Abstract
Androgen reseptor (AR) er et medlem av den kjernefysiske reseptor familien av transkripsjonsfaktorer. Ved binding til androgener, blir AR transkripsjonelt aktiv for å regulere uttrykket av målgener som havn androgen responselementer (Ares) i sine arrangører og /eller forsterkere. AR er viktig for vekst og overlevelse av prostata kreft celler og er derfor et mål for dagens og neste generasjons behandlingsformer mot prostatakreft. Patofysiologisk relevante protein-protein interaksjonsnettverk som involverer AR er imidlertid dårlig forstått. I denne studien vi identifisert protein fusert /translokert i liposarkom (FUS /TLS) som en AR-veksel protein ved ko-immunoutfelling av endogene proteiner i LNCaP humane prostatakreftceller. Den hormonelle responsen FUS uttrykk i LNCaP celler ble vist å ligne andre AR co-aktivatorer. FUS vist en sterk iboende trans kapasitet i prostatakreftceller når bundet til basale arrangører som bruker GAL4 system. Kromatin immunoutfellingsstudier eksperimenter viste at FUS ble rekruttert til ARE III av forøker regionen i
PSA
genet. Data fra ektopisk overekspresjon og «knock-down» tilnærming vist at AR transkripsjonen aktivitet ble forsterket av FUS. Nedbryting av FUS redusert androgen-avhengige spredning av LNCaP celler. Dermed er FUS en roman co-aktivator av AR i prostata kreft celler
Citation. Haile S, Lal A, Myung JK, Sadar MD (2011) FUS /TLS er en co-Activator av androgen Receptor i prostata kreft celler. PLoS ONE 6 (9): e24197. doi: 10,1371 /journal.pone.0024197
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 11 juli 2011; Godkjent: 02.08.2011; Publisert: 01.09.2011
Copyright: © 2011 Haile et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av kanadiske Institutes of Health Research gi MOP-79308. www.cihr-irsc.gc.ca/e/193.html. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
androgen reseptor (AR) er nødvendig for overlevelse og vekst av prostata kreft celler. Følgelig kan prostatakreft behandles med androgen ablasjonsterapier. Dessverre er disse behandlingene slutt mislykkes og sykdommen blir dødelig, kastrering resistent prostatakreft (CRPC). Den mest støttet mekanismen bak CRPC innebærer AR. Den amino-terminale domene (NTD) av AR er nødvendig for både ligand-avhengig og ligand-uavhengig aktivitet av reseptoren (for en oversikt se [1]). Derfor, for å nåværende innsats utvikle mer effektive legemidler mot CRPC er fokusert på mer effektiv blokkering av androgen syntese, antiandrogener som kompetitivt binder AR ligand-bindende domene (LBD) med mye høyere affinitet [2], og inhibitorer av AR NTD [3 ]. Fortsatt innsats for å utvikle medikamenter vil dra nytte av bedre forståelse av protein-protein interaksjonsnettverk som involverer AR. For å oppnå dette, brukte vi en proteomikk tilnærming og identifisert nye endogene AR interaksjonspartnere i prostatakreftceller som inkluderer medlemmer av en gruppe proteiner som kalles FET /TET. Denne familien av proteiner inkluderer: smeltet i Sarkom (FUS) /translocated i liposarkom (TLS), ewig sarkom protein (EWS), og TATA bindende protein-Associated Factor, TAF15
