Abstract
Mål
aldehyd dehydrogenase (ALDH) uttrykker cellene har vært karakterisert som besitter stamcellelignende egenskaper. Vi evaluerte ALDH + eggstokkreft stamcellelignende egenskaper og deres rolle i platina motstand.
Metoder
isogene eggstokkreft cellelinjer for platina følsomhet (A2780) og platina resistente (A2780 /CP70) som vel som ascites fra ovarian cancer pasienter ble analysert for ALDH + ved strømningscytometri for å bestemme sin tilknytning til platinamotstands, gjentakelse og overlevelse. En stabil shRNA knockdown modell for ALDH1A1 ble benyttet for å bestemme dens effekt på kreft stamcellelignende egenskaper, cellesyklus sjekkpunkter, og DNA-reparasjon meklere.
Resultater
ALDH status direkte korrelert til platina motstand i primær eggstokkreft prøver hentet fra ascites. Pasienter med ALDH
HIGH vises betydelig lavere progresjonsfri overlevelse enn pasienter med ALDH
Lav celler (9 vs 3 måneder, henholdsvis p 0,01). ALDH1A1-knockdown betydelig svekket klonogene potensial, PARP-1 protein nivåer, og reversert iboende platina motstand. ALDH1A1-knockdown resulterte i dramatisk nedgang på KLF4 og p21 protein nivå og dermed fører til S og G2 fase opphopning av celler. Økning i S og G2 celler demonstrert økt uttrykk av replikering stress forbundet Fanconi Anemi DNA-reparasjon proteiner (FANCD2, FANCJ) og replikering sjekkpunkt (pS317 Chk1) ble berørt. ALDH1A1-knockdown indusert DNA skade, dokumentert av robust induksjon av γ-H2AX og BAX mediert apoptose, med betydelige økninger i BRCA1 uttrykk, noe som tyder ALDH1A1 avhengig regulering av cellesyklus sjekkpunkter og DNA reparasjon nettverk i eggstokkreft stilk-lignende celler.
Konklusjon
Disse dataene tyder på at eggstokkreft celler uttrykker ALDH1A1 kan opprettholde platina motstand ved endret regulering av cellesyklus sjekkpunkt og DNA-reparasjon nettverk signale
Citation. Meng E, Mitra A , Tripathi K, Finan MA, Scalici J, McClellan S, et al. (2014) ALDH1A1 Opprettholder Ovarian Cancer Stem Cell-lignende egenskaper ved Endret regulering av cellesyklusen Checkpoint og DNA Repair Network Signa. PLoS ONE ni (9): e107142. doi: 10,1371 /journal.pone.0107142
Redaktør: Robertus AM. de Bruin, University College London, Storbritannia
mottatt: May 13, 2014; Godkjent: 07.08.2014; Publisert: 12.09.2014
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Data Tilgjengelighet:. Forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Gynekologisk kreft Foundation Sherri er fra en Whisper til Roar, kvinner Motorsykkel Foundation Ovarian Cancer Research Award og The Eleanor Ruth Frenkel Fond for Ovarian Cancer Research (RPR); NIH stipend R01GM098956, og Abraham Mitchell legat stipend (K.P.). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den mest dødelige av alle gynekologiske kreftformer, som påvirker over 22.000 livene til kvinner årlig i USA alene. Selv om de fleste ovarian kreftpasienter oppnå en fullstendig innledende klinisk respons på cytoreduserende kirurgi etterfulgt av kjemoterapi, vil de fleste oppleve en gjentakelse og dessverre bukke under for progressiv sykdom [1]. Vital til prognosen for eggstokkreft pasienter er sykdommen varierende følsomhet for platinaderivater. Selv om et kontinuum, blir pasientene stratifisert etter sykdommen sin opprinnelige respons til platina kjemoterapi som enten «platinum-sensitive» eller «platinum-resistent» definert av lengden på tilbakefall fritt intervall. Dette spekteret er svært intelligent av kliniske endepunkter av når en kreft oppstår på nytt, suksessen av kirurgi og /eller kjemoterapi ved tilbakefall og pasientens total overlevelse.
