Abstract
Den vandrende evnen til kreftceller er en av de viktigste kjennetegnene reflekterer metastatisk potensial. Ouabain, en endogen hjerteglykosidet produsert av binyrene, er tidligere blitt rapportert å ha anti-tumor-aktivitet; imidlertid dens rolle i reguleringen av kreftcellemigrering er ukjent. Den foreliggende undersøkelse har vist at behandling med ouabain ved fysiologiske konsentrasjoner er i stand til å hemme den vandrende aktiviteter av human lungekreft H292-celler. De negative effektene av ouabain ble funnet å være mediert gjennom undertrykkelse av migrasjons regulatoriske proteiner, slik som fokal adhesjonskinase (FAK), ATP-avhengig tyrosinkinase (Akt), og celledeling syklus 42 (Cdc42). Vi fant at de observerte virkninger av ouabain ble formidlet via et reaktive oksygenarter (ROS) -avhengig mekanisme, fordi tilsetningen av ROS-oppfangere (N-acetylcystein og glutation) kunne reversere effekten av ouabain på cellemigrering. Videre ouabain ble vist å hemme tumorvekst og sfæroidal minske kreftcelle adhesjon til endotelceller. Imidlertid er forbindelsen ikke hadde noen signifikant effekt på anoikis av cellene. Sammen utgjør disse funnene kaster lys over forståelsen av kreftcellebiologi ved å utforske nye funksjonen til dette endogen human substans
Citation. Pongrakhananon V, Chunhacha P, Chanvorachote P (2013) Ouabain Undertrykker vandringsmønstrene hos Lung kreftceller. PLoS ONE 8 (7): e68623. doi: 10,1371 /journal.pone.0068623
Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children Hospital Medical Center, USA
mottatt: 04.02.2013; Godkjent: 30 mai 2013; Publisert: 10. juli 2013
Copyright: © 2013 Pongrakhananon et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av Thailand forskningsfond og Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Forstå det molekylære grunnlaget for kreftceller i respons til biologisk avledet stoffer er ansett som et viktig hjelpemiddel for å oppdage nye molekylære mål for medisinsk behandling. Betydelige bevis har indikert at ouabain, en natrium /kalium-pumpe inhibitor, er til stede i humant plasma og vev i området fra 0,002 til 0,77 nM [1] – [3]. I tillegg ble ouabain funnet å være oppregulert i en rekke sykdomstilstander inkludert hjertesvikt [1], [4], nyresvikt [5] og hypertensjon [3], [6]. Nylig har vi gitt bevis som indikerer at ouabain sensitizes tumor nekrose faktor-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL) -mediert kreft celle lunge apoptose, og dette funnet tyder på at ouabain kan påvirke kreftcellebiologi [7].
i lungekreft, har metastaser blitt den mest interessante delen av forskningen fordi den høye dødeligheten av denne sykdommen er forbundet med spredning kreft [8]. I løpet av celle spredning, må kreftcellene har evnen til å forflytte seg fra sin opprinnelige plass inn i den nærliggende sirkulasjonssystemet. Øket kinase-aktivitet av fokal adhesjonskinase (FAK), et nøkkelsignalveien kontrollere cellemotilitet, potenserer tumorigenese og metastase [9]. Slike endringer ble også funnet under anskaffelsesprosessen av metastatiske kreftceller [10], [11]. FAK styrer signaloverføring fra integrin-anriket fokal vedheft områder av celle-ekstracellulære matriks interaksjoner [12]. Når det gjelder reguleringen av kreftcellemigrering, FAK-fosforylering ved Tyr-397, og rekruttering av Src-familie-kinaser er viktige prosesser som starter overføringen [12] – [13]. I tillegg er aktivert status av flere trekk regulatorer så som ATP-avhengig tyrosinkinase (Akt) og celledeling syklus 42 (Cdc42) [14], [15] er kritisk for fremgangsmåten celle bevegelse. Flere studier har indikert at aktivering av Akt forbedrer evnen av kreftceller til å migrere og invadere [15], [16]. Akt som er lokalisert ved kanten av bevegelige celler interagerer med actin-bindende proteiner og induserer aktin remodellering og dannelse av membranfremspring, tilrettelegging cellemotilitet [15]. Dette konseptet ble bekreftet ved en undersøkelse som viser at nedregulering av Akt ved hjelp av en antisense-teknikk fører til en dramatisk inhibering av kreftcelle invasjon
