Abstract
Histone deacetylases (HDACs) er kjent for å spille en sentral rolle i regulering av flere cellulære egenskaper sammenvevd med den utvikling og progresjon av kreft. Nylig HDAC1 har blitt rapportert å være overuttrykt i hepatocellulær karsinom (HCC), men dens biologiske roller i hepatocarcinogenesis gjenstår å bli belyst. I denne studien demonstrerte vi overekspresjon av HDAC1 i en undergruppe av humane HCCs og leverkreft cellelinjer. HDAC1 inaktivering resulterte i regresjon av tumorcellevekst og aktiveringen av caspase-uavhengig autophagic celledød, via LC3B-II aktiveringsveien i Hep3B celler. I cellesyklusregulering, HDAC1 inaktive selektivt indusert både p21
WAF1 /Cip1 og P27
Kip1 uttrykk, og samtidig undertrykkes uttrykk for cyclin D1 og CDK2. Følgelig HDAC1 inaktivering førte til hypofosforylering av pRb i G1 /S overgang, og derved inaktiveres E2F /DP1 transkripsjonsaktivitet. I tillegg viste vi at HDAC1 undertrykker p21
WAF1 /Cip1 transkripsjonen aktivitet gjennom SP1-bindingsseter i p21
WAF1 /Cip1 promoter. Videre vedvarende undertrykkelse av HDAC1 dempes
in vitro
kolonidannelse og
in vivo
tumorvekst i en mus xenograft modell. Til sammen foreslår vi avvikende regulering av HDAC1 i HCC og dens epigenetisk regulering av gentranskripsjon av autofagi og cellesyklusen. Overekspresjon av HDAC1 kan spille en sentral rolle gjennom den systemiske reguleringen av mitotiske effektorer i utviklingen av HCC, noe som gir en spesielt relevant potensielt mål i kreftbehandling
Citation. Xie HJ, Noh JH, Kim JK, Jung KH , Eun JW, Bae HJ, et al. (2012) HDAC1 Inaktive induserer Mitotisk Defekten og caspase-Uavhengig autophagic celledød i leverkreft. PLoS ONE 7 (4): e34265. doi: 10,1371 /journal.pone.0034265
Redaktør: Andrei L. Gartel, University of Illinois i Chicago, USA
mottatt: 28 september 2011; Godkjent: 24 februar 2012; Publisert: 04.04.2012
Copyright: © 2012 Xie et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den koreanske Miljøverndepartementet via «The Eco-Technopia 21 prosjekt», og ved Public Welfare Sikkerhet program, gjennom National Research Foundation of Korea (NRF), finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (2010-0020764); og ved National Research Foundation of Korea (NRF) tilskudd til, finansiert av Korea regjeringen (MEST) (Grant No. 2011-0010705). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
leverkreft (HCC) er en primær malignitet av menneskelig leveren og en viktig årsak til sykelighet og dødelighet. Det er den syvende vanligste kreftformen i verden, og den tredje største årsaken til kreft-relaterte dødsfall [1]. I den molekylære mekanisme, er hepatocarcinogenesis akseptert som en flertrinnsprosess som kjennetegnes ved gradvis akkumulering og samspill av genetiske endringer som forårsaker unormal vekst og ondartet transformasjon av lever parenkymceller, etterfulgt av vaskulær invasjon og metastase [2]. De globale endringsskriftene til genekspresjon og signalveier involvert i HCC utvikling, ble undersøkt av mange forskere. Men mange gener som bidrar til disse endringene er fortsatt ikke preget tilstrekkelig.