Med tanke på heterogenitet av kreft, ikke alle celler i en malignitet ville kan forventes å være resistente overfor kjemoterapi. Den kreftstamceller (cscs) teori foreslår at disse resistente celler omfatte bare et mindretall av celler i en kreft, men er selv ansvarlig for langsiktig tilbakefall [2]. Dermed uavhengig av de første svarprosenter, dersom kjemoterapi ikke klarer å utrydde disse resistente cscs, da kreft vil fornye og et tilbakefall eller progresjon av sykdommen vil oppstå. Identifiseringen av disse resistente celler og bestemme deres medfødte molekylære stier er avgjørende i å finne mer effektive målrettet terapi [3]. Derfor er en strategi for å forbedre suksessen av eggstokkreft terapi er å forbedre cscs følsomhet for platinaderivater. Overvinne platina motstand ville være avgjørende i behandling av eggstokkreft med de potensielle fordelene ved forbedret responsrate, lengre overlevelse, og flere kurer.
Nylig aldehyd dehydrogenase (ALDH) aktivitet har vist seg å være en svært attraktiv cscs markør i mange kreftformer som for eksempel lunge [4], bryst [5], prostata [6], skjoldbrusk [7], hode og nakke kreft [8], og eggstokkreft [9] – [12]. ALDH familie består cytosolic isoenzymer som er ansvarlige for oksiderende intracellulære aldehyder, og dermed bidra til oksidasjon av retinol til retinsyre tidlig i stamcelleforskningen differensiering [4]. Den menneskelige ALDH super består i dag av 19 kjente putatively funksjonelle gener i 11 familier og 4 underfamilier med forskjellige kromosom steder. Av de store ALDH familier og underfamilier, har ALDH1A1 vært en gyldig markør blant flere ondartede vev. Det holder attraktive æren av å ikke bare være en potensiell markør for stemness men potensielt spille en rolle i biologi tumor-initiering celler samt [13]. I tillegg er det ALDH1A1 subpopulasjon hadde vist å være forbundet med chemoresistance i eggstokkkreftpasienter [9], [14].
Nylige studier hos brystkreftmodeller vist en interessant sammenheng mellom BRCA1 og stamcelledifferensiering [15], [16]. BRCA1 har også vist seg å spille en viktig rolle i brystvev differensiering ved å regulere Notch signalering og tumorrespons til anti endokrin terapi [14]. Spesielt, er en invers sammenheng mellom ALDH1A1 ekspresjon og BRCA1 bemerkelsesverdig i sammenheng med å studere kreft stilk-lignende celler og chemoresistance. BRCA1 spiller viktige roller i å beskytte genomet fra avvikende DNA-lesjoner, og mutasjoner eller sletting i dette genet fører til genom instabilitet og økt forekomst av brystkreft, eggstokkreft og andre kreftformer [17]. Som svar på DNA-skade det raskt lokaliserer til nettstedene til dobbelttrådbrudd (DSB) og formidler flere signalresponser inkludert cellesyklus sjekkpunkter og valg av DNA reparasjon vei for å løse disse lesjonene [17] – [19]. Imidlertid har BRCA1 status og ALDH + eggstokkreft stilk-lignende celler vedlikehold og deres resistens mot kjemoterapi ikke blitt undersøkt.
Vi viser at ALDH + fenotypen besitter CSC egenskapene til forbedret invasjon, kolonidannelsen, og stamcelle markører. Den spesifikke ALDH1A1 isotype ser ut til å være ansvarlig for ALDH-mediert platina motstand både klinisk og
i in-vitro
modeller. Våre data støtter en ALDH1A1-mediert platinamotstandsmekanismen i eggstokkreft via en endret regulering av cellesyklus sjekkpunkt og DNA-reparasjon nettverk signalering.
Materialer og metoder
Cellelinjer og kulturer
A2780 og en isogen cisplatin motstandsdyktig A2780 /CP70 cellelinjen ble generert som beskrevet tidligere [20].