in vitro product: [17] og
in vivo product: [18] . I tillegg har interaksjonen av FAK og ERK1 /2 er vist å kontrollere celle motilitet [19] – [20]. Nylig, Rho familien av små guanosine triphosphatases (GTPases), spesielt Cdc42, har vist seg å spille en viktig rolle i aktin omorganisering og filopodia formasjon. Ekspresjonsnivået av Cdc42 ble funnet å være oppregulert i mange kreftformer, inkludert lungekreft [21] – [22], og Cdc42 induksjon ble vist å forbedre kreft migrasjon [23]
Hittil rolle. av endogene nivåer av ouabain i reguleringen av kreftcelle motilitet stor grad har vært ukjent, og en slik forståelse kan føre til nye anti-cancer-terapier. Derfor ønsket vi å undersøke mulige konsekvenser av denne biologiske stoffet på kreft celle migrasjon og invasjon i ikke-småcellet lungekreft celler. For første gang viser vi at endogene nivåer av ouabain undertrykke tumorcelle motilitet, og er assosiert med redusert aktivering av FAK og Akt og ekspresjon av Cdc42. Vår studie tyder på romanen hypotesen om at denne fysiologiske substansen har en negativ regulerende rolle i prosessen med kreft celle metastasering.
Materialer og metoder
Cells og reagenser
Den ikke- småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinjene H292 og H460 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Cellene ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 5% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin og 100 enheter /ml penicillin /streptomycin. Cellene ble inkubert i en 5% CO
2 miljø ved 37 ° C. Ouabain, dichlorofluorescein diacetat (DCFH
2-DA), poly 2-hydroksyetylmetakrylat (poly-HEMA), 3- (4,5-dimetyl-tiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) og phalloidin tetramethylrhodamine B isotiocyanat ble oppnådd fra Sigma Chemical, Inc. (St. Louis, MO). Propidiumjodid (PI) og Hoechst 33342 ble anskaffet fra Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). Antistoffer for pan-Akt, p473-Akt, FAK, p397-FAK, Cdc42, caveolin-1 og β-aktin, så vel som peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer ble erholdt fra Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA).
Cell livs~~POS=TRUNC og apoptose Analyser
Celleviabilitet ble evaluert ved hjelp av MTT analysen. Etter de angitte behandlinger, ble cellene inkubert med 500 pg /ml MTT ved 37 ° C i 4 timer. En intensitet lesning av MTT produkt ble målt ved 550 nm ved anvendelse av en mikroplateavleser, og prosenten av levedyktige celler ble beregnet i forhold til kontrollceller. Apoptose ble bestemt ved Hoechst 33342 /PI farging og DNA-innhold analyse. Cellene ble vasket og inkubert med 10 ug /ml Hoechst 33342 og 5 ug /ml PI i 30 min. Kjerner kondens og DNA fragmentering av apoptotiske celler og PI-positive nekrotiske celler ble visualisert og scoret ved fluorescens mikroskopi (Olympus IX51 med DP70). For sub-G0 DNA innholdsanalyse, etter den angitte behandling ble cellene trypsinert, vasket med fosfat-bufret saltvann (PBS) og fiksert i 70% etanol ved 37 ° C i 3 timer. Etter vasking med fosfatbufret saltløsning, ble cellene inkubert i en PI oppløsning inneholdende 0,1% Triton-X, 1 ug /ml RNase og 1 mg /ml propidiumjodid ved romtemperatur i 30 min. DNA-innholdet ble analysert ved hjelp av strømningscytometri (FACSort, Becton Dickinson, Rutherford, NJ).
ROS Detection
Intracellulær ROS-nivåer ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri ved bruk av DCFH-DA som en fluorescerende probe. Kort fortalt ble cellene inkubert med 10 pM DCFH
2-DA i 30 minutter ved 37 ° C, hvoretter de ble vasket, trypsinert, resuspendert i fosfatbufret saltvann, og umiddelbart analysert med hensyn til fluorescensintensitet av en mikroplateleser.
