Abstract
DNA topoisomerase I (Top1) nivåer av flere menneskelige svulster er høyere enn normalt vev. Top1-inhibitorer er utbredt benyttet i behandlingen av konvensjonelle terapi-resistente eggstokkreft. Imidlertid kan pasienter utvikler resistens mot Top1 hemmere hindrer kjemoterapi suksess. I denne studien undersøkte vi mekanismene knyttet til utvikling av camptothecin (CPT) motstand i eggstokkreft og identifiserte evodiamine (EVO), et naturlig produkt med Top1 hemmende aktivitet som overvinner motstand. Korrelasjonene mellom Top1 nivåer, stadieinndeling og total overlevelse (OS) ble analysert. Effekten av EVO på CPT-resistent eggstokkreft ble evaluert
in vitro Hotell og
in vivo
. Top1 var assosiert med dårlig prognose i eggstokkreft (
p
= 0,024). EVO apoptose som ble påvist ved anvendelse av flow cytometri og terminal deoksynukleotidyl transferase dUTP Nick ende merking (TUNEL) assay. Tumorstørrelsen redusert betraktelig i EVO behandlingsgruppen sammenlignet med kontrollgruppen (
p
0,01) i en xenograft musemodell. Effekter av legemidler rettet mot Top1 for prognose og terapi i CPT-resistent eggstokkreft er forventet. EVO med Top1 kan utvikles som et antiproliferativt middel for å overvinne CPT motstand i eggstokkreft
Citation. Lee Y-C, Lee C-H, Tsai H-P, An H-W, Lee C-M, Wu J-C, et al. (2015) målretting av topoisomerase I for Prognoser og Therapeutics av camptothecin-Resistant eggstokkreft. PLoS ONE 10 (7): e0132579. doi: 10,1371 /journal.pone.0132579
Redaktør: Ming Tan, University of South Alabama, USA
mottatt: 21 januar 2015; Godkjent: 17 juni 2015; Publisert: 24.07.2015
Copyright: © 2015 Lee et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra National Science Council, Taiwan (NSC101-2320-B-038-023), Ministry of Health Welfare (MOHW104-TDU-B-212-113001) og Taipei Medical University-Shuang Ho Hospital (101TMU-SHH-10)
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft har ingen spesielle tegn eller symptomer, og er vanligvis diagnostisert på et avansert stadium, noe som gjør den til den mest dødelige gynekologisk kreft i den vestlige verden [1]. Standard kjemoterapi ved kreft i eggstokkene er ofte ledsaget av chemoresistance, som er en hovedhindring for vellykket behandling av kreft [2] og et kjemoterapeutisk alternativ andrelinje må anbefales. Stokastiske mutasjoner forårsaket av seleksjonstrykk, sekvensielle genetiske endringer indusert av spesialiserte stroma, og stemness av kreftceller ble foreslått for å forklare overlevelse av kjemoresistent celler under kjemoterapi [3]. Identifisering av molekylære biomarkører for å forutsi medikamentsensitivitet og motstand er avgjørende for pasienten prognoser.
Top1 genkopitallet, mRNA nivå, protein-nivå, og enzymaktivitet er rapportert å være assosiert med en dårlig prognose i kreftterapi [4 ]. Etablering rolle Top1 uttrykk i eggstokkreft kan legge til rette for mer effektive terapeutiske strategier. Notch sti og DNA topoisomerase I (Top1) hemmere har vært mye brukt i cisplatin-resistent eggstokkreft [5]. Imidlertid kan pasienter utvikle Top1 inhibitor motstand, og dermed hindre den suksess av behandlingen [6]. Bruk av kombinasjonsbehandling enn mono kjemoterapi fører til bedre resultater i eggstokkreft [7]. Kjemoterapi-indusert bivirkninger er lette etter ved hjelp av naturlige produkter som polyphyllin D [8], emodin [9] eller Rosa Roxburghii Tratt [10] mens antitumor aktivitet og immunmodulerende funksjoner er observert [11].