ALDEFLUOR analysen og fluorescens-aktivert Cell Sorting
For å isolere cellepopulasjonen med en høy ALDH enzymatisk aktivitet, ALDEFLUOR analysesett (STEMCELL Technologies Inc.) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. Etter trypsinering ble cellene suspendert i ALDEFLUOR analysebuffer inneholdende ALDH enzymsubstrat BODIPY-aminoacetaldehyd (BAAA), og inkubert ved 37 ° C i ca 40 minutter. Celler ble farget ved bruk av identiske betingelser med den spesifikke ALDH-inhibitor, diethylaminobenzaldehyde (DEAB), for å tjene som en negativ kontroll. Flowcytometri sortering ble utført med en BD Biovitenskap Aria II Sorp celle sorter.
Kreftfremkallende egenskaper
Etter sortering for ALDH fenotyper (ALDH + vs. ALDH-), Matrigel invasjonen og myke agar kolonidannelse analyser ble utført som tidligere beskrevet [21]. For å evaluere effekten av kjemoterapi på kolonidannelse, ble cellene behandlet med friskt medium med 20 uM karboplatin tilsatt hver 3-4 dager. Synlige kolonier ( 50 celler). Ble regnet med fem tilfeldig utvalgte 40X mikroskopiske felt i hver brønn
CellTiter-Glo Lysende celleviabilitet analysen
Ordnet A2780 /CP70 celler ble sådd ut i tettheten av 4000 celler per brønn i 96-brønners sort plate med klar bunn (Corning, NY, USA). Den følgende dag ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av karboplatin opp til 72 timer. Etter 24, 48 og 72 timer, ble 100 ul CellTiter-Glo reagens (Promega) per brønn tilsatt, inkubert i 10 minutter ved romtemperatur og luminescens ble spilt inn på en Synergy H4 Hybrid Reader (BioTek).
sann~~POS=TRUNC tids~~POS=HEADCOMP kvantitativ RT-PCR
sanntids~~POS=TRUNC Kvantitativ RT-PCR ble utført som beskrevet tidligere [21]. Primere og prober for TaqMan systemet ble valgt ut fra nettsiden Applied Biosystems [BMI1 analysen ID: Hs00180411_m1, c-myc analysen ID: Hs00905030_m1, Kruppel-lignende faktor 4 (KLF4) assay ID: Hs00358836_m1, oct3 /4-analysen ID: Hs01009568_m1, S100 kalsiumbindende protein A1 (S100A1) assay ID: Hs00984741_m1, ALDH1A1 assay-ID: Hs00946916_m1, CDKN1A (p21) assay ID: Hs00355782_m1, intern kontroll glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase assay-ID: Hs99999905_m1]. De relative uttrykk mRNA nivåer av BMI1, c-myc, Oct3 /4, KLF4, S100A1, ALDH1A1, p21, ble beregnet ved hjelp av ΔΔCt metode og normalisering til GAPDH.
Lentiviral shRNA Vector Transfeksjon
Seks forskjellige pGIPZ Lentiviral shRNA glyserol aksjer mot ALDH1A1 og en negativ kontroll shRNA (Thermo Scientific) ble transfektert i henhold til produsentens instruksjoner. A2780 /CP70-celler ble sådd ut ved en tetthet på 2 x 10
5 celler per brønn i en 6-brønns plate i 18-24 timer. For hver brønn, 2 mikrogram shRNA plasmid DNA (pGIPZ) ble transfektert inn A2780 /CP70 hjelp Arrest-In reagens (Thermo Scientific, USA). Puromycin (0,8 ug /ml) ble brukt for å velge de transfekterte cellene. Etter optimalisering, ble ALDH1A1-knockdown effektiviteten av individuelle shRNAs evaluert med real-time kvantitativ PCR og Western Blot. Vektor 398453 demonstrerte det mest effektive transfeksjon med over 95% knockdown effekt av ALDH1A1 og ble benyttet for alle eksperimentene shRNA knockdown.
