Abstract
Mål
Nylig har Next Generation Sequencing (NGS) begynt å fortrenge andre teknologier for genmutasjon testing som nå kreves for målrettet terapi. Men overføring av NGS teknologi til klinisk daglige praksis krever validering.
Metoder
Vi validert Ion Torrent AmpliSeq Colon og Lungekreft panel avhør 1850 hotspots i 22 gener ved hjelp av Ion Torrent Personal Genome Machine . Først brukte vi kommersielle referansestandarder som bærer mutasjoner ved definert allel frekvens (AF). Deretter 51 kolorektal adenokarsinomer (CRC) og 39 ikke-småcellet karsinom (NSCLC) ble retrospektivt analysert
Resultater
Følsomhet og nøyaktighet for påvisning av varianter på en AF . 4% var 100 % for kommersielle referansestandarder. Blant de 90 tilfellene ble 89 (98,9%) med hell sekvensert. Blant de 86 prøvene som NGS og referansetesten var både informativ, 83 viste samstemmige resultater mellom NGS og referanse test; dvs.
KRAS Hotell og
BRAF
for CRC og
EGFR
for NSCLC, med de 3 uharmoniske tilfeller hvert preget av en AF. 10%
konklusjoner
Totalt AmpliSeq kreft panel tykktarm /lunge var spesifikk og sensitiv for mutasjon analyse av genet paneler og kan bli innarbeidet i klinisk daglig praksis
Citation. D’Haene N, Le Mercier M, De Nève N, Blanchard O, Delaunoy M, El Housni H, et al. (2015) Klinisk validering av målrettet Next Generation Sequencing for Colon og lunge kreft. PLoS ONE 10 (9): e0138245. doi: 10,1371 /journal.pone.0138245
Redaktør: Aldo Scarpa, Universitetet i Verona, Italia
mottatt: 04.03.2015; Godkjent: 27 august 2015; Publisert: 14. september 2015
Copyright: © 2015 D’Haene et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av midler fra «Fonds Yvonne Boel» (Brussel, Belgia). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nylige fremskritt innen sekvenseringsteknologi har gjort det mulig helhetlig profilering av genetiske endringer i kreft [1]. Utviklingen av tyrosin kinase inhibitor behandlinger har gjort det viktig å teste kreftpasienter for klinisk signifikante genmutasjoner som påvirker nytten av behandlingen. Identifikasjon av kreftassosierte mutasjoner har blitt standard behandling for kreft behandling; eksempler på slike inkluderer
RAS
mutasjoner i metastatisk kolorektal karsinom eller
EGFR
mutasjoner i lungekreft. Rutinemessig
EGFR
somatisk mutasjon testing er nå anbefalt i Europa og USA for ikke-plateepitel ikke-småcellet karsinom (NSCLC) [2, 3]. Nye europeiske retningslinjer anbefaler sterkt at en bred dekning av eksoner 18-21 [2]. Videre nye NCCN Retningslinjer for NSCLC bifaller sterkt videre molekyl profilering med mål om å identifisere sjeldne driver mutasjoner som effektive legemidler kan allerede være tilgjengelig, eller å riktig informere pasientene om tilgjengeligheten av kliniske studier (NCCN retningslinjer http: //www.nccn .org /fagfolk /physician_gls /pdf /nscl.pdf). Inntil nylig, indikasjoner for standard-of-care molekylær testing i kolorektal karsinom inkludert testing for
KRAS
mutasjonsstatus som en prediktor for respons på anti-epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) agenter som cetuximab [4]. Nå retningslinjer anbefaler at i det minste, exon 2
KRAS
mutasjonsstatus bør bestemmes og når det er mulig, ikke-exon 2
KRAS Hotell og
NRAS
mutasjon statuts bør skal også bestemt (NCCN retningslinjer https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/colon.pdf). Dette understreker at antallet (eller grad) av biomarkører som vil bli må vurderes i klinisk daglig praksis i molekylær patologi er raskt økende. Dette krever gjennomføring av metoder sondering mutasjonsstatus av flere gener. Dessuten er denne økning i antall gener for å teste assosiert med en reduksjon i prøven størrelse. Patologen står overfor en ny utfordring: optimalisering av tilgjengelig svulstvev. Ettersom antallet klinisk signifikante genetiske varianter har økt, har klinisk testing utviklet seg, flytter fra enkle mutasjoner til multiplekse hotspot vurderinger i flere kreftgener. I de senere år har Next Generation Sequencing (NGS) begynt å fortrenge andre teknologier for genmutasjon testing [5-8]. Målrettet, amplikon-baserte NGS byr samtidig sekvensering av flere tusen kort DNA-sekvens i en massivt parallell måte, og kan gi en kostnadseffektiv metode for detektering av flere genetiske endringer med et minimum av DNA [5, 9, 10]. Videre kan NGS utføres ved hjelp av DNA fra formalinfiksert, parafininnstøpte (FFPE) vevsblokker [11-16]. Den kliniske anvendelse av NGS i kreft er deteksjon av klinisk handlings genetiske /genomiske forandringer som er kritiske for kreftbehandling [6]. Disse endringene kan være av diagnostisk, prognostisk, eller terapeutisk signifikans. Men overføring av NGS teknologi til klinisk daglige praksis krever validering.