Histone deacetylases (HDACs) er histone modifisering enzym familier som regulerer uttrykket og aktiviteten til en rekke proteiner som er involvert i både kreft initiering og progresjon, ved å fjerne acetylgruppene, og dermed gir kompakt kromatinstruktur [3]. HDACs omfatter en familie av 18 gener, som er gruppert i klassene I-IV, basert på homologi med de respektive gjær orthologues [4]. HDAC1, som en klasse jeg medlem deler en høy sekvens homologi med gjær Rpd3, er en global gen regulator og transcriptional co-repressor med histondeacetylase aktivitet [5]. Avvikende ekspresjon av HDAC1 vises vanlig i kreft i mage-tarmsystemet, og er forbundet med dedifferentiation, forbedret spredning, invasjon, fremskreden sykdom og dårlig prognose [4]. HCC pasienter med høy ekspresjon av HDAC1 viste økt forekomst av kreft celle invasjon inn i portvenen, dårligere histologisk differensiering, mer avanserte tumor-node-metastase (TNM) trinn og lav overlevelse [6]. Det ble også funnet at meget ekspresjon av HDAC1 i kreftceller er korrelert med kjemoterapi motstand og dårlig prognose i en serie av karsinomer [7],. Silence av HDAC1 med liten interferens RNA (siRNA) eller spesifikk inhibitor MS-275 i kreftceller kan enten rest ved G1-fasen av cellesyklusen eller ved G2 /M overgang, noe som resulterer i tap av mitotiske celler, celleveksthemming, og økning i andelen av apoptotiske celler [10], [11], [12]. I tillegg HDAC1 knockdown påvirket celle motilitet og invasjon ved å regulere E-cadherin uttrykk [13], [14], og ble også vist å fremkalle autophagy i HeLa-celler [15], og cellulær begynnende alderdom i humane fibroblastceller og prostatakreftceller [ ,,,0],16]. Selv om disse molekylære funksjonene HDAC1 ble godt dokumentert i en rekke tidligere resultater, har rollen HDAC1 i hepatocarcinogenesis ikke er klarlagt.
I denne studien, for å undersøke de biologiske roller HDAC1 der det gis onkogene potensial i menneskelig HCC, vurderte vi det avvikende regulering av HDAC1 i en undergruppe av menneskelige HCC vev og undersøkte reguleringsmekanismer HDAC1 i apoptose, autofagi og cellesyklus av HCC celler. I tillegg,
in vitro Kjøpe og
in vivo
eksperimentell tumorigent potensialet HDAC1 ble undersøkt ved hjelp av stabil HDAC1 knockdown cellelinjer.
Resultater
HDAC1 undertrykkelse årsaker mitotiske defekter i HCC celler
Vi har tidligere rapportert store transcriptomic endringer fra preneoplastiske lesjon til utilslørt menneskelige HCCs [17]. Fra primærmicroarray data, rekapitulert vi uttrykk for HDAC1 i en flertrinns histopatologiske prosessen, fra lav grad dysplastiske knuter (LGDNs) og høyverdig dysplastiske knuter (HGDNs) til primær HCC (Edmondson karakterer 1-3). Som vist i figur 1A, ble den relevante uttrykk for HDAC1 gradvis økt fra ikke-tumor til åpen kreft. For å bekrefte overekspresjon av HDAC1 i HCC, utførte vi immunoblot analyse av HDAC1 i en undergruppe av menneskelige HCCs. Som vist i figur 1B, HDAC1 viste seg å være sterkt overuttrykt i alle valgte HCC vev sammenlignet med de tilsvarende ikke-cancervev. Uttrykk for HDAC1 ble også analysert i ti ulike HCC cellelinjer (HepG2, Hep3B, PLC /PRF /5, SNU182, SNU354, SNU368, SNU387, SNU423, SNU449 og SNU475) og sammenlignet med tre selektive udødelig normale lever hepatocytter cellelinjer (thle -2, thle-3 og Miha). Som vist på figur 1C, endogen ekspresjon av HDAC1 i alle HCC cellelinjer viste relativt høyere enn for normale hepatocytter levercellelinjer.
(A) HDAC1 mRNA-ekspresjon viser gradvis økning fra pre-kreft til overt HCCs (* p 0,05). LGDN, lavgradig dysplastic nodule; HGDN, høyverdig dysplastic nodule; G1-3, Edmondson karakterer 1-3. (B) ti par av tumor (T) og de tilsvarende ikke-tumor (N) levervev ble oppnådd fra kirurgiske beregninger. Proteininnholdet av HDAC1 ble bestemt ved Western blot-analyse. (C) De endogene nivåene av HDAC1 i ti leverkreft og tre normale cellelinjer. Et antistoff mot GAPDH tjente som lasting kontroll. (D) Målrettet-avbrudd av HDAC1 forårsaker veksthemming av HCC cellelinjer. Celleviabilitet ble bestemt ved MTT-analyse i de angitte cellelinjer transfektert med enten rykke (si-Scr) eller HDAC1 siRNA (SI-HDAC1). Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD (* p 0,01). Alle målinger ble utført i tre eksemplarer, og hver Forsøket ble gjentatt minst to ganger.