Western Blot analyse
Dyrkede celler ble oppsamlet i NP-40 lyseringsbuffer med 10 ul /ml protease inhibitor cocktail (Sigma) og underkastet immunblotting analyse ved standardteknikker ved anvendelse av antistoffer mot ALDH1A1, FANCJ, KLF4 (Sigma-Aldrich), FANCD2, PARP-1, XRCC1, β-actin, GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), og p21, fosfo-Chk1 (Ser317), BRCA1 antistoffer (Cell Signaling Technology)
RT
2 Profiler PCR Array
Den menneskelige Cancer Drug Resistance Cellesyklus RT
2 Profiler PCR Array (Qiagen, USA) ble brukt til å profilere uttrykk av 84 gener som er involvert i kreftlegemiddelresistens og cellesyklus med fem housekeeping gener per produsentens instruksjoner. Kontroller for genomisk DNA-kontaminering og for effektiviteten av RT-PCR og PCR reaksjoner ble også analysert. PCR-matriser ble kjørt ved hjelp av en Bio-Rad iQ5 sporing i sanntid system (Bio-Rad).
Cell Cycle Analysis ved flowcytometri
A2780 /CP70 celler ble transfektert med kontroll eller shRNAs målretting for å ALDH1A1 hjelp Lipofectamine 2000 (Life Technologies) og cellene ble samlet og farget for cellesyklus analyse i henhold til produsentens instruksjoner (BD Biosciences). Cellene ved 10
6 ble gjen suspendert med 300 mL PBS, og 700 mL iskald metanol for å fikse cellene for overnatting ved -20 ° C. Cellene ble vasket to ganger med PBS, og deretter farget med 500 mL propidium jodid (BD Bioscience) ved romtemperatur i 30 minutter i mørket. Cellesyklus profiler ble analysert ved flowcytometri.
apoptose analysen
A2780 /CP70 celler transfektert med negativ kontroll eller shRNA-ALDH1A1 ble indusert for apoptose ved å behandle med 1,0 mikrometer staurosporin i 6 timer [22 ], [23]. APC-Annexin V og 7-AAD farging ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Hver gruppe inneholder tre isotype kontroller: ufargede celler; celler farget med APC Annexin V alene; -celler farget med 7-AAD alene. Prøvene ble analysert ved strømningscytometri.
PARP Activity Assay
PARP-aktivitet ble målt ved bruk av HT PARP in vivo farmakodynamisk Assay kit II (Trevigen). Etter behandling med 100 uM karboplatin i 45 minutter, ble A2780 /CP70 celler transfektert med negativ kontroll eller shRNA-ALDH1A1 vasket to ganger med 5 ml varm (37 ° C) PBS. Cellene ble skrapt inn i 300 ul kald cellelyseringsbuffer og inkubert på is i 15 minutter. SDS ble tilsatt til prøvene til en sluttkonsentrasjon på SDS 1% og inkubert ved 100 ° C i 5 minutter. Når prøvene avkjølt til romtemperatur ble 0,01 volum på 100X Magnesium kation og 2 ul av DNase I (2 enheter /pl) tilsatt til prøvene og inkubert i ytterligere 90 minutter ved 37 ° C. Etter en kort sentrifugering ble supernatanten samlet og polyADP-ribose (PAR) nivåer i celleekstrakter ble kvantifisert ved hjelp av ELISA-metoden.
Klinisk korrelasjon
Alle deltakerne ga sin skriftlig informert samtykke til å delta i denne studien, og Institutional Review board ved University of South Alabama Health System godkjent denne studien, samt samtykke prosedyre. Ascites fra 15 sammenhengende pasienter som gjennomgår kirurgi for avansert stadium IIIC /IV papillær serøs eggstokkreft samt 2 pasienter med godartet ascites ble samlet inn og ble umiddelbart behandlet for å utføre ALDEFLUOR analysen etter vask dem med PBS og fjerne erytrocytter ved hjelp av ACK lysebuffer (Lonza , Walkers, MD, USA). Clinicopathologic data ble samlet inn for de respektive pasienter og korrelert til prosentandelen av celler utstilt ALDH + fenotype i sine ascites.
Statistical Analysis
Sammenligninger mellom to grupper ble utført ved hjelp av t-test og ANOVA hvor passende. Statistisk signifikans ble bestemt på
p
0,05. Kaplan-Meier kurve ble utført for å overleve med log-rank for statistisk sammenligning.