FET proteiner vise ulike funksjoner inkludert. transkripsjonen modulasjon, spleising, celle spredning, og DNA-reparasjon. FET-proteiner har lignende transkripsjonelle aktiveringsdomener (Tads) ved sin NTD og RNA gjenkjennelse motiv (RRM) og gjentakelser av tripeptidet RGG ved deres karboksylenden [4], [5]. TAD av FET-proteiner inneholder XYXXQ rike motiv, X er en liten aminosyre (Gly, Ala, Ser eller Pro) [6]. Dette motivet er også delt med proto-oncoprotein SYT, den menneskelige kjernefysisk reseptor co-aktivator SYT-samspill Protein /Co-aktivator Activator (SIP /CoAA), og SWI /SNF /BAF250 [6]. FET NTDS, inkludert potente Tads, blir sammensmeltet til DNA-bindende domener (DBDS) av forskjellige transkripsjonsfaktorer i en underklasse av sarkomer og andre kreft [5], noe som fører til hyperactivation av tilsvarende transkripsjonen aktivitet. Emerging bevis tyder på at native, full-lengde FET proteiner binde seg til og aktivere funksjonene til spesifikke transkripsjonsfaktorer delvis ved å rekruttere co-faktorer som CBP /p300 [4] -. [5]
Resultater
AR og FUS er funnet i samme proteinkompleks
LNCaP human prostatakreft cellelinje [7] sammenfatter viktige trekk ved prostatakreft blant annet uttrykk for både prostataspesifikt antigen (PSA) og AR samt som følsomhet for androgen. For vår første skjermbildet, brukte vi atomlysatene fra LNCaP celler som ble behandlet med syntetisk androgen R1881 (10 nM) i 3 timer. Lysatene ble immunopresipitert med anti-AR-antistoff og prøver ble underkastet flerdimensjonal protein identifikasjon teknologi (mudpit) [8]. Massespektrometrisk analyse identifiserte FUS, som hører til FET familien av proteiner som vekselvirker med AR (figur 1 A, Figur S1, S2 figur og tabell 1). Co-immunoutfellingsstudier (co-IP) eksperimenter, etterfulgt av Western blot analyse validert samspillet mellom AR og FUS (Figur 1b). AR co-immunopresipitert (co-IP) med FUS, mens immunoprecipitation med isotype IgG kontroll ikke trekke ned AR eller FUS. Omvendt co-IP med anti-AR fulgt av Western blot analyse med anti-FUS antistoff viste også at AR samhandlet med FUS (figur 1C). I samsvar med tidligere rapporter, behandling med R1881 forbedret nivåer av AR protein.
In vivo
sammenslutning av FUS med AR ble bekreftet ved hjelp av ekstrakter av LNCaP xenografter som ble dyrket i mus før eller etter kastrering (figur 1D). Sammen støtter disse dataene som AR og FUS førsteamanuensis i samme kompleks i prostatakreftceller.
(A) Identifikasjon av FUS som en AR-samspill protein ved co-immunopreciptation (Co-IP), etterfulgt av massespektrometri ( MS). MS /MS spektra av m /z 1660,77 (fra 831,39, 2+) av FUS og to andre som er vist i tilleggsmaterialet ble entydig tildelt identifisert sekvens LKGEATVSFDDPPSAK, APKPDGPGGGPGGSHMGGNYGDDR, og TGQPMINLYTDR hhv. (B) Validering av AR-FUS samhandling ved hjelp av Co-IP etterfulgt av western blot analyse. LNCaP-celler i kulturen ble indusert med 10 nM R1881 i 6 timer og hele lysater ble anvendt for IP med anti-FUS-antistoff, etterfulgt av anti-AR western blot (WB) analyse. (C) Reverse IP med anti-AR fulgt av WB med anti-FUS antistoff. (D) IP endogene komplekser av AR og FUS fra subkutane LNCaP xenografter. Svulster ble høstet fra intakte mus (I), 10 dager etter kastrering (C10) eller 30 dager etter kastrering (C30). Lysates fra disse svulstene ble individuelt brukes til IP med anti-AR antistoff etterfulgt av WB med angitte antistoffer.
subcellulære lokalisering av FUS i prostata kreft celler
FET proteiner kan være lokalisert divergently i kjernen og /eller cytoplasma [5], [9]. Immunfluorescens-mikroskopi ved bruk av antistoffer rettet mot endogene proteiner ble utført i LNCaP-celler. FUS ble utelukkende lokalisert til kjernen (figur 2A). FUS syntes å være lokalisert i forskjellige flekker innen kjernen (figur 2A, B). Heterogenitet i sub-nukleær fordeling av FUS blant cellepopulasjonen ble observert (figur 2A, B). Dual-farging viste ko-lokalisering av AR med FUS (figur 2B) i LNCaP-celler som ble behandlet med 10 nM R1881 i 3 timer. Pearsons koeffisient nærmet 0,8 i enkelte celler i bestemte områder av kjerner.