Migrasjon analysen
Migrasjon ble bestemt ved sårtilheling og Transwell analyser. For sårheling assay, et monolag av celler som ble dyrket i en 24-brønners plate, og et sår plass ble gjort med en 1 mm bred spiss. Etter skylling med PBS, ble cellemonolagene inkubert med de angitte behandlinger og tillates å migrere i 24 timer. Mikrobilder ble tatt under et fasekontrastmikroskop (Olympus DP70, Melville, NY), og den viklede mellomrom ble målt fra 10 tilfeldige synsfelt ved hjelp av Olympus DP kontrollerens programvare. Kvantitativ analyse av cellemigrering ble utført ved bruk av en gjennomsnittlig sår plass fra de tilfeldige synsfelt, og den prosentvise endring i såret plass ble beregnet ved anvendelse av følgende formel:% endring = (gjennomsnittlig plass ved tiden 0 h) – (gjennomsnitt plass ved 24 h) /(gjennomsnittlig plass ved tiden 0 h) x 100. den relative cellemigrering ble beregnet ved å dividere den prosentvise endring i såret plass av behandlede celler av den for kontrollcellene i hvert eksperiment. For transwell analysen ble cellene sådd ut ved en tetthet på 5 x 10
4 celler /brønn på det øvre kammer i et Transwell (8 um porestørrelse) i en 24-brønners plate i serumfritt medium og inkubert med forskjellige konsentrasjoner av ouabain. RPMI-medium inneholdende 10% FBS ble tilsatt til det nedre kammer. Etter inkubering ble de ikke-migrerte celler på den øvre kammer fjernet ved avtørking bomullsdott, og cellene som migrerte til undersiden av membranen ble farget med 10 ug /ml Hoechst 33342 i 10 minutter og visualisert og mottok under en fluorescens mikroskop (Olympus IX51 med DP70).
Invasion analysen
en invasjon analysen ble utført ved hjelp av en 24-brønns transwell enhet med polykarbonat (PVDF) filtre (8 mikrometer pore størrelse). Membranen ble belagt med 0,5% matrigel på den øvre overflate av kammeret over natten ved 37 ° C i en fuktet inkubator. Cellene ble sådd ut ved en tetthet på 2 x 10
4 celler per brønn inn i det øvre kammer i transwell enhet i serumfritt medium. Medium inneholdende 10% FBS ble tilsatt til det nedre kammer av enheten. Etter inkubasjon med bestemte teststoffer i 24 timer ved 37 ° C, ble mediet i det øvre kammer aspirert, og cellene på den øvre side av membranen ble fjernet med en bomullspinne. Cellene som invaderte til undersiden av membranen ble farget med 10 ug /ml Hoechst 33342 i 10 minutter, visualisert og mottok under et fluorescens mikroskop.
cellemorfologi og Filopodia karakterisering
Cellemorfologi ble undersøkt av en phalloidin-rhodamine og sulforhodamin B flekker analysen. Cellene ble sådd ut ved en tetthet på 10
4 celler /brønn på en 96-brønns plate over natten. Cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av ouabain i 24 timer. Cellene ble deretter vasket med PBS, fiksert med 4% paraformaldehyd i PBS i 10 minutter ved 37
°
C, permeabilisert med 0,1% Triton-X100 i PBS i fire minutter, og blokkert med 0,2% BSA i 30 min. Deretter ble cellene inkubert med enten 1:100 phalloidin-rhodamin i PBS eller 0,4% sulforhodamin B i 1% eddiksyre i 15 minutter, skylt 3 ganger med PBS, og montert med 50% glycerol. Cell morfologi ble deretter vurdert av fluorescerende bildebehandling (Olympus IX51 med DP70). Filopodia utvekst ble representert som gjennomsnittlig antall filopodia /celle i forhold til ubehandlede celler i hvert felt.
In vitro 3D tumorigenesis analysen
In vitro 3D tumorigenesis ble utført i en matrigel-belagt 96- brønns plate. En plate ble belagt med 0,5% matrigel og venstre for størkning over natten ved 37
°
C. Cellene ble suspendert i kulturmedium inneholdende 4% matrigel og ouabain (0-30 pM), og sådd ved en tetthet på 10
3 celler /brønn på en matrigel-belagt plate. Medium inneholder ouabain (0-30 pM) ble erstattet hver 3. dag. Etter 10 dager ble cellene visualisert og scoret etter bilde analysator henhold mikroskop.