Resultater
ALDH status korrelerer med eggstokkreft motstand mot platinaderivater
isogene cellelinjer av platina sensitive (A2780) og resistente (A2780 /CP70) eggstokkreft celler ble evaluert for deres overlevelse i nærvær og fravær av ulike doser av karboplatin. I samsvar med den tidligere rapporterte resultater [24], [25], A2780 /CP70 celler som kreves opp til en 10-ganger høyere dose av karboplatin for å oppnå den IC
50-konsentrasjon i forhold til sin platina følsom motpart, A2780 (figur 1A) . Nylig har i flere cancermodeller, ALDH status har vært implisert i tumorresistens overfor kjemoterapi ved å opprettholde kreft stammelignende cellenes egenskaper som aggressiv vekst, økt overlevelse og re-differensiering potensiell [9]. For å teste korrelasjonen mellom ALDH status og platinamotstands i eggstokkreft celler, ble ALDEFLOUR analyser utført på følgende isogene celler. Interessant platinaresistent kreft i eggstokkene cellelinje A2780 /CP70 oppviste minst 110 ganger høyere prosentandel av ALDH + -celler (med et område på 22-40%) sammenlignet med platina sensitive A2780-celler, som hadde bare 0,2% ALDH + celler (figur 1B) . Likeledes, western blot analyse av ALDH1A1 proteinnivåer i disse cellene viste lignende resultater, noe som tyder sammenslutning av ALDH status med platina motstand (figur 1C)
isogene cellelinjer (A2780- platina sensitiv . A2780 /CP70- platina resistent) ble evaluert med hensyn på platina respons ved bruk av medikamentsensitivitet-analyse som beskrevet i M 2) (Figur 2A). Viktigst, prosent av ALDH + celler i pasienten ascites omvendt korrelert til progresjonsfri overlevelse. Pasienter som viste ALDH
HIGH ( 15% ALDH) i sine ascites viste signifikant lavere progresjonsfri overlevelse sammenlignet med pasienter med ALDH
LOW ( 15% ALDH) (3 vs. 9 måneder, henholdsvis;
p
= 0,003) (figur 2B). Selv om det er vanskelig å trekke en meningsfull avslutning på grunn av begrenset antall ascites brukt i denne studien, indikerer disse dataene direkte klinisk sammenheng mellom ALDH status med tumor respons til platina agenter og progresjonsfri overlevelse av eggstokkreft pasienter.
Ascites fra 15 sammenhengende pasienter med primær avansert stadium III /IV eggstokkkreft og 2 fra godartet (Miegs syndrom) ble innhentet og analysert for prosentandel av ALDH + celler gjennom ALDEFLUOR analysen. Histogrammet i innfelt viser prosent av ALDH + celler i godartede og ondartede ascites (A). Den clinicopathologic informasjon fra ovarian kreftpasienter var korrelert med prosent av ALDH + celler i sine ascites og evaluert progresjonsfri overlevelse med ALDH
HIGH ( 15% ALDH) til ALDH
LOW ( 15% ALDH) pasienter (3 vs 9 måneder, henholdsvis;
p
0,01). (B)
ALDH + eggstokkreft celler utstillinger stamcellelignende egenskaper
disse resultatene førte oss til ytterligere å karakterisere ALDH som en potensiell stamcelle markør i eggstokkreft. Tumorprogresjon kan være assosiert med tilstedeværelse av et undersett av celler som uttrykker stamcellemarkører og utviser aggressiv adferdsmessige egenskaper, inkludert invasiv og øket kolonidannelse potensial. For å undersøke sine invasive egenskaper, ble sortert celler (ALDH + vs. ALDH-) vurderes ved hjelp Matrigel invasjonen assay. Som vist i figurene 3A 3B, ALDH + -celler vist over 1,7 ganger økning (
p
0,01). I invasjon gjennom Matrigel forhold til ALDH- celler
A2780 /CP70 celler ble sortert i ALDH- og ALDH + fenotyper og evaluert med hensyn på deres evner til invasjon ved hjelp av Matrigel invasjonskamre (A), kvantitative data som representeres (B) og kolonidannelse potensial i nærvær og fravær av karboplatin (20 uM) ble vurdert ved hjelp av myk-agar-kolonidannelse assays (C). For å bestemme mulige mekanisme for kreft stamcelle egenskaper i ALDH + celler, evaluerte vi multiple markører for «stemness». A2780 /CP70-celler ble sortert i ALDH- og ALDH + fenotyper, total-RNA ble isolert, ble cDNA fremstilt og sanntids kvantitativ RT-PCR ble utført (D). ** Indikerer statistisk signifikans (
p
0,01).