(A) Nuclear lokalisering av FUS i LNCaP celler. Celler ble behandlet med R1881 (10 nM) i 3 timer. Konfokalt immunofluoresence ble utført ved anvendelse av anti-FUS-antistoff (grønn), og cellene ble motfarget med DAPI (blå). (B) colocalization av AR og FUS. Dual-farging viser ko-lokalisering av AR (rød) med FUS (grønn) i LNCaP-celler ble behandlet med 10 nM R1881 i 3 timer. Den innfelt i panelet til høyre representerer cellen merket med (*) etter terskel gating å fjerne lys og sentral grønn flekk.
FUS har egenverdi trans aktivitet i prostatakreftceller
Tads av FET-proteiner kan gi robuste transkripsjonen transaktivering i noen tumorer [4] – [5], men dette har ikke vært undersøkt i prostatakreftceller. Her benyttet vi GAL4 trans analyse for å undersøke om trans aktivitet kan tilskrives FUS i prostatakreftceller. Chimeriske konstruksjoner skjuler full-lengde FUS (eller fragmenter deri) sammensmeltet til Gal4 DBD-ble benyttet i denne analysen (figur 3A). PC3 prostata kreft celler, blottet for funksjonell AR, ble ko-transfektert med hver av GAL4 fusjonskonstruksjonene, og en reporter-gen som inneholder de minimale Gal4-bindingsseter (P5 x Gal4UAS-TATA-luciferase). GAL4 DBD-alene ble anvendt som en negativ kontroll, og det hadde minimal aktivitet (figur 3B). I motsetning til dette, Gal4-FUS indusert luciferase-aktivitet signifikant (figur 3B) som var i overensstemmelse med det å ha iboende transaktiveringsaktivitet. For å begynne å avgrense hvilke domene (r) står for denne grunnleggtrans kapasitet, ansatt vi to konstruksjoner. Den første konstruksjon hadde NTD trans domene (FUS-N) og den andre inneholdt den karboksyterminale RRM og RGGs (FUS-C) (figur 3A). Begge fragmenter vises aktiviteter som var sammenlignbare med full lengde FUS (figur 3B). For å vurdere arrangøren sammenheng avhengighet av disse aktivitetene, ansatt vi en annen reporter som inneholder minimale GAL4 bindingssteder og en TATA element, som ble sammenstilt inn i E1A promoter. Lignende, om enn som regel høyere, ble transaktivering kapasitet observert i sammenheng med denne promoteren som i den minimale promoter (figur 3C). Sterk transaktivering kapasiteten til GAL4-FUS-fusjoner ble også demonstrert i LNCaP-celler (Figur 3D).
(A) Chimeriske konstruksjoner av full-lengde FUS, N- eller C-fragmenter av FUS sammensmeltet til Gal4 DBD . TAD = trans domene; RRM = RNA anerkjennelse motiv; RGG = gjentakelser av et tripeptid inneholder arginin og to glycines. (B) trans aktivitet av FUS i PC3 prostatakreftceller. PC-3 celler i seks-brønns plater ble ko-transfektert med 50-100 ng Gal4 chimera, og en ug reportergenet PFR-LUC som inneholder GAL4 bindingssteder og en TATA element. GAL4 DBD alene tjente som en negativ kontroll. 2 ug PGL2 tomt plasmid ble innført i alle DNA-mikser. (C) Som (b), men reporter plasmid inneholdt Gal4-bindingsseter og TATA-element sammenstilte inn i E1A promoter. (D) Som (B), men med LNCaP i stedet for PC-3 celler. Kolonner = gjennomsnitt ± standardavvik. * P 0,05, n = 3.
FUS fremmer AR transkripsjonen aktivitet i prostatakreftceller
Etter å ha vist en trans kapasitet på FUS som var uavhengig av arrangøren i prostatakreftceller som beskrevet ovenfor, ved evaluert vi involvering av FUS spesielt i AR transkripsjonen aktivitet ved målgener. To forskjellige siRNAs rettet mot uavhengige regioner av beslektet mRNA ble ansatt for å tømme nivåene av FUS. AR aktivitet ble målt i kotransfiserte LNCaP celler ved hjelp av PSA (6,1 kb) -luciferase reporter gen konstruere. Dette reporter inneholder PSA promoter og forsterker regioner huse flere Ares der det gis induksjon av androgener [10] – [11] i en AR-avhengig måte [12] – [13]. I forhold til kontrollgruppen, ble R1881 induksjon av luciferaseaktivitet betydelig redusert ved uttømming av FUS uten å redusere nivåer av AR (figur 4A). For å underbygge disse funnene med en over-uttrykk tilnærming, vi co-transfektert AR uttrykk vektor, den ARR3-tk-LUC reporter plasmid, og ulike mengder av et plasmid at Hans-merket FUS uttrykk i HEK293 celler. Den ARR3-tk-LUC reporter inneholder seks Ares og er svært induserbar av androgener. Overekspresjon av FUS øket AR transkripsjonen aktivitet målt som luciferaseaktivitet fra ARR3-tk-LUC på en doseavhengig måte (figur 4B, øvre og midtre paneler). His-FUS ikke vesentlig endre den transkripsjonelle aktivitet ved PRL-tk-LUC, som kun inneholder tymidinkinase (tk) basal-promoteren (figur 4B, nedre panel).