Neste, for å forklare de biologiske konsekvensene av avvikende uttrykk for HDAC1 i hepatocarcinogenesis ble HDAC1 uttrykk opphevet av RNA-interferens mediert genet knock-down i fire forskjellige HCC cellelinjer; HepG2, Hep3B, SNU182 og SNU449 celler. Som vist i figur 1D, HDAC1 uttømming resulterte i signifikant reduksjon av tumorcellevekst (HepG2, Hep3B og SNU449). Denne anti-veksteffekt kan delvis forklares ved forstyrrelser i cellevekstregulering, slik som cellesyklus-stans, cellulær begynnende alderdom eller apoptose. Dermed vi neste utforsket effekten av HDAC1 undertrykkelse på cellesyklusregulering og cellulær apoptose.
Aberrant uttrykk for HDAC1 mediert spredning av leveren kreftceller ved å deregulere uttrykk for G1 /S cellesyklusproteiner
det faktum at undertrykkelsen av HDAC1 forårsaket regresjon av leverkreft cellevekst innebærer at HDAC1 er involvert i regulering av cellesyklusprogresjon. Derfor utførte vi cellesyklus analyse av PI-fargede celler i HDAC1 siRNA transfektanter ved hjelp av flowcytometri. HDAC1 uttømming førte til en økning i G1 fase med 17,0% med en samtidig reduksjon i S-fasen og G2 /M fase med 1,1% og 15,9%, henholdsvis sammenlignet med kontrollen (Si-Scr) etter 48 timer etter transfeksjon (figur 2A) . Det faktum at undertrykkelsen av HDAC1 forårsaket cellesyklusarrest i G1 fase innebærer at HDAC1 kan modulere aktivitet av cellesyklus regulerende komponenter. Derfor, undersøkte vi effekten av HDAC1 utarming på de regulatoriske proteinene i G1 /S cellesyklus overgang. I G1 /S overgang, har det vært godt etablert at negative cellesyklus regulatorer, for eksempel p15
INK4B, p16
INK4A, p18
INK4C, p19
INK4D, p21
WAF1 /Cip1 og p27
Kip1, er de viktigste modulatorer som undertrykke cyclin D1 /CDK4 og 6, eller cyclin E /CDK2 komplekser. Når disse cellesyklus modulatorer ble undersøkt, HDAC1 utarming selektivt forårsaket induksjon av p21
WAF1 /Cip1 og p27
Kip1 blant de negative regulatorer av cellesyklus overgang i Hep3B celler (figur 2B). Spesielt HDAC1 inaktivering ved hjelp HDAC1 siRNA ikke påvirke endogen uttrykk for HDAC2, og det forårsaket også akkumulering av acetylert histon H3 og H4 antyde HDAC1 uttømming spesifikk induksjon av p21
WAF1 /Cip1 og p27
Kip1 i Hep3B celler. I tillegg HDAC1 utarming også fremkalte samtidig undertrykkelse av CDK2 og cyclin D1 (figur 2C). Generelt kan den aktiverte CDK /cyclin-komplekset forårsake hyperfosforylering av pRb, som mister sin tumor suppressor aktivitet, og som gjør det mulig for økningen av E2F /DP1 transkripsjonen aktivitet. Dermed neste undersøkte vi om feilregulering av CDK og cykliner ved HDAC1 påvirker E2F /DP1 transkripsjonen aktivitet i Hep3B celler. Målrettet-forstyrrelse av HDAC1 fremkalte hypofosforylering av p130, en pRb isoform (RB2). Følgelig er noen av de nedstrøms målgener av E2F /DP1 transkripsjonsfaktor, slik som E2F4, CDC2 og cyklin A, ble signifikant nedregulert (figur 2D). Videre å validere disse resultatene og for å bekrefte transkripsjons nivåer av forskjellig uttrykte gener, vi utført kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) for
HDAC1
,
CDKN1A plakater (p21
WAF1 /Cip1),
CDKN1B plakater (p27
Kip1),
CDK2 Hotell og
CCND1 plakater (cyclin D1) gener. Som vist i figur 2E, HDAC1-utarmet Hep3B celler oppviste meget lav endogen HDAC1 uttrykk. Vi var også i stand til å bekrefte at både
CDKN1A plakater (p21
WAF1 /Cip1) og
CDKN1B plakater (p27
Kip1) var signifikant oppregulert ved HDAC1 inaktivering. Omvendt,
CDK2 Hotell og
CCND1
ble syntes å bli nedregulert ved HDAC1 inaktivering (figur 2E). Disse resultater antyder at eksklusiv regulering av cellesyklusproteiner, så som p21
WAF1 /Cip1, p27
Kip1, cyklin D1 og CDK2 ved HDAC1 overekspresjon utøver en meget potent mitogen stimulering i løpet av leverkreft progresjon.