Aktivering av 5′-AMP-aktivert proteinkinase (AMPK) og etterfølgende undertrykkelse av mTOR aktivitet kan indusere beskyttende autophagy som overfører chemoresistance til tumorceller [12]. Derfor kan hemming av AMPK-forbundet autofagi forsterke antitumor effekter som utøves av kjemoterapeutika [4,13]. Den Top1 inhibitor camptothecin (CPT) kan indusere autofagi og redusere apoptose gjennom AMPK-TSC2-mTOR sti i human kolorektal kreft [14]. I tillegg er Topotecan rapportert å indusere cytobeskyttende autophagy i villtype p53-celler, men ikke i mutante p53 eller p53 knockout-celler [15]. Menneske A2780 eggstokkreft celler har blitt analysert for p53 mutasjoner og klassifisert i en p53 villtype cellelinje [16]; Derfor er denne cellelinjen forventes å lett utvikle chemoresistance gjennom AMPK-mediert autofagi. Denne virkningsmekanismen av Human A2780 cellelinje gir en potensiell strategi for å screene Top1 inhibitorer med lav-beskyttende autofagi aktivering aktivitet for behandling av kreft med villtype p53.
evodiamine (EVO), en quinilone alkaloid, opprinnelig isolert fra
Evodia rutaecarpa plakater (Juss.), er rapportert å ha mange fysiologiske funksjoner, inkludert vasorelaxation, antifedme, kreft, antibakteriell, antiviral og antiinflammatoriske effekter [17]. Syntetiske EVO-derivater er blitt utviklet som antitumor-midler [18]. Denne studien preget mekanismene forbundet med CPT-resistent eggstokkreft celler. Den naturprodukt EVO vises Top1 hemmende aktivitet som overvant CPT motstanden i eggstokkene A2780 celler. Våre resultater gir innsikt i økningen i resistens av CPT-resistente eggstokkreft celler etter bruk EVO-relaterte alkaloider.
Materialer og metoder
Material
(
S
) – (+) – CPT (C9911), evodiamine (E3531), natriumbikarbonat, dimetylsulfoksid (DMSO), 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT), propium jodid (PI), og Hochest 33342 ble anskaffet fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), trypsin, føtalt bovint serum (FBS), L-glutamin, og natrium pyruvat ble kjøpt fra Gibco-BRL (Grand Island, NY, USA). Et antistoff mot cyclin D1 ble kjøpt fra Ventana (Tucson, Arizona, USA). γ-H2A.X, AMPK, fosfor-AMPK, acetyl-CoA karboksylase (ACC), fosfor-ACC, og glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble kjøpt fra Cell Signaling (Danvers, MA, USA). Ki-67 kanin monoklonalt primært antistoff ble kjøpt skjema DAKO (MIB-5, Danmark). Comet Assay kit ble hentet fra Trevigen (Gaithersburg, MD, USA). Generelt Layer Medium (GLM) kapasitet brikken ble hentet fra Bio-Rad (Hercules, CA, USA). De lentivirale vektorer (LVS), luciferase (Luc) og grønt fluorescerende protein (GFP) vektorer, og bille luciferin ble oppnådd fra Promega (Madison, WI, USA). iView Universal DAB Detection kit ble hentet fra Ventana (Tucson, Arizona, USA). In Situ celledød Detection kit, POD, ble hentet fra Roche Applied Science (Penzberg, Tyskland)
Etikk
Menneskelig Subject Forskning:. Vev vi brukte ble hentet fra Taipei Medical University Hospital og Wan Fang Hospital etter Institutional Review Board godkjenning (WFH-IRB-99049). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne. Forsøksdyrutvalget: Alle mus studiene ble utført i samsvar med retningslinjer og forhåndsgodkjenning av Institutional Animal Care og bruk komité Taipei Medical University. IACUC godkjenning: LAC-99-0302. Dyrene ble avlives med isofluran.
Prøver
formalinfiksert parafin-embedded kirurgiske prøver ble brukt til immunhistokjemisk (IHC) farging. En histologisk diagnose ble utført i henhold til WHO klassifisering. Microarray besto av 180 eggstokkreft overflate epithelial karsinom: 61 serøs karsinom, 35 mucinkjertler karsinom, 42 endometrioid karsinom, og 42 clear-karsinomer. For denne studien, 2 patologer (Chi Lang Chen og Chii-Hong Lee) vist de histologiske snitt og utvalgte områder av representative tumorceller. En vev kjerne (1,5 mm i diameter) fra hver prøve ble brukt på gjenkjenning plattformer (Ventana Benchmark GX, Tucson, AZ, USA).