I denne studien vi evaluert klinisk anvendelse av Ion Ampliseq Colon og Lungekreft panel på Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM-Life Technologies) å skjerme lunge og kolorektal kreft. Den Ion Ampliseq Colon og Lungekreft panel er en multipleks PCR-basert bibliotek forberedelse metode der 90 amplikonene som omfatter 1825 mutasjons hotspots av 22 gener relatert til tykktarm og lungekreft er selektivt forsterket [14, 15, 17, 18].
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Dette arbeidet har blitt godkjent av etisk komité av Erasme universitetssykehus (Brussel, Belgia-ref: P2013 /174). Ifølge belgisk lov av desember 2008 «Loi relative à l’oppnåelsen et à l’utnyttelsesgrad de Matériel kroppsbygning Humain DESTINE à des applikasjoner MEDIC Humaines ou à des finnene de recherche scientifique», ble det ikke skriftlig informert samtykke nødvendig. Den etiske komiteen har dermed gitt avkall behovet for skriftlig informert samtykke fra deltakeren.
Prøver utvalg
tumorprøver fra 90 pasienter ble retrospektivt analysert, inkludert 51 kolorektal adenokarsinomer (CRC) og 39 ikke liten celle lungekarsinom (NSCLC inkludert 37 adenokarsinomer og 2 plateepitel karsinom). Den mutasjonsstatus av
KRAS Hotell og
BRAF
i barnekonvensjonen og av
EGFR
i NSCLC hadde blitt vurdert tidligere i sammenheng med daglig praksis. Den primære prøvetyper ble enten kirurgiske reseksjoner (n = 57, 44 CRC og 13 NSCLC), biopsier (n = 23, 7 CRC og 16 NSCLC) eller celleblokker (n = 10, alle NSCLC). I tillegg brukte vi 12 ikke-neoplastiske prøver (6 lungene og 6 kolon) og 5 kommersielle FFPE- referanse standarder (Horizon Diagnostics, Cambridge, UK) bærer mutasjonen i
NRAS
,
KRAS
,
AKT Hotell og
EGFR
på 50% allel frekvens (AF) og en FFPE multiplex referansestandard (Horizon Diagnostics, Cambridge, UK) bærer 11 forskjellige mutasjoner på ulike definerte AF (0,9 til 24,4% ).
DNA-ekstraksjon
DNA ble ekstrahert fra FFPE tumorprøver ved hjelp av QIAamp FFPE vev kit (Qiagen, Antwerpen, Belgia). Kort sagt ble ufargede 10 um parafinsnitt snitt og inkubert ved 37 ° C i et tørkeskap over natten. Parafin ble fjernet ved å inkubere lysbildene i 2 påfølgende bad xylen og svulstvev var manuelt macrodissected, skrapt av raset med en skalpell og overført til et 1,5 ml tube. DNA ble deretter ekstrahert i henhold til produsentens instruksjoner. H E farget lysbilde fra samme blokk, tidligere vurdert av en patolog som sirklet tumorområdet og evaluert svulsten prosent, ble brukt som en guide for macrodissection. Prosentandelen av tumorceller for prøvene varierte 5-90%. Den oppnådde DNA ble kvantifisert ved hjelp av Qubit® fluorometer i kombinasjon med Qubit® dsDNA HS analysesett (Life Technologies, Gent, Belgia).