Hep3B-celler ble transfektert med kontroll (Ingen), lipofektamin bare (Reag), 100 nmol /L egge siRNA (Si-Scr), eller 100 nmol /L av HDAC1-spesifikke siRNA (Si-HDAC1). (A) flowcytometrisk analyse ble utført med propidiumjodid (PI) farging på undertrykkelse av HDAC1 i Hep3B celler. To uavhengige eksperimenter med de samme resultatene ble utført. (B) For å finne den undertrykkelse av HDAC1 aktivitet, ble protein uttrykk for acetyl-histon H3 og H4 bestemt ved immunblotting. Protein uttrykk for negative regulatorer i G1 /S cellesyklus overgangen ble også vurdert i HDAC1-utarmet Hep3B celler. (C) Undertrykkelse av CDK og cykliner i G1 /S overgangen ved HDAC1 uttømming. (D) Effekter av HDAC1 uttømming på pRb og E2F /DP1 target genekspresjon. (E) Validering av mRNA-ekspresjon av HDAC1 regulerte gener ved kvantitativ real-time PCR-analyse. Den relative Ekspresjonsnivået av hvert gen ble normalisert til GAPDH-mRNA i samme prøve. Proteinekspresjon nivå ble kvantifisert ved ImageJ og normalisert til GAPDH. Verdiene er gitt som fold-endring i forhold til SI-Scr tansfectants. Den relative proteiner nivå er vist som søylediagrammer i høyre side av hver immunoblot (* p 0,05). Alle forsøk ble gjentatt tre ganger, med samme resultat. Et typisk resultat av tre utførte eksperimentene er vist.
Flere studier har vist at HDAC hemmere sterkt aktivere uttrykk for p21
WAF1 /Cip1 gjennom økt histone acetylering av p21
WAF1 /Cip1 promoter inkludert Sp1- bindingssetet ved å slippe repressor HDAC fra dets bindings [18], [19]. Videre var det noen bevis på at den endogene uttrykk for p21
WAF1 /Cip1 er regulert på transkripsjonsnivå ved rekruttering av HDAC1 til p21
WAF1 /Cip1 promoter-regionen [20], [21]. Våre nåværende resultater tyder også på at transkripsjonen undertrykkelse av p21
WAF1 /Cip1 gjennom HDAC1 bindende for sin promoter-regionen er dominerende i leveren kreftceller. For å validere denne implikasjonen, vi utførte kromatin immunoprecipitation analysen med kvantitativ PCR (Chip-qPCR) for angitte p21
WAF1 /Cip1 promoter regioner som hadde blitt analysert i vår forrige rapport (figur 3A) [22]. Vi fant at HDAC1 er sterkt forbundet med det proksimale området av p21
WAF1 /Cip1 promoter (området D i figur 3B). Dette resultatet ble ytterligere bekreftet ved spon qPCR-analyse med den samme promoter region av p21
WAF1 /Cip1 (region D), og som viste at acetylering status av histon H3 og /eller H4 er forbedret på det genomiske lokuset av oppheving av HDAC1 (figur 3C).