Cell kultur
A2780 ble dyrket i DMEM og CPT motstandsdyktig A2780
R2000 eggstokkreft celler [19] ble dyrket i RPMI 1640 som var inneholdt 10% FBS, 4 mM L-glutamin, 4,5 g /l glukose, 1 mM natriumpyruvat og 1,5 g /l natriumbikarbonat ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2.
Western blot-analyse
Proteinprøver prøver~~POS=HEADCOMP ble løst ved hjelp av natriumdodecylsulfat polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) og elektrooverført på polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner, som ble inkubert med et primært antistoff ved 4 ° C over natten, og deretter inkubert med et pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundære immunoglobulin G (IgG) antistoff. Immunreaktive bånd ble visualisert ved hjelp av forbedret chemiluminescence (ECL) reagenser fra PerkinElmer [20].
Celleviabilitet analysen
Cellene (10
4 celler /brønn) ble dyrket på en 96- brønns plate supplert med kulturmedium. Cellene ble behandlet eller ubehandlet i 48 timer, og en MTT-stamløsning (5 mg MTT /ml fosfat-bufret saltvann [PBS]) ble tilsatt til de dyrkede kulturer i 2 timer. Absorbansen ble målt ved anvendelse av et spektrofotometer ved 560 nm. En blank oppløsning inneholdende bare DMSO ble ansett lesestyre [21].
Strømningscytometri
Celler ble behandlet med testforbindelser i 0-24 timer, deretter trypsinert, pelletert og vasket i PBS . Celleprøver ble analysert ved hjelp av en FACS Canto-II-strømningscytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Annexin-V og propidiumjodid (PI) dobbel farging ble utført i henhold til produsentens protokoll [22].
Cell syklus analyse
Celler ble sådd med en tetthet på 2 × 10
5-celler /brønn på 6-brønners plater og synkroniseres ved plating i RPMI1640 medium i 24 timer for cellesyklusanalyse. Celler ble inkubert i 2 ml komplett RPMI1640 med 5 uM EVO og 10 uM CPT i 48 timer. Etter behandling ble cellene høstet med trypsin og vasket en gang med PBS. Før flowcytometri, ble cellene inkubert med 10 pg /ml RNase A ved 37 ° C i 15 min. Deretter ble cellene farget med 5 ug /ml av Hochest 33 342 og 20 pg /ml PI i 30 minutter ved romtemperatur i mørke [23]. Ti tusen celler per prøve ble analysert ved hjelp av en BD FACSCalibur flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Cellesyklus ble analysert ved hjelp av MODFIT programvare.
DNA avslapping analysen
Den hemmende effekten av EVO på supercoil DNA trådbrudd forårsaket av top1 ble evaluert. Plasmid DNA (200 ng) ble inkubert ved 37 ° C i 30 minutter i 20 ul reaksjonsløsning (40 mM Tris-acetat, 100 mM NaCl, 2,5 mM MgCl
2, og 0,1 mM EDTA; pH 7.5) i nærvær og fravær av en 0-5 uM inhibitor; 0,5 enheter Top1 enzym ble tilsatt for å starte reaksjonen i 30 minutter [24]. Top1-indusert DNA trådbrudd ble indikert ved konvertering av kovalent lukket formet dobbeltkjedet supercoil DNA til en avslappet form.
Comet assay (encellede gel elektroforese)
For å bestemme Graden av DNA-skade av celler, ble komet analyser utført i henhold til Trevigen CometAssay settprotokollen med små modifikasjoner. A2780
R2000 celler ble behandlet med Top1 hemmere i 1 time. Den endelige celletettheten var ca. 15 000 celler /mL. Cellesuspensjonen ble deretter blandet med lavt smeltepunkt agarose ved 37 ° C og deretter overført til glassplater. Objektglass ble underkastet elektroforese ved romtemperatur og deretter farget med SYBR grønn I i 5 min. På hvert bilde, ble cellekjerner undersøkt ved hjelp av en fluorescens mikroskop. Individuelle hale øyeblikk ble beregnet ved hjelp av bildeanalyse programvare (Comet Assay Software Project, https://www.casp.of.pl/). Tail øyeblikk ble beregnet i henhold til følgende formel: hale øyeblikk = hale-DNA% (prosentandel av DNA i halen) x hale lengde (lengden av halen) [24]. Gjennomsnitt ± standardfeil (SE) ble beregnet fra minst 50 celler for hver behandlingsgruppe. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av en 2-tailed uparede Student
t
test.