Påvisning av
KRAS
,
BRAF
og
EGFR
mutasjoner
Påvisning av
KRAS
,
BRAF Hotell og
EGFR
mutasjoner ble utført i sammenheng med kliniske daglig praksis i en ISO15189-sertifisert laboratorium ved kvantitativ PCR. Disse metodene er beskrevet i S1 fil. Sensitiviteten av disse analyser er variert mellom 3 og 20% av mutant DNA for KRAS testing, 10% av mutant DNA for BRAF testing, 0,5% av mutant DNA for EGFR p.L858R testing, 1% av mutant DNA for EGFR exon 19 sletting og 5% av mutant DNA for EGFR p.T790M testing, etter
Droplet digital PCR
Noen mutasjoner påvist ved NGS ble validert ved dråpe digital PCR (ddPCR), som beskrevet i S1 fil.
Neste generasjons sekvense
for bibliotek konstruksjon, 10 ng DNA (målt med Qubit® fluorometer i kombinasjon med Qubit® dsDNA HS assay kit) ble forsterket ved hjelp av kolon og lungekreft panel (Ampliseq ™, Life Technologies), et panel nylig validert [15] og Ion Ampliseq ™ HiFi Master Mix (Ion Ampliseq ™ Bibliotek kit 2.0). Et fragment bibliotek ble dermed generert for sekvense 1825 hotspot mutasjoner i 22 gener inkludert
akt1 (NM_05163)
,
ALK product: (
NM_004304)
,
BRAF (NM_004333)
,
CTNNB1 (NM_001904)
,
DDR2 (
NM_001014796),
EGFR (
NM_005228),
ErbB2 (
NM_004448),
ErbB4 (
NM_005235),
FBXW7 (
NM_033632),
FGFR1 (
NM_023110),
FGFR2 (
NM_022970),
FGFR3 (
NM_000142),
KRAS (
NM_033360),
MAP2K1 (
NM_002755),
MET (
NM_001127500),
NOTCH1 (
NM_017617),
NRAS (
NM_002524),
PIK3CA (
NM_006218),
PTEN (
NM_000314),
SMAD4 (
NM_005359),
STK11 (
NM_000455 ),
TP53 (
NM_000546). De amplikonene ble deretter fordøyd, strekkode og forsterket ved hjelp av Ion Ampliseq ™ Bibliotek kit 2,0 og Ion Xpress ™ strekkode adaptere kit (Life-teknologi) i henhold til produsentens instruksjoner. Biblioteket ble kvantifisert ved hjelp av Qubit® fluorometer og Qubit® dsDNA HS analysesett (Life-teknologi). 20:00 av hvert bibliotek var multiplex og clonally forsterket på Ion sfære ™ partikler (ISP) ved emulsjon PCR utføres på Ion One Touch 2 instrument med Ion PGM ™ mal OT2 200 Kit (Life-teknologi) i henhold til produsentens instruksjoner. Kvalitetskontroll ble utført ved hjelp av Ion Sphere ™ Quality Control Kit (Life Technologies) for å sikre at 10-30% av malen positiv ISP ble generert i emulsjonen PCR. Til slutt ble malen ISP beriket, lastet på en Ion 316 ™ eller på en Ion 318 ™ chip og sekvensert på en PGM ™ sequencer med Ion PGM ™ sekvense 200 kit v2 den i henhold til produsentens instruksjoner.