Anoikis analysen
For anoikis evaluering, ble Tissue kultur seks-brønns plater belagt med 6 mg /ml poly (2 hydroksyetyl-metakrylat (poly-HEMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i 95% etanol og innkubert ved 37 ° C for tørking. H292-celler ble sådd ut på poly-HEMA-belagte plater i RPMI medium inneholdende angitte behandlinger for 0-24 t. etter inkubasjon med 10 mikrogram /ml Hoechst 33342 for 30 min, kjerner kondens og DNA fragmentering av anoikis celler ble visualisert og scoret ved fluorescens mikroskopi (Olympus IX51 med DP70).
Anchorage uavhengig vekst assay
forankrings-uavhengig vekst ble bestemt ved kolonidannelse i bløt agar assay. i korthet ble celler fra 6-brønners plate monolagskulturer ble fremstilt i en enkeltcellesuspensjon. cellene ble suspendert i RPMI inneholdende 10% FBS og 0,33% lav smeltetemperatur agarose, og 2 x 10
4 celler ble sådd ut i en 35 mm skål over et lag av størknet RPMI /10% FBS /0,6% agarose. Cellene ble tilført hver tredje dag ved å tilsette 200 ul RPMI /10% FBS. Koloniene ble farget med 10 mikrogram /ml Hoechst 33342 for 30 min, visualisert og scoret etter bilde analysator under fluorescerende mikroskop (Olympus IX51 med DP70).
ett lag celleadhesjonsanalyse
HUV-EC- C ble stimulert med 10 ng /ml IL-1β i 0-4 timer. Etter den angitte behandling, H292-celler (2,5 x 10
4 celler /ml) ble tilsatt til en semi-konfluente monolagskultur av HUV-EC-C, inkubert i 20 minutter ved 37 ° C med rotasjon ved 120 opm, og vasket omfattende å utelukke uspesifikke cellebinding. Antallet festede celler ble tellet direkte under et fluorescensmikroskop.
Western blotting
Etter bestemte behandlinger, ble cellene inkubert i lyseringsbuffer inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 % Triton X-100, 150 mM natriumklorid, 10% glycerol, 1 mM natriumortovanadat, 50 mM natriumfluorid, 100 mM fenylmetylsulfonylfluorid og en kommersiell protease inhibitor cocktail (Roche Molecular Biochemicals) i 30 min på is. Cellelysatene ble oppsamlet, og proteininnholdet ble bestemt ved anvendelse av Bradford fremgangsmåten (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Like mengder av protein fra hver prøve (60 mikrogram) ble denaturert ved oppvarming ved 95 ° C i 5 minutter med Laemmli lastebuffer og deretter applisert på en 10% SDS-polyakrylamidgel. Etter separering ble proteinene overført til 0,45-um nitrocellulosemembraner (Bio-Rad). De overførte Membranene ble blokkert i 1 time i 5% fettfri tørrmelk i TBST (25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 125 mM NaCl, 0,05% Tween 20) og inkubert med de passende primære antistoffer ved 4 ° C over natten. Membranene ble vasket to ganger med TBST i 10 min, og inkubert med pepperrot peroksidase-koblet isotype-spesifikke sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur. De immunkomplekser ble påvist ved å styrke med en chemiluminescence underlaget. (Supersignal West Pico, Pierce) og kvantifisert ved hjelp av analytiker /PC densitometry programvare (Bio-Rad)
Statistical Analysis