Computational molekylær docking
The X-ray krystallstrukturen av den menneskelige Top1-DNA komplekset ble hentet fra Protein data Bank (https://www.rcsb.org/pdb) for docking studier. Etter tilsetning av hydrogenatomer, ble det resulterende protein-DNA-kompleks struktur som brukes i tilkoblings simuleringer. Chem3D 6.0-programvare (CambridgeSoft, Cambridge, MA, USA) ble brukt for å bygge 3D-strukturen til EVO. Videre ble denne strukturen optimalisert på grunnlag av energi reduksjon, ved hjelp av MM2 kraftfeltet og et minimum root mean ble utført kvadrat (RMS) gradient på 0,05 dokking simuleringer ved hjelp av GOLD-programmet (versjon 3.1) på en Silicon Graphics Octane arbeidsstasjon med dobbel 270 MHz MIPS R12000 prosessorer. GOLD Programmet bruker en genetisk algoritme (GA) for å utføre fleksible ligand-docking simuleringer. De annealing parametere for hydrogen binding og van der Waals interaksjoner ble satt til 4,0 og 2,5 Å, henholdsvis. Den GoldScore fitness-funksjon ble brukt for å oppnå docking utgjør ved hjelp av eksterne energi WT = 1,375 [24].
Analyttforringelse analysen med en overflate plasmon resonans (SPR) sensor chip
Menneske (h) top1 ble koblet til den carboxylmethylated dekstran overflate av en GLM kapasitet brikke i henhold til protokollen som er beskrevet i Bio-Rad ProteOn One-Shot Kinetics Kit Instruction Manual med små modifikasjoner. Oppløsninger av EVO og plasmid-DNA ble fremstilt i en filtrert og avgasset reaksjonsbuffer. Alle bindingsforsøk ble utført ved 25 ° C i en konstant strømningshastighet på 100 mL /min av Top1 reaksjonsbuffer (40 mM Tris-acetat [pH 7,5], 2,5 mM MgCl
2, 100 mM NaCl, og 1 mM EDTA). Bindingsaffiniteten til proteinene ble evaluert ved hjelp av likevekt dissosiasjonskonstanter (KD). KD ble bestemt på basis av en steady-state affinitet montering analyse ved hjelp av resultatene fra ProteOn Behandling 2,0 (Bio-Rad) [24].
Fremstilling av luciferase (Luc) /grønt fluorescerende protein (GFP) A2780
R2000 celler
For
in vivo
studier, A2780
R2000 celler ble infisert med LVS inneholder Luc eller GFP som ble drevet av en cytomegalovirus promoter. Når transplantert inn i SCID-mus, Luc- eller GFP-merket A2780
R2000 celler kan overvåkes ved hjelp av
in vivo
bioluminesens imaging, og GFP-positive celler kan isoleres ved hjelp av en flyt sorter. I korthet, A2780
R2000-celler ble dyrket i 6-brønns plater, slik at de oppnådde 20% -40% konfluens. Et spesifikt titer av mediene høstet fra LV-produserende celler ble tilsatt til de dyrkede celler. Platene ble sentrifugert ved 1200 ×
g
i 1 time. Umiddelbart etter sentrifugering, 2 ml av den spesifikke cellemedium ble tilsatt til hver brønn, og platene ble plassert i en inkubator. To dager etter spinoculation, ble GFP uttrykk undersøkt under et fluorescens mikroskop. GFP-positive celler ble sortert ved hjelp nontransduced celler som en negativ kontroll [25].
Mouse modeller av merket svulster
A2780
R2000 celler (10
6) ble blandet med 500 ul DMEM og subkutant inokulert i fire-ukers gamle SCID-mus. Etter 7 dager ble musene gitt intraperitoneale (IP) injeksjoner EVO (100 mg /kg) (5 mus pr gruppe). Svulsten størrelse ble målt ved hjelp calipers hver 3. dag, og bioluminescence av svulstene ble fotografert ved hjelp av en ikke-invasiv IVIS-200 optisk system (Xenogen, Alameda, CA, USA) og Levende bilde Program (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA). Mus ble administrert intraperitonealt 300 ul PBS inneholdende 10 mg /ml av bille luciferin (Promega, Madison, WI, USA) før de mottok isofluran-mediert anestesi. Den kvantitative Bioluminescens intensitet (QBi) ble bestemt som den totale fotonet fluksen per sekund [26]. Ved slutten av eksperimentet ble musene avlivet og tumorene ble skåret ut og veiet. Alle mus forsøkene ble utført i samsvar med de retningslinjer og forhåndsgodkjenning av Institutional Animal Care og bruk komité Taipei Medical University. Alle operasjoner ble utført under isofluran-mediert anestesi, og arbeidet ble gjennomført for å redusere lidelse.