(A) Nedbrytning av FUS korrelater med nedsatt AR aktivitet. Nivåer av FUS ble redusert i LNCaP celler ved hjelp sirnas rettet mot to forskjellige regioner i de respektive mRNA og deretter transfektert med en ug plasmid for PSA (6,1) -luciferase. 2 ug p-LUC tomt plasmid ble innført i alle siRNA /DNA-mikser. Mengder er per brønn i en 6-brønns plate. Celler ble behandlet med 10 nM R1881 i 24 timer. Western blot-analyse av de tilsvarende prøver viser nivåer av FUS, AR, og aktin. (B) ektopisk uttrykk for FUS forbedrer AR aktivitet. 293ft celler i en 48 brønners plate ble transfektert med 15 ng AR uttrykk plasmid, 620 ng ARR3-tk-luciferase reporter plasmid, 62 ng Renilla luciferase plasmid og indikerte mengder av Hans-FUS uttrykk plasmid. Luciferase-aktivitet ble normalisert med de fra Renilla luciferase som inneholder minimalt med TK-promoteren. Verdier over hvert svart strek representerer fold-induksjon R1881 etter normalisering (øvre panel). Western blot analyse av de tilsvarende prøvene viser nivåer av FUS, AR, og ACTIN (midtre panelet). UT: utransfekterte celler. Renilla luciferase-aktivitet av de samme prøver som er normalisert til totalt protein tjente som en kontroll spesifisitet (nedre panel). Kolonner = gjennomsnitt ± standardavvik. * P 0,05, n = 3.
For å finne ut om FUS øker uttrykket av endogene gener, nivåer av protein og mRNA kjente androgen-regulerte gener ble neste målt.
PSA
mRNA og mRNA fra fem andre androgen-induserbare gener ble betydelig redusert ved nedbryting av FUS (figur 5A).
TMPRSS2
mRNA ble redusert med bare en av de siRNAs, og androgen-trykt genet,
CAMK2N1
ble ikke påvirket av noen av siRNAs (data ikke vist). I samsvar med reduserte nivåer av mRNA, nivåer av PSA protein ble betydelig redusert i LNCaP celler ved nedbryting av FUS (figur 5B). For å avgjøre om FUS ble rekruttert til DNA med AR i respons til androgen, ble kromatin immunpresipitering (chip) analyse utført. Immunpresipitasjon av tverrbundet protein-DNA komplekser ved hjelp av et antistoff til FUS fulgt av forsterkning av ARE III av
PSA
genet avslørte at FUS ble rekruttert til dette ER (figur 5C). Til sammen tyder disse data på at FUS forbedrer AR-aktivitet, i det minste på noen målgener, i samsvar med den sterke indre transaktiveringsfunksjon tilskrives FUS (fig. 3).
(A) mRNA-nivåene av androgen regulerte gener. siRNA mediert uttømming av FUS minsker beslektet mRNA for PSA og flere andre AR målgener. QRT-PCR ble anvendt for å måle mRNA-nivåer. Verdier representerer prosenter av GAPDH-normalisert signaler til de som stammer fra mock-transfekterte LNCaP celler. Cellene ble behandlet i 24 timer etter transfeksjon siRNA. (B) PSA protein nivåer. LNCaP-celler ble behandlet i 8 timer med 10 nM R1881 eller kjøretøy følgende siRNA transfeksjon og Western blotting ble utført for å måle PSA-nivåer. (C) FUS er rekruttert til Enhancer ER III av
PSA
genet. LNCaP-celler ble behandlet med 10 nM R1881 i 6 timer. Brikken ble deretter påført og mål-DNA ble amplifisert ved qPCR. Verdiene representerer forholdet mellom signaler fra anti-FUS brikken til den for IgG-isotype-kontroll. Kolonner = gjennomsnitt ± standardavvik. * P 0,05, n = 3.