Mean data fra uavhengige forsøkene ble normalisert til resultatene fra celler i kontrollgruppen. Alle eksperimenter ble gjentatt minst fire ganger. En statistisk analyse mellom to grupper ble bekreftet av Student t test, og å sammenligne med flere grupper, ble gjennomført en analyse av varians (ANOVA) med en post-hoc test. En P-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Migratory Karakteristisk for ikke-småcellet lungekreft H292 Cells
For å teste effekten av ouabain på lungekreft celle migrasjon, vi først preget migrasjon profilen til H292-celler ved hjelp av såret migrasjon og Transwell analyser. Fig. 1A og B viser at H292-celler migrert over såret plass på en tidsavhengig måte, og resultatene var i samsvar med de som ble oppnådd fra transwell migreringen analysen
A.: Sammenflytende monolag av H292-celler ble såret ved hjelp av en 1 mm bred tupp og lov til å migrere for 0-24 timer. Såret plass ble visualisert under et mikroskop, og de relative vandringsnivåene sammenlignet med 0-h tidspunkt ble beregnet. Data representerer gjennomsnitt ± SD (n = 4). *
P
0,05 vs. verdi på 0 h tidspunkt. B: H292-cellemigrering ble undersøkt ved en transwell assay for 0-24 timer. Migrerende cellene ved det basolateral side av membranen ble farget med Hoechst 33342 i 30 minutter og visualisert under et fluorescensmikroskop. Data ble plottet som et gjennomsnittlig antall av celler i hvert felt og representerer gjennomsnitt ± SD (n = 4). *
P
0,05 vs. verdi på 0 h tidspunkt. C: H292-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av ouabain (0-5,000 pM) i 24 timer. Celleoverlevelse ble bestemt ved en 3- (4,5-dimetyl-tiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) assay. Levedyktigheten av ubehandlede celler ble representert som 100%. Data representerer gjennomsnitt ± SD (n = 4). *
P
0,05 vs. ubehandlede kontrollceller. D: apoptotisk celledød ble evaluert ved anvendelse av Hoechst 33342 farging. Data representerer gjennomsnitt ± SD (n = 4). *
P
0,05 vs. ubehandlede kontrollceller. E:. Cellular apoptose ble bestemt av DNA innholdsanalyse ved hjelp av flowcytometri
Deretter en cytotoksisitet eksperiment ble utført for å teste om biologiske konsentrasjoner av ouabain påvirke H292 celle levedyktighet. Cellene ble dyrket i fravær eller nærvær av ouabain (10-5000 pM), og levedyktigheten av cellene ble bestemt ved bruk av et MTT-assay ved 24 timer. Resultatene indikerer at konsentrasjoner av ouabain i det endogene nivåer (2-770 pM) førte hverken toksiske eller proliferative effekter på disse lungekreftceller (Fig. 1C). Selv om konsentrasjonen av dette stoffet opp til 1000 nM induserte ikke apoptose, 5000 nM ouabain betydelig redusert celle-levedyktighet (fig. 1 C) og mediert celledød detektert av en Hoechst 33342 nukleær farging assay (fig. 1D). I tillegg ble cellene behandlet med 0-500 pM ouabain i 24 timer, og cellene ble utsatt for strømningscytometri for sub G
0 fraksjon bestemmelse. Fig. 1E viser at behandling av cellene med 10-500 pM ouabain forårsaket ingen signifikant endring av under G
0 fraksjon i forhold til det av de ubehandlede kontrollceller. Disse resultatene tyder på at konsentrasjonene av ouabain funnet i humant plasma og vev ikke påvirker levedyktigheten til H292-celler.