(A) En skjematisk av p21
WAF1 /Cip1 arrangøren viser regionene analysert av Chip-qPCR (svarte barer, A-D). (B) Foreningen av HDAC1 i p21
WAF1 /Cip1 promoter ble vurdert ved forsterkningen av hver region immunopresipitert med HDAC1. Mengden av DNA utfelt ved enten anti-HDAC1 eller kontroll IgG ble uttrykt som prosentandel av det totale inngangs genomisk DNA. Resultatet av fire uavhengige eksperimenter ble vist som gjennomsnitt ± SD. (C) Acetylations av histon H3 og H4 forbundet med den proksimale p21
WAF1 /Cip1 promoter ble økt ved å hemme sammenslutning av HDAC1. Hep3B celler ble transient transfektert med kontroll (Si-Scr) eller HDAC1 siRNA (Si-HDAC1) i 48 timer, og underkastet chip qPCR-analyse ved bruk av acetyl-histon H3 (anti-Ac-H3) eller H4 (anti-Ac- H4) antistoff eller kontroll IgG. Utfelt genomisk DNA ble forsterket for den proksimale arrangøren av p21
WAF1 /Cip1 locus (region D) ved real-time PCR. Mengden av utfelt DNA ble uttrykt som prosentandel av det totale inngangs genomisk DNA. Resultatet av tre uavhengige eksperimenter ble vist som gjennomsnitt ± SD. (D) HDAC1 regulerer p21
WAF1 /Cip1 transkripsjon via SP1-bindingsseter i p21
WAF /Cip1 promoter. De angitte konstruksjoner, pWWP, pWPdel-BstXI-, pWP101, pWPmt-Sp1-3, pWPmt-Sp1-5,6, pWPdel-Smal og SP1-Luc ble transient transfektert inn Hep3B celler, med 100 nmol /L egge siRNA (Si- SCR) eller 100 nmol /L HDAC1 spesifikk siRNA (Si-HDAC1), respektivt. Arrangøren aktivitet ble målt, og fold induksjon av HDAC1 uttømming ble beregnet. På venstre, ble vist ordningen med hver konstruksjon. Alle dataene ble vist som gjennomsnitt ± SD (n = 3) (* p 0,05).
Som beskrevet ovenfor, er det beriket SP1-avventende steder i regionen D. Så, vi neste undersøkt om HDAC1 undertrykker p21
WAF1 /Cip1 uttrykk via SP1-bindingsseter på p21
WAF1 /Cip1promoter. For å bekrefte dette, utførte vi reporteren analysen med reporter konstruksjoner er beskrevet i materialer og metoder. Som vist i figur 3D, oppviste HDAC1-manglende celler Hep3B (Si-HDAC1) økte luciferaseaktivitet i nærvær av Sp1-bindingsseter, i det minste inneholdende Sp1-3 til Sp1-6 (pWWP, pWPdel-BstXI og pWP101). Men p21
WAF1 /Cip1 transkripsjon aktivitet ble ikke utløst av mutante former av Sp1-5,6 (pWPmt-Sp1-5,6) i Si-HDAC1 celler. Interessant, p21
WAF1 /Cip1 transkripsjon ble fortsatt indusert av to mutante plasmider (dvs. pWPdel-Smal og SP1-Luc) som har to eller tre tandem gjentakelser av SP1-bindingsstedet nær TATA-boksen eller transkripsjon start stedet. Dette resultatet indikerer at den proksimale regionen rundt TATA-boksen av p21
WAF1 /Cip1 promoter forventes å være et viktig område som regulerer p21
WAF1 /Cip1 transkripsjon av HDAC1 i Hep3B celler.
Targeted- hemming av HDAC1 induserer autophagic celledød av Hep3B celler
Nyere studier antydet at behandling med histondeacetylase hemmere indusert ikke bare apoptotisk, men også autophagic celledød [23], [24], [25]. Det ble også funnet at knockdown av HDAC1 induserer autophagic celledød i HeLa-celler [15]. Således utforsket vi effektene av HDAC1 undertrykkelse av aktivering av celledød i Hep3B celler. Som vist i figur 4A, flowcytometrisk analyse for måling av Annexin V-fargede celler viste ingen signifikant induksjon av apoptotiske celler sammenlignet med kontrollen (Si-Scr). I tillegg var det HDAC1 uttømming påvirket ikke uttrykk for pro-apoptotiske komponenter, for eksempel AIF, Bax og Apaf-en, heller ikke hadde det føre til at caspase-3 og PARP-spaltning (figur 4B). Disse resultatene indikerte at overekspresjon av HDAC1 ikke hovedsakelig påvirker den apoptotiske signal i HCC.
(A) flowcytometrisk analyse ble gjennomført Annexin V-FITC merking og PI flekker på undertrykkelse av HDAC1. Dobbel farging med Annexin V-FITC og PI indikerer at mengden av celler i sent stadium av apoptose ble noe øket (øverst til høyre) i HDAC1-utarmet Hep3B celler. To uavhengige eksperimenter med de samme resultatene ble utført. (B) Både PARP og caspase 3 cleavage ikke ble påvist ved HDAC1 inhibering. Alle forsøk ble gjentatt tre ganger, med samme resultat.