Immunohistocytochemistry
Immunohistocytochemical og terminal deoksynukleotidyltransferase dUTP nick slutten merking (TUNEL) analyser av eggstokkreft celler, høstet ved uke 4 ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Formalinfiksert vev ble innstøpt i parafin, kuttet i 4-mikrometer tykke seksjoner, og farget med hematoksylin og eosin (H E). Immunohistocytochemical farging ble utført ved hjelp av Ventana anticyclin D1 (SP4-R), anti-top1 (EPR5375), og Ki-67 kanin monoklonale primære antistoffer i en målestokk ULTRA lysbilde Stainer, og prøvene ble analysert ved hjelp av en iView Universal DAB Detection kit (Ventana Medical Systems). TUNEL farging ble utført ved hjelp av In Situ celledød Detection kit, POD (Roche Applied Science), som beskrevet tidligere [27,28]. Positive kjerner ble tellet i 500 celler, og antallet TUNEL- og cyklin D1-positive celler per høyeffekts-feltet ble tellet i 5 felt for hver kodet lysbilde. Expression ble analysert ved hjelp av GraphPad Prism programvare (versjon 5.0, GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
Statistisk analyse
Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Vi brukte to-tailed, ikke-parametrisk test (Mann-Whitney test) sammenlignet med Tumor score og Normal poengsum. Overlevelseskurver ble analysert ved bruk av log-rank Kaplan-Meier (KM) plott. En Cox regresjonsanalyse ble brukt til å teste den prognostiske betydningen av faktorer i univariate og multivariate modeller. En
p
verdien av 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. For sammenligning av de to sorteringsmetoder, student
t
test statistisk analyse ble utført.
Resultater
Overuttrykte Top1 er korrelert med avansert stadium og en dårlig prognose i eggstokkene kreft
Vi avgjort om top1 uttrykk i eggstokkreft ble assosiert med dårlig overlevelse. Vev fra 156 kreftpasienter på eggstokkene ble undersøkt ved hjelp av IHC farging. De antistoff spesifisitet og scoring kriterier ble definert og scoret fra nivå 0-3 (Fig 1A). Vi undersøkte 30 sett med matchede prøver fra primær eggstokk svulst og normalt vev. Top1 uttrykk var betydelig høyere i svulster enn i normalt vev, som evalueres ved hjelp av IHC (figur 1B,
p
0,001). Vi neste undersøkt forholdet mellom Top1 uttrykk nivåer og total overlevelse (OS), definert som pasienter med eggstokkreft kan dø direkte fra denne sykdommen eller av en uavhengig årsak. Totalt 110 av 156 pasienter hadde høye Top1 uttrykk nivåer (med score på 2+ eller 3+), og de resterende 46 pasientene hadde lave Top1 uttrykk nivåer (med score på 0 eller 1+). Videre pasienter med høye Top1 uttrykk nivåer hadde dårlig OS sammenlignet med pasienter med lave Top1 uttrykk nivåer. Vi undersøkte bidraget av top1 mRNA uttrykket til OS av eggstokkreft pasienter ved hjelp av KM plotter (https://kmplot.com/analysis/), som vurderte effekten av 22,277 gener på overlevelse av 1464 kreftpasienter på eggstokkene. En bakgrunn databasen ble etablert ved hjelp av genuttrykk data og overlevelse informasjon om 1436 pasienter som ble lastet ned fra Gene Expression Omnibus (GEO, Affymetrix HGU133A og HGU133 + 2 mikromatriser). OS analyse viste at høy Top1 mRNA uttrykk indikerte dårlig overlevelse av eggstokkreft pasienter (hazard ratio (HR): 1,28,
p
= 0,00062) (S1 fig). Resultatene viste at høy Top1 uttrykk var signifikant assosiert med dårlig prognose (log-rank
p
= 0,024, figur 1C). Videre χ
2-analyse mellom Top1 nivåer og clinicopathological kjennetegn ved pasientene viste at Top1 overekspresjon i eggstokkreft ble assosiert med International Federation of Gynekologer og Fødselsleger (FIGO) stadium (
p
0,044; S1 tabell). I univariate analysen, høy Top1 uttrykk (HR: 2,465; 95% konfidensintervall (CI): 1,139 til 5,335;