Data analyse
rådata ble analysert ved hjelp av torrent suite programvare v3.6.2 (Life-teknologi). Dekningen Analysen ble utført ved hjelp av dekningsanalyse plug-in v3.6. Tilfeller der antall kartlagt leser var mindre enn 100 000 og /eller gjennomsnittlig basen dekningen var 500X ble ansett som ikke informativ. Mutasjoner ble påvist ved hjelp av Variant Caller plug-in v3.6 med lav stringens innstillinger (Life Technologies). I varianten listen innhentet, ble hver mutasjon verifiseres i Integrative genomet viewer (IGV) fra Broad Institute (https://www.broadinstitute.org/igv/) [19]. Bare mutasjoner rapportert i den kosmiske (Sanger Institute Katalog av somatiske mutasjoner i Cancer) database (https://www.sanger.ac.uk/cosmic) ble tatt hensyn til og stille eller intronic mutasjoner ble ikke rapportert.
Statistiske analyser
De ikke-parametrisk Mann-Whitney og Kruskal-Wallis tester ble brukt for å sammenligne to eller flere, uavhengige grupper av talldata, henholdsvis. Dersom Kruskal-Wallis test var betydelig, ble post-hoc tester påføres med enten standard Dunn prosedyre for å sammenligne alle gruppe par eller tilpasning for å sammenligne hver eksperimentell tilstand til kontroll, unngå flere sammenligningseffekter (som beskrevet i Zar [20] )
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp Statistica (Statsoft, Tulsa, OK, USA) og p-verdier 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
NGS panel validering
Utførelsen av AmpliSeq Colon og Lung Cancer panel ble først evaluert med 12 ikke-neoplastiske vev (6 lungene og 6 kolon) og 6 kommersielle FFPE- referanse standarder (5 referansestandarder med en mutasjon ved 50% allel frekvens og en multiplex referansestandard frakte 11 forskjellige mutasjoner på ulike definerte allele frekvenser, varierende 0,9 til 24,4%).
Nei mutasjonen ble oppdaget i de 12 ikke-neoplastiske vev. De 5 mutasjoner som er tilstede i 5 referansestandarder på 50% allelisk frekvens ble alle riktig detektert ved NGS med AmpliSeq kolon og lungekreft panel (tabell 1). Blant de 11 mutasjoner som er tilstede i multipleks referansestandarden, alle mutasjoner med AF 3% ble korrekt detektert ved NGS med unntak av
KIT
mutasjon fordi dette genet ikke er inkludert i de 22 gener av panelet . For de 3 mutasjoner med AF 3%, bare én (
EGFR
sletting i ekson 19, AF = 2,0%) ble oppdaget av Variant Caller mens de to andre (
EGFR
p .L858R og p.T790M med AF = 2,7% og 0,9% henholdsvis) var ikke. Ved IGV inspeksjon, fant vi at disse variantene var tilstede, men med lav AF (25/1633 leser (1,5%) og 7/1613 leser (0,4%), henholdsvis). Andre mutasjoner i
CTNNB1
,
BRAF
,
PIK3CA Hotell og
EGFR
ble oppdaget av Variant Caller i referansestandarder (tabell 1).
KRAS Hotell og
NRAS
standarder er generert fra SW48 cellelinje som er rapportert å bære
CTNNB1
p.S33Y og
EGFR
p.G719S mutasjoner i COSMIC database (https://www.sanger.ac.uk/cosmic);
EGFR
standarder er generert fra RKO cellelinje som er rapportert å bære
BRAF
p.V600E og
PIK3CA
p.H1047R mutasjoner. Endelig er multiplex referansestandard generert fra RKO, SW48 og HCT16 cellelinjer, forklarer påvisning av
CTNNB1
p.S33Y mutasjon i denne kontrollen.