Nedbryting av FUS reduserer spredning av LNCaP celler
AR er avgjørende for vekst av LNCaP celler [14]. For å vurdere om nedsatt AR-aktivitet ved uttømming av FUS ville resultere i redusert spredning, utførte vi cellesyklusanalyse ved hjelp av flow cytometri. Som forventet, R1881 (0,1 nM) økte populasjonen av celler i S-fase (data ikke vist), som ble redusert med ~ 30% ved uttømming av FUS (figur 6A). Verdt å merke seg, dataene ble oppnådd fra forbigående transfeksjon av siRNA som resulterer i forholdsvis lite effektiv uttømming av FUS (figur 6B). Disse data implisere en pro-vekst funksjon av FUS på androgen-avhengig proliferasjon, som er forenlig med øket AR transkripsjonen aktivitet.
(A) Strømningscytometrisk kvantifisering av S-faseceller. siRNA-transfekterte LNCaP-celler ble behandlet med 0,1 nM R1881 i 48 timer. Celler ble merket med BrdU, farget med FITC-konjugert anti-BrdU-antistoff og DAPI, og underkastet flowcytometri. Grafen til høyre representerer kvantifisering S-fase celler som et forhold til de respektive kontrollene. * P 0,05, n = 3 (B) Nivåer av FUS-protein i celler behandlet med FUS siRNA. Western blot-analyse av nivåer av FUS og lasting kontroll aktin som svarer til de prøvene som har cellesyklusprofil er plottet i (A).
hormon-responsen av FUS uttrykk
Ekspresjon av noen AR ko-aktivatorer slik som steroid-reseptor-ko-aktivatorer (SRCs) moduleres av androgener og /eller AR [15] – [17] som en del av det som synes å være et nettverk av mate fremover og feed-back mekanismer. FUS uttrykk, på mRNA (Figur 7A, øvre panel) og proteinnivåer (figur 7A, midt panel), ble undertrykt
in vitro
i LNCaP celler etter 48 timer behandling med 10 nM R1881. Behandling av LNCaP-celler med 0,1 nM R1881 i tilsvarende tidsrom (48 timer), men hadde neglisjerbare virkninger på ekspresjonen av FUS uttrykk (figur 7A, nedre panel). Immunhistokjemi ble ansatt for å evaluere FUS genuttrykk i LNCaP xenografter. Tumorprøver ble fremstilt fra intakte (ikke-kastrerte) og kastrerte mus (10 dager etter kastrering). I samsvar med
in vitro
data med 10 nM R1881, kastrering resultert i økt uttrykk av FUS (figur 7B).
(A) FUS mRNA nivåer i respons til androgen behandling. Øvre panel: FUS uttrykk ble målt ved QRT-PCR i LNCaP celler behandlet med 10 nM R1881 for de angitte tidspunkter. Midtre panelet: western blot analyse av nivåer av FUS, Ptil og Actin proteiner på angitte tidspunkter. Nedre panel: Western blot analyse av nivåer av FUS-protein i LNCaP-celler som ble behandlet med 10 nM sammenlignet med 0,1 nM i 48 timer. Feilfelt = gjennomsnitt ± standardavvik. * P 0,05, n = 3. (B) FUS nivåer i respons på hormonell status
in vivo
. LNCaP xenografter høstet fra intakte (ikke-kastrerte) og kastrerte mus (10 dager etter kastrering) ble farget for FUS og AR proteiner. (C) FUS-nivåer i klinisk prostatakreft versus svarende godartet vev. Nivåene av FUS mRNA i kliniske prøver av prostata kreft kontra normal prostatavevet ble re-analysert fra tidligere innhentet datasettene ved hjelp Oncomine. Svarte striper indikerer studier der FUS ble betydelig overuttrykt i kreft versus godartet vev. * P. 0,05
FUS uttrykk har en tendens til å være høyere i prostata carcinom versus godartet vev
For å avgjøre om uttrykket av FUS endres i kreft i forhold til godartet prostatavevet, Oncomine database analyse ble utført ved hjelp av syv forskjellige kliniske kohorter. Uttrykk av FUS ble forhøyet i prostata carcinom forhold til godartet vev ved hjelp av data fra tre studier (figur 7C). Men i ytterligere fire studier av tilsvarende størrelse, var det ingen signifikant forskjell mellom nivåer av FUS mRNA i prostata carcinom sammenlignet med nivåene i benign prostatahyperplasi vev.