p =
0,022, Tabell 1), tumorstadium (HR: 8,843; 95% CI: 4,200 til 18,619;
p
0,0001, tabell 1) og tumor tilbakefall (HR: 0,453; 95% CI: 0,243 til 0,841;
p =
0,012, Tabell 1) var alle signifikant korrelert til OS. I tillegg ble Disease overlevelse (DFS), lengden av tiden etter behandling i løpet av hvilken ingen sykdom funnet, også forbundet med Top1 uttrykket (HR: 1,939; 95% CI: 1,018 til 3,695;
p = 0,044
), kreft stadium (HR: 5,669; 95% CI: 3,143 til 10,225;
p
0,0001), kjemoterapi (HR: 1,774; 95% CI: 0,999 til 3,151;
p =
0,050), og tilbakefall (HR: 7,775; 95% CI: 4,515 til 13,391;
p
0,0001). I multivariat analyse ble OS omvendt assosiert med Top1 uttrykk (HR: 2,290; 95% CI: 1,055 til 4,971;
p
= 0,036); tumorstadium (HR: 0,071; 95% CI: 0,030 til 0,167;
p
0,0001); og kjemoterapi (HR: 0.330, 95% KI: 0,151 til 0,721;
p =
0.005), og DFS var omvendt forbinder med Top1 uttrykk (HR: 2,223; 95% CI: 1,150 til 4,299;
p =
0,018), kreft stadium (HR: 0,150; 95% CI: 0,072 til 0,310;
p
0,001), og tilbakefall (HR: 7,685; 95% CI: 4,294 til 13,753;
p
0,001, Tabell 1). I denne studien, resultatene viste en sammenheng mellom Top1 uttrykk og kreft progresjon.
(A) Høyre, kvantifisering ifølge atom IHC Top1 uttrykk i eggstokkene svulster sammenlignet med sammenkoblede normalt vev. Venstre, representative bilder av IHC farging av celler som uttrykker Top1 i 30 sammenkoblede eksemplarer av svulst og normalt vev; Poengene ble beregnet ved anvendelse av formelen fargeintensitet x prosentandelen av fargede celler. (B) Resultater av 0-3 + indikerer Top1 nivåer i representative eggstokkreft vev. (C) Den Kaplan-Meier (KM) plotting av den totale overlevelse av 155 ovarian kreftpasienter, stratifisert på grunnlag av de Top1 nivåer. (D) KM tomt på sykdomsfri overlevelse av 155 pasienter med eggstokkreft, stratifisert på bakgrunn av top1 nivåer.
EVO binder seg til Top1 og hemmer dens DNA katalyse aktivitet
EVO er en top1 inhibitor som bindes til top1-DNA komplekse nettsteder. En dataassistert molekylær modell ble brukt til å evaluere dokking av EVO til top1. Selv om EVO besitter en ikke-plane struktur, kan denne forbindelsen intercalate i mellomrommene mellom DNA-baser for å danne π-π stabling (figur 2A). En SPR analyse ble utført for å bestemme bindingsaffiniteten og karakterisere ytterligere medikament-binding. Rekombinant hTOP1 ble kovalent bundet til overflaten av brikken, er kombinasjonen av pUC19 plasmid-DNA (1,0 ug /ml), og EVO (0-2 mm), bestemt på basis av strømningshastigheten for analytten gjennom sensorbrikken, og resonansenhet (RU) økte på en konsentrasjonsavhengig måte (figur 2B) med en KD verdi på 6,92 x 10
-22, beregnet ved hjelp av ProteOn Behandling 2,0. Strømningshastigheten av analytten uten pUC19-plasmid-DNA økte ikke RU. Resultatene står for binding av EVO til top1. For å bekrefte hTOP1-hemmende aktivitet av EVO videre, brukte vi hTOP1-indusert supercoil PBS (SK +) plasmid avslapping som analysesystem. Supercoil DNA migrerte raskere på agarosegeler enn fikk avslappet sirkulært DNA, slik som vist i kontrollgruppen (kolonnene 1 og 2). EVO hemmet hTOP1 katalytisk avslapning (spor 3-5, 1-5 mm). På en konsentrasjonsavhengig måte (figur 2C), mens det alene ikke føre til endring i DNA topologi (spor 6)
( A) dataassistert molekylær modellering av EVO docking til top1. (B) Overflate plasmonresonans sensorgram av samspillet mellom immobilisert rekombinant human (h) Top1 og EVO (0-2 mm). Dataene er representative for 3 uavhengige eksperimenter. (C) EVO forhindret DNA fra gjennomgår hTOP1-indusert konvertering av supercoil DNA til avslappet lukket sirkulært DNA. pUC19 (0,2 ug) plasmid-DNA ble inkubert ved 37 ° C i 30 minutter med hTOP1 i nærvær av EVO (0-5 uM).