Presisjonen (reproduserbarhet og repeterbarhet) ble også vurdert å bruke 2 FFPE- tumorprøver og multiplex referansestandard. Prøvene ble analysert 5 ganger (5 bibliotek produksjons starter fra den samme DNA-ekstrakt) i tre forskjellige eksperimenter (tabell 2). Alle mutasjoner med en AF 4% ble konsekvent påvist. Imidlertid mutasjoner med en AF 3% ble detektert ved Variant Anroper i en eller flere, men ikke alle, av de fem replikater. Ved IGV inspeksjon, TP53 mutasjoner i strid oppdaget av Variant Caller var bare til stede i replikere hvor mutasjonen ble oppdaget av Variant Caller, men ikke for de andre gjentak (S1 Table). For referansestandard, ble de 3 EGFR-variantene oppdaget av IGV inspeksjon (men med en variant dekning 30x for de fleste av de replikat). Selv om disse var i strid oppdaget av Variant Caller (S1 Table)
Dessuten, noen mutasjoner ble verifisert ved ddPCR (tabell 2). Den p.H1047Q PIK3CA mutasjon, konsekvent oppdaget av NGS med en gjennomsnittlig AF på 10,8%, ble også oppdaget av ddPCR med AF på 9,1%. Derimot ble det p.R181C og p.H168Y TP53 mutasjoner i strid oppdaget av NGS ikke oppdaget av ddPCR. Gitt det faktum at mutasjoner oppdages med en AF 3% ikke ble validert ved ddPCR (for TP53-mutasjoner) eller inkonsekvent detektert (EGFR mutasjoner i referansestandard), og at den KRAS mutasjon med en forventet AF på 5% ble gående detektert med en AF varierende 4,6 til 5,9%, vi valgt en 4% AF terskel for mutasjon rapportering. Denne grensen er i samsvar med dataene som er rapportert i litteraturen for dette NGS plattformen [9, 16, 21].
Sekvense forestillinger
Et sett av 90 FFPE-prøver, inkludert 51 CRC og 39 NSCLC ble sekvensert ved NGS. Sekvense ytelse ble vurdert ut fra antall og fordeling av leser på tvers av målrettede regioner. Blant de 90 sekvensert tilfeller, 89 (98,9%) var vellykket (antall kartlagt leser 100 000 eller gjennomsnittlig basisdekning 500x). Den unsuccesfull Saken ble ansett som ikke informativ på grunn av en rekke leser 100 000 (40,072 leser) og gjennomsnittlig basisdekning 500x (1,2x). Blant de 89 vellykket sekvensert tilfeller ble en sak anses suboptimal (antall lyder: 69,564 og gjennomsnittlig basisdekning: 676x), men kvaliteten på sekvensering ble vurdert god nok for videre analyse. Alle de andre tilfellene (n = 88, 97,8%) hadde en rekke leser 100,000 og en gjennomsnittlig basisdekning 1000X. Gjennomsnittlig antall leser per prøvene var 232,832 og gjennomsnittlig basen dekning dybde var 2,296. I gjennomsnitt hadde 91,6% av amplikonene en dekning dybde på mer enn 500x (tabell 3). Det var ingen signifikant forskjell mellom CRC og NSCLC i form av antall lyder (p = 0,45), basen dekning dybde (p = 0,42) og prosentandel av amplikonene med en dekning dybde høyere enn 500x (p = 0,32) (Mann-Whitney test ). I 12 tilfeller er mengden av DNA oppnådd etter ekstraksjon var for lavt til å oppnå den nødvendige 10 ng for målrettet sekvensering (DNA-konsentrasjon i området fra 0,1 til 1.5ng /ul). Den sekvensering var vellykket for de 12 sakene, og ingen statistisk forskjell ble observert i form av antall lyder (p = 0,45), basen dekning dybde (p = 0,42) og i prosent av amplikonene med en dekning dybde på mer enn 500x ( p = 0,32) mellom prøver med mindre enn den som kreves 10 ng av DNA og prøver med nok DNA (Mann-Whitney-test, tabell 3). Dette tyder på at vellykket sekvensering kan fås fra så lite som 1 ng av DNA.