ouabain hemmer Lung Cancer Cell migrasjon og invasjon
Endogene konsentrasjoner av ouabain ble videre testet for deres mulige virkning på kreft celle migrasjon. Cellene ble behandlet med 0-30 pM ouabain og brukes i migrasjons analyser i 24 timer. Et sår migreringsanalyse viste at ouabain trykkes H292 cellemigrering på en doseavhengig måte sammenlignet med de ubehandlede kontrollcellene (fig. 2A). Ved en konsentrasjon på 20 pM, forårsaket ouabain en tilnærmet 50% reduksjon i vandrende aktivitet av cellene. I tillegg er den transwellmigrasjonsanalysen tilgjengelig støtte data som indikerer at ouabain i betydelig grad hemmet cellevandring (Fig. 2B). Selv om de definerte mekanismene og regulering av kreftcelle migrering og invasjon er ikke helt kjent, studier har antydet at det er tilknyttet signaliseringsbaner [24]. Effekten av ouabain på invasiv potensialet av kreftceller ble ytterligere testet ved anvendelse av en ekstracellulær matriks-belagt transwell analysen. Cellene ble tilsatt til transwell og behandlet med de angitte konsentrasjoner av ouabain i 24 timer. Fig. 2C viser at ouabain behandling vesentlig redusert antall invaderte H292-celler sammenlignet med ubehandlede kontrollceller med en tilnærmet 50% reduksjon funnet som svar på 20 pM ouabain
A.: Sammenflytende monolag av H292-celler ble såret ved bruk av et 1 -mm-bred spiss og inkubert med ouabain (0-30 pM) i 24 timer. Såret plass ble analysert og representert som migrerings nivå i forhold til endringen av de ubehandlede cellene. B: Trekk-celler ble farget med Hoechst 33342 i 30 minutter ble visualisert under et fluorescensmikroskop og representeres som et gjennomsnittlig antall av celler i hvert felt. C: Cell invasjonen ble evaluert med en transwell belagt med matrigel som beskrevet under
Materialer og metoder
. Etter 24 timer ble cellene som invaderte over membranen visualisert under et fluorescensmikroskop og representeres som et gjennomsnittlig antall av celler i hvert felt. Data representerer gjennomsnitt ± SD (n = 4). *
P
. 0,05 vs. ubehandlede kontrollceller
Ouabain Reduserer Filopodia Dannelse i H292 Cells
Plasma membran utstikkere kalt filopodia økning i celle bevegelse, og dannelsen av filopodia er involvert i kreftcellemigrasjon og metastasering [25]. Etter å ha vist at ouabain hemmet migrering og invasjon av cellene, undersøkte vi videre effekten av dette stoff på tilstedeværelsen av filopodia i H292-celler. Cellene ble dyrket i nærvær eller fravær av ouabain (30 pM) i 24 timer, og filopodia fremspringet ble fanget i henhold til fluorescens og fase-kontrast moduser av et mikroskop ved hjelp av phalloidin og sulforhodamin B-analyser, respektivt. Fig. 3A viser at H292-celler i den bevegelige tilstand oppviste et betydelig antall filopodia fremspring som ble dramatisk redusert i respons til behandlinger ouabain. Disse resultater antyder at reduksjonen av filopodia i cellene kan, i det minste delvis, spiller en rolle i den negative regulerende rolle av ouabain. Tilstrekkelig bevis har indikert at filopodia dannelsen i kreftceller innebærer Cdc42 protein [26] – [28]. På grunn av at ekspresjonsnivået av Cdc42 ble vist å være tett forbundet med dannelsen av filopodia, vi undersøkt videre mekanismen av ouabain i reguleringen av filopodia i disse cellene ved å bestemme den cellulære ekspresjon av Cdc42. Resultatene viser at ekspresjonsnivået av Cdc42 dramatisk redusert i respons til behandlinger ouabain (Fig. 3B). Selv om et tilstrekkelig nivå av dette proteinet ble påvist i ubehandlede celler, 30 pM ouabain nesten opphevet Cdc42 uttrykk. Denne informasjonen tyder på at ouabain kan redusere den vandrende aktiviteten til disse cellene via Cdc42 dempning
A.: H292-celler ble behandlet med 30 pM ouabain (OB) eller ubehandlet som kontrollceller i 24 timer. Cellene ble farget med enten sulforhodamin B eller phalloidin og visualisert under et fluorescens-mikroskop ved 40 x. Filopodia fremspring er angitt med piler og er representert som et gjennomsnittlig antall filopodia per celle i hvert felt i forhold til ubehandlede celler. Data representerer gjennomsnitt ± SD (n = 4). *
P
0,05 vs. ubehandlede kontrollceller. B: Etter den angitte behandling ble cellene samlet og analysert for celledeling syklus 42 (Cdc42) ekspresjon ved Western blotting. Blottene ble reprobed med β-actin å bekrefte lik belastning. Immunoavtrykket signaler ble kvantifisert ved densitometri, og midlere data fra uavhengige eksperimenter ble normalisert til resultatene. Stolpene er midler ± SD (n = 4). *
