefte disse studiene. Til slutt, på grunn av den allestedsnærværende frigjøring av el-biler fra celler, er det mulig at urin EV kan bli en ny, ikke-invasiv plattform for å undersøke andre organer i urogenitalsystem, inkludert nyre og urinblæren.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 fig. Cartoon av prostatavevet §§ Tatt for komparativ analyse av TMPRSS2. ERG genuttrykk i vev Versus Urin exoRNA
Tegneserier viser godartet (blå) og kreft (rosa) regioner fra en radikal prostatektomi som ble valgt for RNA-ekstraksjon og analyse av genuttrykk . Tumor og godartede regioner positive for TMPRSS2: ERG uttrykk er merket med en rød «+». Negativ TMPRSS2: ERG uttrykk merkes med en blå «-«. Purple «+» brukes for å indikere positive TMPRSS2: ERG uttrykk i en samlet prøve av vev. T: E-TMPRSS2: ERG, A-anterior, P-posterior, L-venstre, R-rett. «Nivå» angir området av prostata undersøkt for genekspresjonsanalyse (urinrøret til sædblærene)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0154507.s001 plakater (TIFF)
S2 Fig. Påvisning av mRNA transkripsjoner i FFPE Tissue.
Agilent Bioanalyzer DNA chip analyse av amplikonene generert via PCR på ingen mal kontroll (NTC) og prøver med revers transkriptase reaksjon (RT) og uten revers transkriptase (No RT) reaksjon. The «No RT «prøver ikke klarte å generere amplikonene konsistente med RNA spesifikke primere og probe for hvert gen. Prøvene som gjennomgår RT reaksjon genereres amplikonene av tilsvarende størrelse til det ABI rapporterte fragment størrelse. NTC ikke klarte å generere amplikonene tyder ingen forurensning.