Diskusjoner
AR er viktig for alle faser av prostatakreft progresjon inkludert terminalen CRPC scenen. Underliggende denne rollen av AR er et dynamisk samspill med ulike co-aktivatorer og co-repressors. Omfanget av patofysiologisk relevante protein-protein interaksjon som involverer AR i prostata kreftceller er imidlertid ikke fullstendig kjent. Her viser vi for første gang at FUS samhandlet med AR endogent i prostatakreftceller og videre avdekket følgende: (1) FUS hadde egenverdi trans kapasitet i prostatakreftceller; (2) FUS forbedret AR-mediert transkripsjon; (3) reduksjon av FUS reduserte nivåer av ekspresjon av androgen-induserte gener; (4) FUS ble rekruttert til Ares i respons til androgen; (5) reduksjon av nivåer av FUS begrenset androgen-indusert spredning; (6) nivåer av FUS ble endret av androgen status
in vitro Hotell og
in vivo
; og (7) nivåer av FUS ble forhøyet i kliniske prøver av prostatakreft.
DNA-bindende domener (DBD) steroidreseptorer viser høy sekvens homologi (f.eks AR DBD har 77% og 57% sekvenslikhet med de av glukokortikoid-reseptor og østrogen reseptor, henholdsvis), og kan kommunisere med mange av de samme coactivators. Ved hjelp av rekombinante proteiner, er FUS blitt vist å interagere med de DBDS av retinoid X, østrogen, skjoldbruskkjertelen, og glukokortikoid-reseptorer, men AR ble ikke undersøkt [18]. Binding av FUS til DBDS av andre hormonreseptorer ikke forstyrrer DNA-bindende aktiviteter, selv om rollen til FUS i sine transkripsjons aktiviteter ikke ble vurdert [18].
Her viser vi at FUS havner sterke trans domener som var funksjonell i prostatakreftceller. Den C-terminale område som inneholder RRM og RGG motiver av EWS kan undertrykke den trans kapasiteten til NTD i kanin nyre-avledet RK-13-celler [19]. I motsetning til dette ble det observert her ingen undertrykkende funksjon av den C-terminale område når man sammenligner med full lengde FUS til FUS 1-273 fragmentet som mangler den C-terminale RRM og RGG motiver. Videre FUS 274-526 som inneholder RRM og RGG motiver, men ikke TAD, viste en sterk trans kapasitet. Lignende struktur-funksjon forholdet data involverer FUS ble tidligere rapportert ved bruk av humane embryonale nyre 293 celler [20]. Dermed er det funksjonelle transaktiveringsdomener i FUS andre enn de som finnes i dens NTD i det minste i prostata cancer og 293-celler. Avvik i litteraturen mellom FUS og EWS trans domener kan være cellespesifikk eller reflektere domene divergens (45% identitet, og 64% likhet) [5] mellom EWS (en 699 aa langt protein) og FUS (en 526 aa langt protein).
uttrykk av ulike co-regulatorer av AR er lydhør overfor androgener kanskje som en del av feed-back mekanismer [15] – [17]. Uttrykk for FUS er lydhør overfor hormon status i prostatakreftceller. På fysiologiske nivåer av androgen, ble FUS uttrykk rapportert å være betydelig redusert i LNCaP celler behandlet for 48-96 timer med 10 nM Mibolerone [21] som også er vist her med 10 nM R1881 (Fig. 7A). Men en lavere konsentrasjon av androgen, 0,1 nM R1881, ikke vesentlig endre nivåer av FUS
in vitro
, og
in vivo
kastrering nivåer av androgen var assosiert med økte nivåer av FUS. Dette uttrykket profilen minner om tidligere karakteriserte AR ko-aktivatorer som er beskjedent undertrykt av androgener [15] – [16]. Interessant, undertrykkelse av disse co-aktivatorer av androgener er med en langsommere kinetikk som ligner som av androgen-responsive uttrykk for FUS. Analyse av nivåer av FUS mRNA i ulike prostata og ikke-prostata kreft cellelinjer avdekket ikke systematiske forskjeller (figur S3). I samsvar med dette, gjorde Oncomine data mining av mikromatriser fra kliniske prøver av ulike solide tumortyper ikke vise betydelig opp eller ned-regulering FUS nivåer i prostatakreft i forhold til andre krefttyper (Fig S4). I motsetning til dette, sammenligning av mRNA data fra godartet prostata adenokarsinom versus vev avdekket opp regulering av FUS i tre uavhengige studier og ingen signifikant forskjell i fire andre. Ingen studier viste signifikant reduksjon av ekspresjon av FUS i prostata adenokarsinom versus godartet vev.