neste, for å bestemme hvorvidt HDAC1 inaktivering fører til aktivering av autophagic celledød, undersøkte vi den mikroskopiske struktur av celler ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM) i HDAC1 -depleted Hep3B celler. Som forventet, ca 40-45% av HDAC1 siRNA-transfekterte celler utviklet autophagic vakuoler etter 72 timer på post-transfeksjon (figur 5A). Ved høyere forstørrelse, de fleste vakuoler inneholdt elektron tett materiale og degradert organeller. I motsetning til dette tak siRNA (Si-SCR) transfekterte-celler ble bare vacuolated, og færre celler som inneholder vakuoler i cytoplasma ble observert (høyre to paneler i figur 5A). Mikrotubul-assosiert protein en lettkjede 3 (LC3) er en vanlig markør for påvisning autophagy. LC3 er post-translasjonelt modifisert ved fjerning av den C-terminale ende for å frembringe LC3-I (~18 kDa), med fosfatidyletanolamin lipidering gir opphav til LC3-II (~16 kDa). Anrikning av membranbundet LC3-II i autophagosomes er en særegen fenomen av autophagic celledød og mengden av LC3-II korrelerer godt med antallet autophagosomes. I våre eksperimenter HDAC1 knockdown økt betydelig omdannelse av LC3B-I inn i LC3B-II så mye som ceramid, en potent induser autophgy, gjorde i Hep3B celler (Figur 5B). I motsetning til behandling med tre-metyladenin (3-MA, en spesifikk hemmer av autofagi) forhindret LC3B-I til LC3B-II konvertering av HDAC1 inaktivering i Hep3B celler (kolonne 5 i figur 5B). I tillegg immunfluorescens farging for LC3B avdekket at HDAC1 inaktiveinduserte ringformede flekker jevnt fordelt over hele cytoplasma, noe som indikerer en sammenheng mellom LC3 og autophagosomal membraner, og denne foreningen ble betydelig blokkert av tre-MA behandling (figur 5C). I samsvar med dette resultat ble redusert cellelevedyktighet forårsaket av inaktivering HDAC1 effektivt blokkert av 3-MA behandling (figur 5D). Disse resultater antyder at den HDAC1 knockdown aktiverer autophagic celledød i HCC celler. Interessant, fant vi også at HDAC1 inaktivering ikke påvirker Beclin-en som deltar i den tidlige fasen av autofagi, og at det fremmer kjernedannelse av autophagic vesikler, og rekruttering av proteiner fra cytosol [26]. Dette impliserte at HDAC1 inaktive indusert Beclin-en uavhengig autophay i Hep3B celler. For å kontrollere at HDAC1 inaktive formidler LC3B avhengig autophagic celledød, ble LC3B forstummet i Hep3B celler. Som vist på figur 5E, ble LC3B-II omdannelse indusert ved HDAC1 inaktive fullstendig blokkert av LC3B knockdown i Hep3B celler. Videre er redusert cellelevedyktighet ved HDAC1 inaktivering var signifikant gjenopprettet ved ko-transfeksjon av LC3B siRNA i Hep3B celler (figur 5F). Sammen er disse resultatene tyder på at HDAC1 inaktivering bidrar caspase-uavhengig celledød gjennom LC3 avhengig autophagy i Hep3B celler.
(A) Hep3B-celler ble transfektert med HDAC1 siRNA (100 nmol /L) i 72 timer, fiksert og anmeldt under transmisjonselektronmikroskop (TEM) (venstre to paneler). Med en høyere forstørrelse, ble autophagosomes inneholder elektron tett materiale og degradert organ observert i HDAC1 fattige celler. I kontrast, ble mye av intakte mitokondriene observert i Hep3B celler transfektert med si-Scr (høyre to paneler). Piler indikerer tilstedeværelse av autophagosomes. (B) Etter knockdown av HDAC1, LC3 konvertering (til LC3B-I LC3B-II) ble betydelig økt, mens nivået av Beclin en ikke endret. Parallell behandling med 5 mM 3-MA i 48 timer inhiberte LC3B-II aktivering indusert av HDAC1 knockdown. Hep3B celler ble også behandlet med 25 uM ceramid i 24 timer som en positiv kontroll for autophagy. Den densitometry Resultatet av immunoblotter ble vist som et søylediagram (gjennomsnitt ± SD). Relative protein uttrykk for HDAC1, LC3B-II og Beclin 1 ble normalisert med uttrykket nivået av kontroll (SI-Scr) (* p 0,05). (C) Ved immunofluorescensanalyse ble den cytosoliske ekspresjonen av LC3B indusert av HDAC1 knockdown, og som ble reversert ved behandling med 3-MA i Hep3B celler. (D) MTT-analyse viser at cellelevedyktigheten ble tilbakegang av HDAC1 knockdown i Hep3B celle. Antallet levedyktige celler ble øket i den parallelle behandling av 3-MA i 48 timer (* p 0,05). (F) MTT-analyse viser at cellene levedyktigheten ble gjenvunnet tilsynelatende i nærvær av Si-LC3B i HDAC1 knockdown Hep3B celler (* P 0,05, Si-HDAC1 + si-LC3B vs si-HDAC1).