Vi deretter vurderes påvirkning av ulike primærprøvetyper på sekvense ytelse. Ingen statistisk forskjell ble observert i form av antall leser og basen dekning dybde mellom kirurgiske reseksjoner, biopsier og celleblokker (Kruskal-Wallis test, tabell 3). Men andelen amplikonene med en dekning dybde på mer enn 500X var signifikant høyere for celleblokker enn for biopsier (Kruskal-Wallis test p = 0,02 og post-hoc test p = 0,02).
amplikonene som viste en dekning under 250x ble ansett som ikke informativ. Denne terskelen ble allerede anvendt i litteraturen [22]. Noen av amplikonene av platen flere ganger mislyktes i å nå 250X (i mer enn 10% av prøvene). Disse amplikonene er oppført i tabell 4. amplikonene som gjentatte ganger mislyktes var de samme for de ulike primærprøvetyper (biopsier, celleblokker og kirurgisk reseksjon). For disse amplikonene, GC-innhold var signifikant høyere (gjennomsnittlig GC-innhold i de 7 amplikonene som gjentatte mislykkede var 69,6% mot 48% for de andre amplikonene, p = 0,00005), mens lengden var ikke signifikant forskjellig (den gjennomsnittlige lengden av 7 amplikonene som gjentatte ganger mislyktes var 108 bp mot 112 for de andre amplikonene).
Sammenligning med andre metoder
Et sett med 90 FFPE-prøver, inkludert 51 CRC og 39 NSCLC, var sekvensert ved NGS. Den mutasjonsstatus av
KRAS plakater (ekson 2) og
BRAF plakater (p.V600E) i CRC og
EGFR plakater (p.L858R og slettinger i ekson 19) i NSCLC hadde tidligere blitt vurdert av PCR i sammenheng med daglig praksis.
NSCLC.
Sekvense var vellykket for 38 av de 39 prøvene testet (97%), mens
EGFR
analyse med PCR-metoden var vellykket for bare 35 av de 39 prøvene (90%). 34 prøvene vellykket testing både av NGS og PCR, slik studie av samstemmighet.
Ved hjelp av NGS, mutasjoner i
EGFR
ble påvist i 4/38 tilfeller (10,5%). Tre av fire
EGFR
mutasjoner ble også påvist ved PCR. For en prøve som ble ansett som ikke informativ ved PCR, en p.L861Q
EGFR
mutasjonen ble oppdaget ved hjelp av NGS (S2 tabell). Dessuten, en p.L858R
EGFR
mutasjon ble påvist ved PCR og ved NGS. Men for denne prøven Variant Caller oppdaget mutasjon i et AF på 1,9%; gitt våre kriterier for å vurdere en variant som autentisk (se materiale og metoder) vi kunne ikke validere denne varianten.
Totalt samsvar mellom de to metoder for
EGFR
mutasjoner påvisning var av 33/34 (97%)
Videre ble mutasjoner i andre gener oppdaget av NGS:. mutasjoner i
KRAS
for 15/38 prøver (39,5%), mutasjoner i
TP53
for 15/38 pasienter (39,5%), mutasjoner i
STK11
for 3/38 pasienter (7,9%), mutasjon i
BRAF
for én prøve (2,6%), mutasjon i
PIK3CA
for en pasient (2,6%), mutasjon i
CTNNB1
for én prøve (2,6%). Mutasjons profiler av NSCLC ble oppsummert i figur 1 og i S2 tabell. Total, 29/38 prøver ble karakterisert ved hjelp av minst én mutasjon (76,3%).
Mutasjoner i forskjellige gener (rader) er angitt for hver prøve NSCLC (kolonner). En grå firkant indikerer at en mutasjon (rapportert i den kosmiske database (https://www.sanger.ac.uk/cosmic), unntatt polymorfisme) ble funnet med Ampliseq Colon og Lung panel i genet, mens en tom rute indikerer at ingen relevant mutasjon ble funnet for genet
de 2 KRAS-mutasjoner identifisert med en AF. 6% (ett p.G12S med en AF på 4%, en p.G12D med en AF 5%) ble verifisert av ddPCR. De 2 mutasjoner ble oppdaget av ddPCR med AF på 1,1 og 5,7%, henholdsvis (S2 tabell).
CRC.