AR transkripsjonen aktivitet er nødvendig for opprettholdelse og vekst av prostata som danner bakgrunnen for androgen ablasjonsterapier for prostatakreft. I samsvar med FUS være en coactivator av AR og dens uttømming reduserende AR transkripsjonen aktivitet og androgen-avhengig vekst som vist her, blant de prominente fenotyper i FUS – /- mus er mannlig sterilitet, og mindre mannlige kjønnsorganer med tilsynelatende involusjon av noen av disse strukturer [22]. Disse fenotyper minner om AR – /- mus, eller mer raffinert domene- og celletype-spesifikke
AR
genet avbrudd [23] – [24]. Det er således mulig at uttømming av FUS avtar AR transkripsjonen aktivitet i disse klassiske androgen-avhengige vev i overensstemmelse med de data som er presentert her. Disse data er i motsetning til en tidligere rapport som FUS overekspresjon i LNCaP-celler, ved hjelp av en tetracyklin-induserbar system og etterfølgende behandling med 10 nM Mibolerone i fire dager, fører til fremveksten av sub-G1 /apoptotiske celler [21]. Intriguingly, ble det ikke sub-G1 /apoptotiske celler detektert i fravær av androgen, med eller uten FUS overekspresjon [21]. Derfor, i disse studiene FUS overekspresjon førte til en androgen-induserbar pro-apoptotisk effekt og endringer i uttrykket av cellesyklusproteiner [21].
Total, mens videre studier er nødvendig for å løse rollen FUS i prostata kreft sykdomsprogresjon, denne studien viste at: 1) FUS samhandler med AR; og 2) FUS øker transkripsjonen aktivitet av AR.
Materialer og metoder
Plasmider, cellekultur og trans
FUS ekspresjonsplasmider [20], p5 × Gal4UAS-TATA -luciferase [12], og AR ekspresjonsvektor, ARO, [25] har tidligere blitt beskrevet. PFR-LUC ble hentet fra Invitrogen, Carlsbad, CA, USA. AR reporter plasmid, PSA (6,1 kb) -luciferase inneholder promoter /enhancer regioner av PSA-genet og ble gitt av Dr. J.-T. Hsieh (University of Southwestern Medical Center, Dallas, TX). ARR3-tk-LUC inneholder tre kopier av androgen respons region av rotte
probasin
genet smeltet til basal tymidinkinase (TK) promoter [26].
LNCaP celler, hentet fra Dr. Leland WK Chung (Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute, CA, USA), ble dyrket i RMPI inneholder 5% føtalt bovint serum (FBS) og ble brukt ved passering 39-50. HEK293-celler ble opprettholdt i DMEM inneholdende 10% FBS. Med mindre annet er angitt, ble cellene inkubert i serum-fri, fenol-rød frie medier i 24-48 timer før behandling med angitte konsentrasjoner av R1881. Transfeksjon av LNCaP-celler ble utført ved anvendelse av lipofektamin 2000 (Invitrogen) for forsøk med sirnas eller lipofektamin (Invitrogen) for alle andre, som i henhold til produsentens instruksjoner ved 0,2 til 0,4% og 0,5% (v /v), respektivt. FUS (HSC.RNAI.N001170634.11.7, HSC.RNAI.N001170634.11.8) og kontroll sirnas (Invitrogen) ble brukt på 10-50 nM konsentrasjoner. HEK293-celler ble transfektert ved å bruke lipofektamin 2000 ved 0,4% v /v. Eksakte mengder av plasmider pr transfeksjon er angitt i Figur sagn.