EVO oppviste en cytotoksisk effekt på CPT-resistente A2780
R2000 celler
Vi har sammenlignet følsomheten til CPT-resistente celler (A2780
R2000) og foreldre celler (A2780) til kjemoterapeutiske stoffet, CPT, og EVO. A2780
R2000 celler viste større motstand mot de cytotoksiske effektene av CPT enn det utstilt ved A2780 celler (ca. 19 ganger høyt, figur 3A). EVO som utøves lignende cytotoksiske effekter på A2780 og A2780
R2000-celler med IC
50 verdier på 2,18 og 2,38 uM, henholdsvis (tabell 2). Disse dataene indikerer at CPT-resistent eggstokkreft celler er mer følsomme for EVO enn til CPT. Videre ble den apoptotiske fraksjon etter EVO og CPT behandling bestemt ved anvendelse av FITC /PI flowcytometri. EVO-utløst apoptose av A2780
R2000-celler skjedde i en tidsavhengig måte (20,24% ved 12 timer og 26,53% ved 24 timer og 37,89% ved 48 timer) (figur 3B). Behandling av levedyktige celler med Top1 hemmere kan skade deres DNA og lokke fram responsive reparasjonsmekanismer. En komet Analysen ble utført for å overvåke EVO-indusert DNA skade av A2780
R2000 celler. EVO behandling (25 pM) i 1 time produsert forsterket DNA-tailing, noe som indikerer økt elektroforetiske mobilitet av DNA-fragmenter. Omvendt kjerner av kontroll og CPT-behandlede celler presentert en kompakt rund område av fluorescens, med ingen DNA-hale å bli oppdaget. DNA pauser representert ved tailing område ble beregnet og sammenlignet (
p
0,05, kontra ubehandlede celler, ved hjelp av en student
t
test) (figur 3C og 3D). Fosforylering av histon H2A.X (γ-H2A.X), en biomarkør av DNA dobbelttrådbrudd, ble oppdaget i celler for ytterligere bekreftelse. En immunoblot-analyse ble utført for å bekrefte effekten av EVO på γ-H2A.X nivåer, og resultatene viste at EVO økte γ-H2A.X proteinnivåer i en konsentrasjonsavhengig måte etter 6 timers behandling. Sammenlignet med CPT behandling, 0-10 mikrometer EVO behandling økt betydelig de relative γ-H2A.X nivåer (Fig 3E). GAPDH med konstant uttrykk ble benyttet som en intern kontroll.
(A) Levedyktigheten av A2780 og A2780
R2000-celler ble undersøkt etter 48 timers behandling med camptothecin (CPT) eller EVO ved hjelp av et MTT-assay og IC
50 verdier ble bestemt. (B) FITC /PI flowcytometri av A2780
R2000-celler behandlet med EVO (10 uM) i 12-48 timer, sammenlignet med celler behandlet med CPT (10 pM) for 12-48h. (C). EVO-indusert DNA-skader i A2780
R2000 celler. Celler var ubehandlet eller behandlet med CPT og EVO (25 pM) i 1 time og ble deretter analysert ved anvendelse av en nøytral komet assay, som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Representative bilder (200 ×). (D) Histogram av halen øyeblikket plottet mot hver behandling tilstand.
p
verdier av sammenligninger (merket med *) var 0,05 som bestemmes ved hjelp av en 2-tailed Student
t
test. (E) y-H2A.X nivåer etter EVO eller CPT behandling i A2780
R2000 celler. Celler ble behandlet (0-10 uM) i 6 timer, og cellelysater ble immunoblottet med et antistoff mot γ-H2A.X. GAPDH med konstant uttrykk ble brukt som intern kontroll.