En annen surrogat tiltak for å karakterisere stamceller kreftlignende celler er evnen til å danne kolonier, spesielt i nærvær av kjemoterapeutika [26]. I samsvar med deres invasiv potensial, ALDH + celler vist forbedret kolonidannelse evne sammenlignet med ALDH- fenotyper (2-dobling,
p
0,01). Viktigere, ALDH + fenotyper vises forbedret kolonidannelse evne i nærvær av karboplatin (5,4 ganger økning,
p
0,01) (Figur 3C). For å få innsikt i de potensielle stilk-lignende mekanismer for disse cellene, vi evaluert mulige stamcelle veier av interesse i disse cellene. RT-PCR-data viste nesten tre ganger høyere nivå av ekspresjon Krüppel-Like Factor 4 (KLF4) i ALDH + celler sammenlignet med sine motparter ALDH-. KLF4 tilhører sink finger familie av transkripsjonsfaktorer, som har blitt rapportert å være kritisk for opprettholdelsen av brystkreft stamceller og deres aggressiv oppførsel, slik som migrering og invasjon ad motstand mot cisplatin [27] [28]. Men gjorde andre stamcelle meklere som BMI1, c-myc, Oct3 /4 og S100A1 ikke vise noen merkbare endringer i sine uttrykk sammenlignet med ALDH- fenotyper (
p
0,01). (Figur 3D)
ALDH1A1 isotype fremmer ovarialcancer stilk-lignende cellenes egenskaper
i samsvar med CSC litteratur, våre data indikerer forhøyet uttrykk for ALDH1A1 isozym i platina motstandsdyktig A2780 /CP70 celler. For ytterligere å vurdere rollen til ALDH1A1 i vedlikehold av kreft stamceller-lignende celler egenskapene til platina resistente eggstokkreft celler, har vi downregulated ALDH1A1 bestemt isozyme hjelp shRNAs (figur S1). I motsetning til sitt høy ekspresjon, og nedregulering av ALDH1A1 ikke vist noen betydelige forskjeller i invasive egenskaper i disse celler (figur 4A og 4B; amp). Men ALDH1A1 knockdown påvirket deres evne til å danne kolonier i soft agar, viser en 2,5 ganger reduksjon i koloniene (
p
0,01) (Figur 4C). Tilsvarende nedregulering av ALDH1A1 alene betydelig sensibilisert iboende platina motstandsdyktig A2780 /CP70 celler til karboplatin. Vurderer IC
50 doser som kreves (82,9 mikrometer og 43,8 mikrometer for henholdsvis negativ kontroll og shALDH1A1 celler) for disse cellene, ca 50% reduksjon i carboplatindosen er tydelig for ALDH1A1 knockdown celler (
p
0,001 ) (figur 4D). Sammen tyder disse dataene på at ALDH1A1 status er en av de kritiske faktorene i å opprettholde stilk-lignende celle egenskaper og platina motstand i eggstokkreft.
lentiviral vektorer som uttrykker ALDH1A1 spesifikke shRNAs eller nontargeting shRNAs ble transfektert inn A2780 /CP70 celler og dens effekt på stilk-lignende celleegenskaper ble evaluert for invasiv potensial ved hjelp av Matrigel invasjonskamre (A), kvantitative data som representeres (B), klonogene potensial ved hjelp av bløt agar-kolonidannelse (C, og karboplatin avhengig vekst inhibering av CellTiter-Glo Luminescent Celleviabilitet Assay (D). Statistisk signifikans ble evaluert ved bruk av studentens
t-test.