Kvantitativ RT-PCR
Totalt RNA ble fremstilt ved anvendelse av RNeasy Mini Kit (Invitrogen). Total RNA (0,5 mikrogram) ble revers-transkribert via oligo-dT priming med Superscript III kit (Invitrogen). PCR ble utført ved anvendelse av genspesifikke primere, i nærvær av SYBR grønn Supermix (Invitrogen) ved anvendelse av ABI 7900 real-time PCR maskin (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Den termocykling protokollen var som følger: ved 95 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 sekunder og 55 ° C i 30 sek. Ct (terskel syklus nummer) verdiene ble konvertert til å bety uttrykk verdier i forhold til
GAPDH
nivåer i henhold til Pfaffl metoden. FUS primere [5] og alle andre primere er tidligere blitt beskrevet [27] – [28]
Immunofluorescence
Cellene ble vasket med PBS og fiksert i 1% paraformaldehyd i PBS i 30 min. . Celler ble permeabilisert i 0,1% ernæring X-100 i PBS to ganger i 5 min. Etter blokkering i 30 minutter i 2% BSA i PBS inneholdende 0,1% ernæring X-100, ble prøvene inkubert med de angitte antistoffer (1:50) i blokkeringsbuffer i 1 time. Cellene ble vasket med blokkeringsbuffer 4 ganger og inkubert med passende sekundære FITC eller rhodamin-konjugert IgG (1:100) i blokkeringsbuffer i 45 min. Etter 4 vaskinger med PBS inneholdende 0,1% ernæring X-100, ble DAPI-inneholdende monteringsløsning tilsatt. Lysbilder ble visualisert ved hjelp av å bruke Fluoview konfokal mikroskop (Olympus, Markham, ON, Canada).
Co-Immunoutfellingsunder og Chromatin immunoprecipitation analysen
LNCaP celler (2-3 × 10
6) ble sådd ut i 15 cm skåler med RPMI inneholdende 5% FBS. Etter 24 timer ble mediet forandret til serum-og fenolrødt-fritt RPMI og cellene ble inkubert i ytterligere 24 timer. Celler ble deretter behandlet med R1881 (10 nM) eller dens bærer (etanol) i 6 timer. Celler ble skylt med PBS før høsting og deretter lysert med 1 ml lyseringsbuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,8, 140 mM NaCl, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,5% Nonidet P-40) i nærvær av en cocktail av proteaseinhibitorer (Roche, Mississauga, ON, Canada). Lysatene ble ledet gjennom en 27-G nåler fem ganger og ble deretter forhåndserte med protein-A /G-agarosekuler (5% v /v) og en blanding av mus og kanin IgG (2 ug /ml hver) i 1 time. Den resulterende supernatant ble inkubert med de angitte spesifikke antistoffer inkludert AR 441, AR C19, og FUS (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA) ved en konsentrasjon på 1-2 ug /ml for 16-24 timer. Protein A /G-agarosekuler (5% v /v) ble deretter tilsatt og blandingen inkubert i ytterligere 3 timer. Kulene ble vasket med 1 ml lyseringsbuffer fem ganger og deretter resuspendert i 40-80 pl av standard SDS-prøvebuffer.
Chromatin immunoutfelling assay ble utført som beskrevet [27]. I korthet ble cellene behandlet med R1881 (10 nM) eller bærer i 6 timer og ble deretter fiksert med formaldehyd for å kryssbinde kromatin. Etter ultralydbehandling for å skjære kromatin /DNA, ble lysatene fremstilt og immunoutfelt med de angitte antistoffer. Mål-DNA ble målt ved hjelp av sanntids-PCR ved bruk av ABI 7900 real-time PCR maskin (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Verdiene ble normalisert mot signal fra den respektive IgG-kontroll.
Western blot-analyser
Prøver ble fylt i 10% Tris /glysin-baserte SDS-polyakrylamidgeler. Proteiner ble overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore, Billerica, MA, USA) i henhold til standard protokoller ved hjelp av Tris /glysin-baserte overføringsbuffer i Bio-Rad ubåt system (Mississauga, ON, Canada). Blotter ble analysert med følgende antistoffer: AR PG21 (1:1000) (Upstate Bioteknologi, Waltham, MA, USA); AR 441 (1:500), eller FUS 4H1 (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology Inc).
spredningsanalyse
LNCaP celler (5 × 10
5) i 10