Sequencing og PCR var vellykket for alle prøvene.
ved hjelp av NGS, mutasjoner i
KRAS
ble oppdaget i 30/51 tilfeller (58,8%), mens
KRAS
analyse med PCR-metoden oppdaget bare 23 tilfeller av mutasjoner i
KRAS
gen (45,1%). Fem av de 7 uharmoniske sakene ble preget av mutasjoner i kodon 59, 61 og 146 (eksoner 3 og 4) som ikke var dekket av PCR-test. Mutasjoner i kodon 61 og 146 ble testet og validert av ddPCR (S3 Table) For de 2 resterende tilfellene ikke oppdages av PCR,
KRAS
p.G12V mutasjonen ble oppdaget av NGS med AF på 8 og 9%, henholdsvis. Disse mutasjoner ble også påvist ved ddPCR med en AF på 12,5 og 9%, respektivt. I de 23 samstemmige tilfeller AF av
KRAS
mutasjoner var høyere enn 20% for 21 tilfeller; bare to saker ble preget av en AF på 9 og 10%, henholdsvis.
mutasjonsstatus av
BRAF
av PCR ble evaluert for 49 tilfeller (for 2 tilfeller var det ikke nok DNA) .
BRAF
p.V600E mutasjonen ble oppdaget for 5 pasienter (10,2%) med NGS eller PCR. . Videre en
BRAF
p.E586K mutasjonen ble oppdaget ved hjelp av NGS
Videre mutasjoner i andre gener ble oppdaget av NGS: mutasjoner i
NRAS
for 2/51 pasienter (3,9%), mutasjoner i
TP53
for 32/51 pasienter (62,7%), mutasjoner i
PIK3CA
for 10/51 pasienter (19,6%) og mutasjoner i
FBXW7
for 5/51 prøver (9,8%). De 2 NRAS mutasjoner og p.E545K, p.H1047 PIK3CA mutasjoner ble alle godkjent av ddPCR (S3 tabell).
mutasjons profiler av CRC ble oppsummert i figur 2 og S3 Table. Total, 45/51 prøver ble karakterisert ved hjelp av minst én mutasjon (88,2%).
Mutasjoner i forskjellige gener (rader) er angitt for hver prøve CRC (kolonner). En grå firkant indikerer at en mutasjon (rapportert i den kosmiske database (https://www.sanger.ac.uk/cosmic), unntatt polymorfisme) ble funnet med Ampliseq Colon og Lung panel i genet, mens en tom rute indikerer at ingen relevant mutasjon ble funnet for genet.
Diskusjoner
En stor fordel med NGS fremfor tradisjonelle mutasjon deteksjonsmetoder er dens evne til å skjerme flere mutasjoner i flere gener samtidig uten behov for å utføre flere sekvensielle tester. Flere studier har allerede godkjent bruk av NGS og dens overlegenhet på sikt av følsomhet, hastighet og pris i forhold til tradisjonelle metoder. [18, 23, 24] I vår egen erfaring, for tester som inkluderer mer enn to til tre forskjellige soner, er NGS billigere, raskere og krever mindre DNA enn det som ville være nødvendig for tradisjonelle metoder. Dette er av særlig viktighet for cytologiske prøver og små-vevsbiopsier hvor flere molekylære forandringer trenger å bli screenet, som for NSCLC prøvene f.eks [9, 18]. Faktisk krever NGS bare 10 ng for hele kolon og lungekreft panel mens tradisjonelle metoder kan kreve opp til 10 ng DNA for hver mutasjon testet.