P
. 0,05 vs. ubehandlede kontrollceller
Ouabain Reduserer Aktivering av FAK, Akt og ERK via en ROS-avhengig Mechanism
For å belyse mekanismene for kreftcelle motilitet hemming av ouabain, denne undersøkelsen bestemmes ekspresjon og aktiverte nivåer av proteiner involvert i cellemigrering. Cellene ble behandlet med ikke-giftige konsentrasjoner av ouabain eller venstre ubehandlet, og Akt, aktivert Akt (fosforylert Akt på Ser473) [29], FAK, aktivert FAK (fosforylert FAK ved Tyr-397) [24] og Cav-1-nivå ble bestemt ved western blot-analyse. Fig. 4 viser at behandling av cellene med ouabain (0-30 pM) i det vesentlige ned-regulert ekspresjon av aktivert Akt og aktivert FAK og samtidig bevare sine ikke-aktiverte motparter. Disse resultatene tyder på at ouabain blandet med den aktiverte nivå av proteiner og muligens regulerte celle-migrering og invasjon ved inhibering av Akt og FAK nedstrøms veier. Nylig har vi og andre indikerte betydelig rolle Cav-en på lungekreft invasiv og trekk aktiviteter. Vi testet videre om ouabain demper cellemotilitet gjennom redusert Cav-1-nivå. Uventet, nivået av Cav-1 som respons på ouabain behandling ble ikke forandret (fig. 4)
A.: H292-celler ble behandlet med ouabain (0-30 pM) i 24 timer. Cellene ble samlet og analysert for fokal adhesjonskinase (FAK), fosfo-FAK (p-FAK, Tyr397), ATP-avhengig tyrosinkinase (Akt), fosfo-Akt (p-AKT, Ser473), og caveolin-1 ( CAV-1) ekspresjon ved Western blotting. Blottene ble reprobed med β-actin å bekrefte lik belastning. B: immunoavtrykket Signalene ble kvantifisert ved densitometri, og midlere data fra uavhengige eksperimenter ble normalisert til resultatene. Stolpene er midler ± SD (n = 4). *
P
. 0.05 vs ubehandlede kontrollceller
Vi har vist at migreringen av kreftceller er tett forbundet med oksidativ status av celler. Tidligere data indikerte at den vandrende aktivitet av kreftceller ble betydelig svekket som følge av antioksidanter behandlinger [30]. For å klargjøre det mulig regulerende effekt av ouabain i denne sammenheng, ble cellene behandlet med antioksidanter i nærvær eller fravær av ouabain og deres vandringsadferd og cellulære ROS-nivåer ble vurdert. Fig. 5A og 5B viser at behandling med de kjente antioksidanter celle-gjennomtrengelige glutation (GSH) og N-acetylcystein (NAC) betydelig migrering av ouabain-behandlede celler, bekrefter rollen til ROS i den vandrende aktiviteten av celler som er undertrykt av ouabain . I tillegg ble det intracellulære ROS-nivåer bestemt i cellene inkubert med ouabain, GSH og NAC. ROS detektert av en bestemt oksidativ probe, viste at celle ROS stiger som respons på ouabain behandlinger (10-30 pm) sammenlignet med ubehandlet kontroll, mens hverken NAC eller GSH alene hadde en effekt på motilitet eller hver celle endogene ROS nivåer. Viktigere, tilsetning av GSH og NAC i ouabain-behandlede celler i betydelig grad undertrykkes ROS-produksjon utløst av ouabain (Fig. 1C). Videre tilbyr vi en sammenheng mellom mobilnettet ROS og aktiveringsstatusen til Akt og FAK. Cellene ble forbehandlet med enten GSH eller NAC i nærvær eller fravær av ouabain og nivåene av Akt, aktivert Akt, FAK og aktivert FAK ble bestemt som beskrevet ovenfor. Resultatene tyder på at administrering av antioksidanter reversert ned regulerende virkning av ouabain på aktivert Akt og aktivert FAK, mens de ikke-fosforylerte former av begge proteiner var upåvirket (fig. 6). Disse funnene ikke bare gi bevis for en pro-oksidant effekt av ouabain, men de kan også indikere mulig mekanisme ouabain i å hemme cellemigrasjon via en ROS-avhengig mekanisme
A:. Flytende monolag av H292-celler ble såret ved anvendelse av en 1 mm bred spiss og inkubert med antioksidanter, 1 mM celle-gjennomtrengelige glutation (GSH) eller 5 mM N-acetylcystein (NAC) i nærvær eller fravær av ouabain (0-30 pM) i 24 timer. Såret plass ble analysert og representert som migrerings nivå i forhold til endringen av de ubehandlede cellene. B: Cell migrasjon ble tatt med et mikroskop. C: Cellene ble forbehandlet med enten 1 mM GSH eller 5 mM NAC i 30 minutter i nærvær eller fravær av 30 pM ouabain eller ouabain (0-30 pM) alene i 0-3 timer. Cellene ble deretter inkubert med dichlorofluorescein diacetat (DCFH
2-DA) i 30 min, og fluorescensintensiteten ble analysert ved hjelp av en mikroplateleser. Gjennomsnittlig intensitet ble normalisert til ubehandlede kontrollceller og representert som relative ROS nivåer. Datapunkter er midler ± SD (n = 4). *
P
0,05 vs. ubehandlede kontrollceller.