Vedvarende-undertrykkelse av HDAC1 demper tumorigent potensialet Hep3B celler både
in vitro Hotell og
in vivo
Våre resultater viste at forbigående forstyrrelse av HDAC1 forårsaket
in vitro
autophagic celledød og vekst arrest i Hep3B celler. Derfor, for å undersøke om stabil undertrykkelse av HDAC1 fører til undertrykkelse av hepatocarcinogenesis, etablerte vi stabile HDAC1 knockdown cellelinjer (HDAC1KD # 1 og HDAC1KD # 2), og bekreftet inaktivering av HDAC1 ved å oppdage p21
WAF1 /Cip1 og p27
Kip1 induksjon og CDC2 reduksjon i etablerte cellelinjer (figur 6A). Vi så vurdert veksten av de etablerte cellelinjer. Som vist i figur 6B, HDAC1KD # 1 celler viste redusert vekst, sammenlignet med enten Mock-transfektant (Mock # 1) eller Hep3B foreldre celler (Ingen). Basert på dette resultat, ved utførte vi en kolonidannende analyse som beskrevet i materialer og metoder. Den klonal cellevekst ble betydelig svekket ved den vedvarende suppresjon av HDAC1 i HDAC1KD # 1-celler, sammenlignet med kontrollen (Mock # 1) (figur 6C, p 0,05). Til slutt, for å demonstrere at HDAC1 overekspresjon bidrar til hepatocarcinogenesis
in vivo
, vi injisert subkutant etablerte cellelinjer (f.eks HDAC1KD # 1 eller Mock # 1) i atymiske nakne mus. Den samlede tumorvekstraten og volumet ble betydelig redusert i HDAC1 manglende cellelinje (HDAC1KD # 1) sammenlignet med kontrollen (Mock # 1) (figur 6D, p 0,05). På 37 dager etter vaksinasjonen, tumormasse påvises i Mock gruppen. I motsetning til dette, i mus som ble injisert med HDAC1KD # 1, tumormasse var detekterbar bare ved 48 dager etter inokulasjon. Den gjennomsnittlige tumorvolumet ved offer var mye mindre i gruppen injisert med HDAC1KD # 1 enn Mock # 1 celler (figur 6E, p 0,05). I tillegg immunoblot analyse viste at uttrykket av p21
WAF1 /Cip1, p27
Kip1 og LC3B-II ble betydelig indusert i HDAC1 mangel xenograft vev (figur 6F, p 0,05). Disse resultatene antyder at undertrykkelsen av HDAC1 bidrar til hemming av hepatocarcinogenesis
in vivo
.