presisjon (reproduserbarhet og repeterbarhet) analyse ved hjelp av referansestandarder med kjent AF tillatt oss å vise at alle mutasjoner med en AF 5% ble konsekvent påvist. Men mutasjoner med en AF 3% ble oppdaget inkonsekvent. I tillegg, når kliniske prøver ble analysert 5 ganger i 3 forskjellige forsøk ble Variant Anroper inconsistently oppdaget at mutasjoner med en AF 3% som ikke blir detektert av ddPCR, hvilket antyder at disse mutasjonene tilsvarer sekvense gjenstander, som ofte er observert med DNA hentet fra FFPE-prøver [25-27]. Den 4% grensen ble dermed valgt for mutasjon rapportering som en balanse mellom å maksimere følsomheten og minimere falske positive resultater på grunn av tekniske artefakter. Denne grensen er i samsvar med andre sensitivitet og spesifisitet data er rapportert i litteraturen for dette NGS plattformen [16, 21]. Ved hjelp av denne grensen, var ett tilfelle av NSCLC med en p.L858R EGFR mutasjon savnet. For dette utvalget Variant Caller oppdaget mutasjon i AF på 1,9%. Men gitt våre kriterier for å vurdere en variant som autentisk (AF 4% og variant dekning 30x), kunne vi ikke validere denne varianten. Det ble nylig foreslått at kjente klinisk relevante genvarianter som
EGFR
mutasjoner for NSCLC, skal rapporteres uavhengig av AF [28]. I vår nåværende klinisk praksis, når vi observerer en kjent klinisk relevant gen variant, men med en AF under sperregrensen, rapporterer vi at genet varianten er mistenkt, men ikke bekreftet, og at det ville være interessant å teste en annen prøve fra pasienten hvis det er tilgjengelig .
Avvik mellom NGS og tradisjonelle metoder ble observert for 2 CRC tilfeller med KRAS G12V mutasjoner, begge med en allel frekvens 10%. Denne lave AF kan forklare avvik på grunn terskelen til tradisjonelle metoden er varierende fra 3 til 20% av mutant DNA for KRAS testing. For disse 2 tilfeller,
KRAS
p.G12V mutasjoner ble validert av ddPCR.
En av utfordringene ved hjelp av NGS er å tolke de detekterte mutasjoner i biologisk sammenheng. Som allerede beskrevet [28], variantene kan grupperes i tre kategorier: i) de som kan ha en direkte innvirkning på pasientbehandling og anses praktisk; (Ii) de som kan ha biologisk relevans, men er ikke helt klart praktisk; og (iii) de som er av ukjent betydning. I denne studien, NGS analyse oppdaget mutasjoner (unntatt
EGFR
mutasjoner for NSCLC og enn
KRAS Hotell og
NRAS
for CRC) med potensielle kliniske konsekvenser for 4 pasienter med NSCLC (en
PIK3CA
mutasjon og 3
STK11
mutasjoner) og for 14 pasienter med CRC (10
PIK3CA
mutasjoner, 5
BRAF
mutasjoner-ett pasienten husing
PIK3CA Hotell og
BRAF
mutasjoner). Faktisk prekliniske data støtter argumentet om at NSCLC cellelinjer med
PIK3CA
eller
STK11 Hotell og
KRAS
mutasjon viser økt følsomhet for PIK3 hemmere eller MAPK og mTOR signale hemming henholdsvis [29] – [30]. Videre er en fase I doseeskalerings klinisk utprøving av en pan-klasse I PI3K hemmer hos pasienter med langtkomne solide tumorer-primært kolorektal, bryst, og foreløpig antitumor aktivitet lunge-viste [31]. På samme måte ble det tydelig anti-tumor aktivitet observert hos pasienter med
BRAF
muterte CRC som ble behandlet med en selektiv inhibitor mutant BRAF [32].
Konklusjonen er at den foreliggende studien validert den kliniske anvendelse av Ion Ampliseq Colon og lungekreft panel på Ion Torrent Personal Genome Machine for screening lunge og kolorektal kreft. Samlet er AmpliSeq kreft panel tykktarm /lunge var spesifikk og sensitiv nok for mutasjon analyse av genet paneler og kan bli innarbeidet i klinisk daglig praksis.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 fil. Utfyllende metoder:. Påvisning av KRAS, BRAF og EGFR mutasjoner og dråpe digital PCR
doi: 10,1371 /journal.pone.0138245.s001 plakater (docx)
S1 Table. Dekning analyse for variantene ikke konsekvent påvist i presisjon analysen
doi:. 10,1371 /journal.pone.0138245.s002 plakater (DOC)
S2 Table. Sekvense resultatene av NSCLC
doi:. 10,1371 /journal.pone.0138245.s003 plakater (docx)
S3 Table. Sekvense resultatene av CRC
doi:. 10,1371 /journal.pone.0138245.s004 plakater (docx)