#
P
0,05 vs. 30 pM ouabain-behandlede celler
A: H292-celler ble forbehandlet med enten 1 mM GSH eller 5 mM NAC i 30 min. i nærvær eller fravær av ouabain (30 pM) i 24 timer. Cellene ble samlet og analysert for fokal adhesjonskinase (FAK), fosfo-FAK (p-FAK, Tyr-397), ATP-avhengig tyrosinkinase (Akt) og fosfo-Akt (p-AKT, Ser-473) ekspresjon av Western blotting. Blottene ble reprobed med β-actin å bekrefte lik belastning. B: immunoavtrykket Signalene ble kvantifisert ved densitometri, og midlere data fra uavhengige eksperimenter ble normalisert til resultatene. Stolpene er midler ± SD (n = 4). *
P
. 0,05 vs. ubehandlede kontrollceller
#
P
. 0,05 vs. 30 pM ouabain-behandlede celler
Ouabain reduserer migrasjon og invasjon av NSCLC H460 Cells
for å teste om ouabain var i stand til å hemme migrasjon i andre lungekreft celler, vi behandlet den menneskelige ikke-småcellet lungekreft cellelinje H460 med ouabain (0-30 pM) og underkastes cellene til en migrasjonsanalyse. Spesielt, MTT-resultatene ved bruk av de H460-celler viste at behandling med ouabain på 0-30 pM forårsaket ingen signifikant effekt på levedyktigheten av cellene (data ikke vist). I samsvar med resultatene oppnådd fra H292-celler, behandling av H460-celler med ouabain ved de angitte konsentrasjonene vesentlig svekkede cellemigrering på en doseavhengig måte (fig. 7A). I tillegg ble ekspresjon av proteiner og deres aktiverte motparter bestemt. Western blotting Resultatene indikerte at behandling med ouabain tilsvar endres med aktivert Akt, aktivert FAK, og aktivert ERK, mens de ikke-aktiverte proteiner og Cav-1-nivå ikke ble påvirket av behandlingen (Fig. 7B).
En : Sammenflytende monolag av H460-celler ble såret ved anvendelse av en 1 mm bred spiss og inkubert med ouabain (0-30 pM) i 24 timer. Såret plass ble analysert og representert som migrerings nivå i forhold til endringen av de ubehandlede cellene. Dataene er gjennomsnitt ± SD (n = 4). *
P
0,05 vs. ubehandlede kontrollceller. B. Under de samme behandlingsforhold, ble cellene samlet og analysert for fokal adhesjonskinase (FAK), fosfo-FAK (p-FAK, Tyr-397), ATP-avhengig tyrosinkinase (Akt), fosfo-Akt (p- AKT, Ser-473) og caveolin-en (Cav-1) uttrykk ved Western blotting. Blottene ble reprobed med β-actin å bekrefte lik belastning. Immunoavtrykket signaler ble kvantifisert ved densitometri, og midlere data fra uavhengige eksperimenter ble normalisert til resultatene. Stolpene er midler ± SD (n = 4). *
P
. 0,05 vs. ubehandlede kontrollceller
Ouabain undertrykker tumorvekst i 3D Tumor spheroid Forhold og Hemmer Cell avløsning
Etter å ha vist seg rollen ouabain i kreft celle migrasjon, vi neste undersøkt muligheten regulering av kreft metastasering av ouabain.