(A) bekreftelse på HDAC1 undertrykkelse ved å oppdage sine spesifikke mål gener i cellesyklusregulering. Et typisk resultat av tre uavhengige eksperimenter ble vist. Protein uttrykk ble kvantifisert og normalisert til GAPDH, og ble vist som relative forholdet til Mock. (B) Celle vekst på Hep3B-celler som stabilt uttrykker et omkastet shRNA (Mock 1 #) eller HDAC1 shRNA (HDAC1KD # 1) ble bestemt ved telling ved hver analyse indikerte tidspunkt. Resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± SD for tre eksperimenter. (C)
In vitro
kolonidannelse analysen. Celle kloner uttrykker egge shRNA (Mock # 1) eller HDAC1 shRNA (HDAC1 KD # 1) ble opprettholdt i 6-brønners plater. Grafen bar angir antall kolonier. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter (* p 0,05, HDAC1KD # 1 vs Mock 1 #). (D) Samlet tumorvekst av Hep3B celle xenografter. (E) Mus ble avlivet ved åtti dager etter injeksjonen, og tumorvekten ble målt. Resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± SD (* p 0,05). (F) På tidspunktet for offer, xenograft tumorer ble skåret ut, og totalt protein ekstrahert fra fem tilfeldig utvalgte mus i hver gruppe ble underkastet Western blot-analyse ved bruk av de angitte antistoffer. Protein uttrykk ble normalisert til de av GAPDH, og den relative uttrykket nivået av hvert protein ble avbildet som søylediagram (* p 0,05)
Diskusjon
Histone deacetylases (HDACs. ) representerer en familie av enzymer som samarbeider med histon acetyltransferase å modulere kromatinstruktur og transkripsjonen aktivitet via endringer i acetylering status av nukleosomale histoner [27]. Akkumulerende bevis har antydet at HDACs regulere både ekspresjon og aktivitet av en rekke proteiner som er involvert i både kreft initiering og progresjon [27], [28]. Nylig har flere studier vist at visse HDAC familier er avvikende uttrykt i svulster og har overflødig funksjon i kreftutvikling [4], [29]. Konsekvent, økende bevis foreslo avvikende uttrykk for HDAC1 i neoplastiske sykdommer, og viste at HDAC1 utarming forårsaker vekst og apoptose av visse humane kreftceller [10], [27], [29]. Imidlertid har rollen som HDAC1 i hepatocarcinogenesis ikke klarlagt ennå. I denne studien, har vi antydet at oppheving av avvikende ekspresjon av HDAC1 aktivert caspase-uavhengig autophagic celledød og arrestert G1 /S cellesyklus overgang i humane Hep3B celler, og følgelig undertrykkes den tumorcellevekst i xenograft dyremodell.
i en fersk studie av magekreft, HDAC1 uttrykk ble rapportert å være overuttrykt og hadde prognostisk verdi for magekreft [8]. Induksjon av HDAC1, 2, 3 ekspresjonsnivåer også implisert betydelig redusert pasientoverlevelse i kolorektal cancer [30]. Bidraget av HDAC1 uttrykket til malign transformasjon av normal leveren ble også undersøkt i en transgen musemodell [31]. Videre, en nylig rapport antydet at både HDAC1 og HDAC2 samvirkende regulert spredning av muse-embryo fibroblast (MEF) og hadde en vesentlig rolle for det hematopoetiske differensiering [32]. I leverkreft, ble høy HDAC1 uttrykk forbundet med cancer celle invasjon inn i portvenen, dårlig histologisk differensiering og lav pasientoverlevelse [6]. Dette ble også bekreftet av våre tidligere publiserte omfattende mRNA-baserte uttrykk microarray data [17]. Av disse uteligger gener assosiert med flertrinns hepatocarcinogenesis, rekapitulert vi HDAC1 uttrykk og viste svært overekspresjon i overt HCC. Immunoblotanalyse av HDAC1 i en undergruppe av humane HCC vev og leverkreft cellelinjer viste overekspresjon av HDAC1 i HCCs, og målrettede-avbrudd forårsaket HDAC1 veksthemming i ulike HCC cellelinjer (figur 1). Det akkumulerende bevis tyder på at HDAC1 overekspresjon vises spesielt vanlig i kreft i mage-tarmsystemet og er forbundet med dedifferentiation, forbedret spredning, invasjon, fremskreden sykdom og dårlig prognose. Imidlertid er det ikke gjort forsøk på å forklare de underliggende mekanismene som er ansvarlig for onkogene potensialet HDAC1 i HCC. Vi vurderte derfor effekter av HDAC1 inaktive på regulatoriske proteiner i cellevekst og død mekanisme.
Det har vært godt rapportert at HDAC-mediert undertrykkelse av gener kan føre til ukontrollert cellevekst, som HDACs undertrykke transkripsjon av cyclin -avhengige kinase hemmere (CDKIs), slik at videre spredning [27]. I osteosarcom og brystkreftceller, ble det rapportert at det knockdown av HDAC1 resulterte i cellesyklus-stans enten på G1 eller G2 /M fase overgang, og øker andelen av apoptotiske celler [10]. Våre resultater indikerer at avbrudd i HDAC1 indusert p21
WAF1 /Cip1 og p27
Kip1 uttrykk dermed impliserer at hemming av G1 /S overgang av cellesyklusen (figur 2B). I tillegg HDAC1 knockdown undertrykket ekspresjon av cyclin D1 og CDK2 (figur 2C).