ALDH1A1 styrer cellesyklus sjekkpunkter ved regulering av KLF4 og p21 proteiner
øket ekspresjon av KLF4 i ALDH + celler (figur 3D) førte oss til å vurdere enhver funksjonell sammenheng mellom ALDH1A1 og KLF4. Selv ALDH1A1 knockdown ikke påvirke nivået av KLF4 mRNA, en betydelig reduksjon i KLF4 proteinnivåer ble bevist i disse cellene (figur 5A ). Tatt i betraktning at den funksjonelle status av cellesyklus regulatoren p21 er nært knyttet til KLF4 funksjon, ble mRNA og proteinnivåene av p21 også vurdert. Som forventet ble begge ALDH1A1 transkripsjon og proteinnivåer av p21 dramatisk redusert i ALDH1A1 mangel A2780 /CP70 celler (figur 5A). Siden ALDH1A1 status påvirket uttrykk for cellesyklus sjekkpunkt proteiner p21 /CDK4, vi videre analysert cellesyklus profiler av disse cellene. De strømningscytometriske data indikerer klart redusert G1 cellepopulasjon (50,25% til 42,10%) og en kompensatorisk økning i akkumuleringen av celler i S og G2 fasene (figur 5B). På grunn av det faktum at cellene i aktiv replikasjon (S og G2 fasene) er mer utsatt for genotoksiske belastning i forhold til deres ikke-delende eller andre urolige faser (G0 og G1), kan re-sensibilisering av ALDH1A1 manglende celler være delvis tilskrives til endringene i cellesyklus distribusjon. Videre har vi også bekreftet at KLF4 status påvirker p21 uttrykk nivåer i A2780 /CP70 celler (Figur S2A S2B). Men evaluering av ALDH aktivitet og ALDH1A1 uttrykk i celler viste ikke noen merkbare endringer, noe som tyder KLF4 tjener sannsynlig nedstrøms til ALDH1A1 (figur S2C).
ALDH1A1 dyktig og mangelfull A2780 /CP70 celler ble evaluert for uttrykk av stammen -lignende cellemarkør KLF4 og cellesyklus kontrollpunkt-protein p21 ved RT-PCR og Western blot-analyse (A). Cellecyklus fordelinger av celler ble analysert etter fiksering av cellene i 70% metanol og propidiumjodidfarging fulgt av strømningscytometri (B). Apoptotiske celler ble detektert etter farging cellene med APC-Annexin V og 7-AAD i henhold til produsentens instruksjoner og analysert ved flowcytometri (C).
For å ytterligere evaluere gener ansvarlig for chemoresistance og celle syklus regulering basert på status for ALDH1A1 har vi brukt RT
2 Profiler PCR Array for menneske Cancer Drug Resistance Cell Cycle (Ambion). Sammenlignings ekspresjonsprofiler av gener i ALDH1A1 knockdown lignet med kontrollceller viste en betydelig nedgang i ekspresjon av cellesyklus regulatorer CDKN1A (p21) (0,27 ganger) og CDK4 (0,26 ganger), noe som bekrefter dens rolle i forbindelse med KLF4 ( Tabell 1).
av notatet, med restaurert platina følsomhet fra ALDH1A1 knockdown, uttrykk for den pro-apoptotiske faktor BAX ble oppregulert nesten 3,95 ganger. ALDH1A1 knockdown demonstrert øket antall celler i tidlig apoptotiske fase sammenlignet med kontrollen. Etter eksponering av celler til 1,0 uM staurosporin i 6 timer, ble det observert en dramatisk økning i begynnelsen av apoptotiske celler i ALDH1A1 manglende celler i forhold til deres ALDH1A1 dyktig mot deler (35,3% vs. 20,3%) (figur 5C). Disse data tyder på at ALDH1A1 knockdown-celler er mer utsatt for BAX-indusert apoptose, som har blitt godt beskrevet i inhibering av p21 cellesyklus kontrollpunkt [29].
ALDH1A1-mediert platinamotstands korrelerer til endrede DNA-reparasjonsnett
Intakt cellesyklus sjekkpunkter og DNA skade respons (DDR) signalmekanismer er viktige for cellenes evne til å motvirke med ulike typer genomiske fornærmelser og ryddig progresjon av cellesyklus. Imidlertid er et felles trekk ved kreftcellene endret regulering av disse signalkaskader å anskaffe ytterligere genetiske endringer som kreves for re-differensiering og overlevelse dermed vise terapeutisk motstand. Likeledes ALDH1A1 celler viste endrede regulering av KFL4 /p21 mediert cellesyklus kontrollpunkt mekanisme, som primært styrer inhibering av G1 til S og G2 til M progresjon i respons til DNA-skade for å gi mer tid for cellen å reparere. Vurderer foreningen av PARP-1 i reparasjon av karboplatin indusert DNA skade, evaluert vi sitt engasjement i ALDH1A1 celler. PARP-1-nivå progressivt øket opp til 45 minutter etter behandling karboplatin (figur 6A og 6B). Men nedregulering av ALDH1A1 resulterte i signifikant nedgang (1,8 ganger) i samlet pålydende nivåer (PARP aktivitet) (figur 6C) sammenlignet med ALDH1A1 dyktige celler (
p
= 0,012).