EVO indusert G
1 fase arrest og treghet av AMPK aktivering i CPT-resistente A2780
R2000 celler
Fordelingen av cellene i 3 faser (G
0 /G
1, S og G
2 /M) av cellesyklusen, ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri-analyse, og andelen for foreldre A2780 cellene var 64,84 ± 0,63, 27,27 ± 0,33 og 7,94 ± 0,36, respektivt. EVO behandling (5 uM i 48 timer) øket andelen av celler i G
2 /M fase (25,82 ± 1,38,
p
0,05). Andelen av A2780
R2000-celler i G
0 /G
1, S og G2 /M-fasene var 53,2 ± 0,36, 15,93 ± 0,66 og 28,20 ± 1,16, respektivt. EVO behandling økte andelen av celler i G
0 /G
en fase (58,7 ± 0,24,
p
0,01), mens ingen signifikant endring ble observert i den andel av celler i G
2 /M fase (30,53 ± 0,19) (figur 4A). EVO behandling indusert G
2 /M arrest i foreldre A2780 celler, mens det induserte tap av G
2 /M arrest og gevinst på G
1 arrest i CPT-resistente A2780
R2000 celler. Det ble observert en forskjell i cellesyklus distribusjon på CPT (S2 figur) og EVO behandlinger i CPT-resistente celler sammenlignet med sine foreldre celler. Legemiddelresistens ble rapportert å være assosiert med øket AMPK aktivitet. For å bestemme hvorvidt AMPK er aktivert i A2780
R2000-celler, ble cellene behandlet med CPT (10 uM) i 0-3 timer, og deretter Western blotting ble utført for å undersøke nivået av den aktive fosforylerte formen av AMPK (fosfo-Thr172 ). CPT behandling forbedrede fosfor-AMPK nivåene i A2780
R2000 celler (fig 4B, venstre). Videre ble fosfo-AMPK nivå etter EVO behandling for 0-3 h evaluert. EVO behandling ikke framprovosere vedvarende fosfor-AMPK nivåene (Fig 4B, til høyre), noe som tyder på at A2780
R2000 celler utøve ulike reaksjoner i forhold til foreldre A2780 celler etter CPT og EVO behandlinger. CPT og EVO behandlinger viste konsistente endringer i AMPK nedstrøms mål, fosfor-acetyl-CoA karboksylase (ACC) i A2780
R2000 celler (fig 4C).
(A) Cellesyklus distribusjoner av A2780 og A2780
R2000-celler etter behandling EVO (5 uM) i 48 timer. Endringene i cellesyklusen ble beregnet på grunnlag av flowcytometri resultater. Dataene er representanter for flere eksperimenter med lignende resultater. (B) Immun av AMPK fosforylering etter EVO (10 mm) behandling for 0-3 timer. (C) Immun av fosfor-ACC etter EVO (10 mm) behandling for 0-24 timer.
I tillegg eksponering av A2780
R2000 celler til 10 mm CPT eller EVO for 0- 24 timer produsert ulike reaksjoner i indusere fosforylering av c-Jun N-terminal kinase (JNK) (Thr183 /Tyr185) og ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK) 1/2 (Thr202 /Tyr204) med forskjellige timings. JNK fosforylering startet tre timer etter CPT behandling og vedvarende økt opp til 24 timer, mens EVO behandling ikke økte fosfo-JNK. Fosforylering av ERK startet seks timer etter CPT behandling og vedvarende økt til 24 timer, mens EVO behandling ikke øke fosfor-ERK. Verken CPT eller EVO behandling økt fosforylering av (Thr180 /Tyr182) av A2780
R2000 celler (S3 figur).
EVO hemmet celleproliferasjon i en xenograft mus modell
For
in vivo-studier
, A2780
R2000-celler som uttrykker Luc eller GFP-genene ble isolert og beriket med en strømningssorterer og deretter injisert inn i underhuden i SCID-mus (10
6 celler /mus) for å etablere eggstokkreft xenograft modell.