ALDH1A1 dyktig (kontroll) og mangelfulle (shALDH1A1) A2780 /CP70 celler ble vurdert for deres evne til å reparere karboplatin-indusert enkelttrådbrudd ved å se på tidsavhengig induksjon av PARP-1-proteinnivåer ved Western blot (A), densitometri av blot av Image J ( B) og total PARP-aktivitet ble analysert ved måling av PAR-nivåer (C). Å vurdere ALDH1A1 avhengige uttrykk DDR og reparasjon proteiner, helcellelysater var normalisert for total proteiner og western blot analyse ble utført ved hjelp av antistoffer som representert (D).
Flere nyere studier på brystkreft stem- celler indikerer endret regulering av DNA-reparasjons nettverk, spesielt en invers sammenheng mellom ALDH1A1 status og BRCA1 genuttrykk [15], [16]. Videre, i respons til DNA-skade, er BRCA1 kjent for å styre cellesykluskontrollpunkter og valget av DNA-reparasjonsbaner til rettidig reparasjon av disse DNA-lesjoner [16]. I samsvar med brystkreft stamcelle data, Western blot analyse viste en invers sammenheng mellom ALDH1A1 og BRCA1 uttrykk i A2780 /CP70 celler, noe som tyder ALDH1A1 uttrykker eggstokkreft stilk-lignende celler mer sannsynlig å miste eller uttrykke lave nivåer av BRCA1. Videre analyser viste nedregulering av ALDH1A1 indusert spontan DNA skade respons ved å uttrykke γ-H2AX protein (en markør for dobbelttrådbrudd). Dette er også falt sammen med den reduserte nivåer av excision reparasjon protein (XRCC1), replikering sjekkpunkt kinase protein 1 (Chk1) og andre replikering stress forbundet Fanconi anemi (FA) -BRCA genprodukter FANCD2 og FANCJ [30] – [32]. Sammen disse data tyder på at eggstokkreft stilk-lignende celler kan opprettholde terapeutisk motstand ved å uttrykke ALDH1A1 og uttømming av dem, opphever G1 og S-fase sjekkpunkter (Tall 5A og 6C) fører til replikering belastning (figur 5B). Selv ALDH1A1 utarmet celler akkumulert i S og G2 faser, den fosforylering status på replikering sjekkpunkt protein Chk1 (Ser317) og uttrykk av replikasjonsgaffelen forbundet FA pathway proteiner FANCD2 og FANCJ ble berørt. Dette er også overdratt ved induksjon av γ-H2AX, en markør for DSB og redusert celleoverlevelse. Siden Chk1 og FA proteiner er viktig for replikering sjekkpunkt og stabilitet i fastlåste replikering gafler, kan den spontane DNA skade respons i disse cellene tilskrives feil i disse proteinene (Figur 6D). For å identifisere de molekylære nettverk signaler som er forskjellig uttrykt i ALDH1A1 uttrykke celler, vi utgangspunktet vurderes uttrykk for Fanconi anemi sti og svulst motstand mot kjemoterapeutika. Konsekvent, våre resultater viste en direkte sammenheng mellom ALDH1A1 status og FANCD2 uttrykk. Sammen våre data indikerer en sammenheng mellom ALDH1A1 status til stemness og platinamotstands av eggstokkreft celler ved endret regulering av DNA reparasjonsarbeider.
Diskusjoner
Flere potensielle eggstokkene cscs spesifikke overflatemarkører har blitt beskrevet slik som CD44 + /CD117 + [33], CD44 + /MyD88 + [34], CD133 + [35], CD44 + /CD24- [21], [36] og ALDH /CD133 + [37].
